本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中抗體分子的輕重鏈基因拷貝數(shù)的定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

動(dòng)物細(xì)胞已廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)各種生物活性物質(zhì)如疫苗、生長(zhǎng)因子、抗原、單克隆抗體等重組蛋白藥物，這些動(dòng)物細(xì)胞包括293細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、NS0細(xì)胞、CHO細(xì)胞等，其中應(yīng)用最為廣泛的當(dāng)屬CHO細(xì)胞。經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的僅重組表達(dá)的抗體藥物就達(dá)二十幾種，每年創(chuàng)造的市場(chǎng)價(jià)值高達(dá)幾百億美元。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，越來越多的外源蛋白如抗體通過轉(zhuǎn)基因的方法來獲得。

但是對(duì)于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞來說，外源基因是非內(nèi)源性的物質(zhì)，細(xì)胞在生長(zhǎng)繁殖過程中，會(huì)產(chǎn)生外源基因丟失的情況，這就是基因的遺傳穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中普遍存在著基因不穩(wěn)定的情況，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞來說，特別是對(duì)于制藥企業(yè)，細(xì)胞株的穩(wěn)定性顯得特別重要，其對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定起到了非常重要的作用(Barnes LM等Biotechnol.Bioeng.,2003,81(6):631-9.)。所以非常有必要從分子水平、從遺傳的角度來深入分析整合入細(xì)胞株的外源基因的穩(wěn)定性。目前，研究外源基因的穩(wěn)定性主要是通過檢測(cè)基因拷貝數(shù)的變化來分析的(Chusainow J等，Biotechnol.Bioeng.,2009,102(4):1182-1196.)。

基因拷貝數(shù)的檢測(cè)目前常用Southern Blotting(Kaneko Y等，Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,109(3):274–280)、Real-time PCR(Lattenmayer C等，J Biotechnol.2007,128(4):716-725)等方法，而采用Real-time PCR的方法可以省卻了Southern Blotting方法的繁瑣的步驟，可以簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確地檢測(cè)基因組的拷貝數(shù)。Real time PCR(實(shí)時(shí)PCR)又叫Q-PCR(quantitative PCR，定量PCR，實(shí)時(shí)定量PCR)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)(如SYBR-Green、TaqMan熒光探針等)，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過熒光強(qiáng)度的變化來對(duì)未知模板進(jìn) 行定量分析的方法。定量PCR按照熒光材料的不同，主要分為SYBR-Green定量PCR、TaqMan定量PCR方法。

TaqMan定量PCR方法是在原有一對(duì)引物的基礎(chǔ)之上，需要重新合成一條與正反向引物之間的靶序列相結(jié)合的特異性探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5'末端，而淬滅基團(tuán)則在3'末端。當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和猝滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。

在SYBR-Green為熒光染料的PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR-Green染料，SYBR-Green染料非特異性地?fù)饺腚p鏈DNA而非單鏈DNA后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)隨著PCR產(chǎn)物的增加而同步增加。與TaqMan定量PCR方法相比較，SYBR-Green定量PCR方法具有使用簡(jiǎn)單，DNA染料較便宜，成本較低，不需要加入特異性探針，而且適用于任何序列，通用性好。

在常規(guī)PCR擴(kuò)增過程中，產(chǎn)物的累積一般遵循指數(shù)擴(kuò)增的規(guī)律，N_n＝N₀(1+e)ⁿ(N_n為擴(kuò)增n輪后的產(chǎn)物量，N₀為起始模板量，e為擴(kuò)增效率，n為循環(huán)數(shù))。但到PCR擴(kuò)增后期，隨著產(chǎn)物的不斷增加，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)性增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終PCR產(chǎn)物量無法計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。而在定量PCR反應(yīng)中，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，在熒光信號(hào)呈指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，因此可以進(jìn)行定量分析。

在定量PCR過程中，每一個(gè)PCR樣品都有一個(gè)Ct閾值(Cycle threshold value)，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，一般而言，PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：Ct＝10×SDcycle(3-15)。大量數(shù)據(jù)研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。

利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。隨著近幾年基因組計(jì)劃的研究進(jìn)展，大量的物種基因組測(cè)序完成，包括人、小鼠、大鼠、中國倉鼠、食蟹猴、果蠅、線蟲、牛、斑馬魚、恒河猴、家蠶、雞、猩猩、山羊、獼猴、豬、馬、熊貓等生物，相繼闡明了基因組DNA的精確大小，則可推 算單位質(zhì)量的細(xì)胞基因組中所含的DNA分子數(shù)，依據(jù)樣品的起始拷貝數(shù)，進(jìn)而可以絕對(duì)定量細(xì)胞中的外源基因的拷貝數(shù)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中抗體分子重鏈基因拷貝數(shù)的定量檢測(cè)方法，該方法中采用的重鏈基因正向引物為JRTH3和重鏈基因反向引物為JRTH3R，其中

JRTH3的序列為：5'-CAAGCTGACCGTGGATAA-3'(如SEQ ID No.1所示)，

JRTH3R的序列為：5'-GACAGGCTCTTCTGAGTG-3'(如SEQ ID No.2所示)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的步驟：

a)合成針對(duì)抗體分子重鏈基因的特異性引物JHc-1F(如SEQ ID No.7所示的DNA分子)和JHc-1R(如SEQ ID No.8所示的DNA分子)，以完整抗體分子的重鏈DNA作為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，制備出帶有重鏈片段的質(zhì)粒DNA，從而制備重鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

b)以JRTH3和JRTH3R為正向引物和反向引物、以步驟a)中的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，計(jì)算質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)。從而建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

c)提取轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA和未轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA作為模板，以JRTH3和JRTH3R為正向引物和反向引物，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，同時(shí)用無菌超純水作為空白對(duì)照。定量PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線的試驗(yàn)，獲得Ct值，根據(jù)Ct值和步驟b)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算動(dòng)物細(xì)胞中抗體分子的重鏈基因拷貝數(shù)。

上述步驟b)和c)中，在進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)的總體積是30μl：SYBR Green PCR Mix(SYBR Green PCR混合液)15μl；正向引物(10μM)0.5μl；反向引物(10μM)0.5μl；DNA模板10μl；無菌超純水4μl。反應(yīng)條件為95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。

上述的抗體如可以是人源化抗TNF-α單克隆抗體，還可以是人-鼠嵌合性抗TNF-α單克隆抗體，還可以是抗HER2人源化單克隆抗體，還可以是抗VEGF人源化單克隆抗體等等。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞中抗體分子輕鏈基因拷貝數(shù)的定量檢測(cè)方法，該方法中采用的輕鏈基因正向引物為JRTL1F和輕鏈基因反向引物 JRTL1R，其中

JRTL1F的序列為：5'-GCAGTGGAAGGTGGATAA-3'(如SEQ ID No.3所示)，

JRTL1R的序列為：5'-TTTGCTCAGTGTCAGGGT-3'(如SEQ ID No.4所示)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的步驟：

a)合成針對(duì)抗體分子輕鏈基因的特異性引物JLc-1F(如SEQ ID No.5所示的DNA分子)和JLc-1R(如SEQ ID No.6所示的DNA分子)，以完整抗體分子的輕鏈DNA作為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，制備出帶有輕鏈片段的質(zhì)粒DNA，從而制備輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

b)以JRTL1F和JRTL1R為正向引物和反向引物、以步驟a)中的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，獲取Ct值和計(jì)算質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)，從而建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

c)提取轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA和未轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA作為模板，以JRTL1F和JRTL1R為正向引物和反向引物進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，同時(shí)用無菌超純水作為空白對(duì)照。定量PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線的試驗(yàn)，獲得Ct值，根據(jù)Ct值和步驟b)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算動(dòng)物細(xì)胞中抗體分子的輕鏈基因拷貝數(shù)。

上述步驟b)和c)中，在進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)的總體積是30μl：SYBR Green PCR Mix(SYBR Green PCR混合液)15μl；正向引物(10μM)0.5μl；反向引物(10μM)0.5μl；DNA模板10μl；無菌超純水4μl。反應(yīng)條件為95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。

上述的抗體如可以是人源化抗TNF-α單克隆抗體，還可以是人-鼠嵌合性抗TNF-α單克隆抗體，還可以是抗HER2人源化單克隆抗體，還可以是抗VEGF人源化單克隆抗體等。

本發(fā)明采用SYBR-Green Real-time PCR方法，可針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞中抗體分子的輕鏈基因和/或重鏈基因的拷貝數(shù)進(jìn)行單獨(dú)或同時(shí)測(cè)定，且是絕對(duì)定量，使得不同實(shí)驗(yàn)、不同細(xì)胞間的檢測(cè)結(jié)果可以相互比較；可用于研究抗體細(xì)胞株的穩(wěn)定性，篩選出穩(wěn)定的高表達(dá)的工程化細(xì)胞株。

本發(fā)明的方法檢測(cè)靈敏度高且線性范圍寬，最低可以檢測(cè)到細(xì)胞中僅含有1個(gè)基因拷貝數(shù)的樣品，最大可以達(dá)到1500以上個(gè)拷貝數(shù)；線性關(guān)系良好，R2均大于0.99，足以勝任樣品中基因拷貝數(shù)檢測(cè)的需要。

本發(fā)明的方法檢測(cè)的結(jié)果可靠，樣品的測(cè)定Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差＜0.3。

本發(fā)明的方法，PCR檢測(cè)反應(yīng)特異性高，定量PCR產(chǎn)物的熔解曲線僅有單一吸收峰，無非特異性擴(kuò)增信號(hào)。

本發(fā)明方法通用性好，可通過改變?cè)O(shè)計(jì)特異性引物，針對(duì)不同抗體分子的輕鏈基因或重鏈基因進(jìn)行基因拷貝數(shù)的檢測(cè)；可同時(shí)測(cè)定多種細(xì)胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)，這些細(xì)胞可以包括293細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、NS0細(xì)胞、CHO細(xì)胞、DG44細(xì)胞等。

本發(fā)明的方法可以高通量測(cè)定多個(gè)樣品的基因拷貝數(shù)。

本發(fā)明的方法采用SYBR-Green為熒光染料，具有簡(jiǎn)單便宜的優(yōu)點(diǎn)，在PCR反應(yīng)過程中可完全代替昂貴的TaqMan熒光探針，同時(shí)達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定基因拷貝數(shù)的目的。

附圖說明

圖1.輕鏈標(biāo)準(zhǔn)品的定量PCR擴(kuò)增曲線，其中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖中從左至右6條曲線是不同濃度的輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的定量PCR擴(kuò)增曲線。

圖2.輕鏈基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為定量PCR儀軟件自動(dòng)優(yōu)化得到的Ct值。

圖3.重鏈標(biāo)準(zhǔn)品的定量PCR擴(kuò)增曲線，其中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖中從左至右6條曲線是不同濃度的重鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的定量PCR擴(kuò)增曲線。

圖4.重鏈基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)為輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為定量PCR儀軟件自動(dòng)優(yōu)化得到的Ct值。

圖5.輕鏈基因的定量PCR擴(kuò)增曲線，其中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖中曲線為轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA和未轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA的定量PCR擴(kuò)增曲線，基線部分的曲線為無菌超純水的空白對(duì)照曲線。

圖6.輕鏈基因的定量PCR熔解曲線，其中橫坐標(biāo)為溫度；縱坐標(biāo)為熒光相對(duì)時(shí)間變化率。圖中曲線為轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA和未轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA的PCR熔解曲線，基線部分的曲線為無菌超純水的空白對(duì)照曲線。

圖7.重鏈基因的定量PCR擴(kuò)增曲線，其中橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖中曲線為轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA和未轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA的定量PCR擴(kuò)增曲線，基線部分的曲線為無菌超純水的空白對(duì)照曲線。

圖8.重鏈基因的定量PCR熔解曲線，其中橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光相對(duì)時(shí)間變化率。圖中曲線為轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物細(xì)胞株的基因組DNA和未轉(zhuǎn)染抗體分子的動(dòng)物 細(xì)胞株的基因組DNA的PCR熔解曲線，基線部分的曲線為無菌超純水的空白對(duì)照曲線。

具體實(shí)施方式

下面以具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，其中動(dòng)物細(xì)胞選最常用的CHO細(xì)胞作為示例，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。

本發(fā)明的技術(shù)方案包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA和基因組DNA的制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、輕重鏈基因的拷貝數(shù)的檢測(cè)、基因拷貝數(shù)的計(jì)算等過程。本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下實(shí)驗(yàn)流程：

實(shí)施例1輕鏈基因拷貝數(shù)的定量PCR檢測(cè)方法

1.1、質(zhì)粒DNA的獲得：

a)設(shè)計(jì)針對(duì)輕鏈基因的特異性引物：特異性正向引物JLc1F的核苷酸序列為：5'-AGGACAGTGGCTGCACCA-3'(如SEQ ID No.5所示)；特異性反向引物JLc1R的核苷酸序列為：5'-TCAACACTCTCCTCTGTT-3'(如SEQ ID No.6所示)。

b)獲得輕鏈pLc質(zhì)粒菌種：以完整抗體分子的輕鏈DNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，獲得抗體分子輕鏈Lc片段，然后插入到p simple-19T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得了含有抗體輕鏈基因的pLc質(zhì)粒菌種。

c)經(jīng)序列測(cè)定，獲得了分子大小為3016bp的pLc質(zhì)粒菌種。

1.2、輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將含有抗體輕鏈基因的pLc質(zhì)粒菌種，接種于10ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，取1ml培養(yǎng)液，10000rpm離心棄上清，菌液沉淀按Axygen公司“質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒”說明書中的方法抽提質(zhì)粒DNA，最終溶于60ml無菌超純水中。獲得的質(zhì)粒用核酸蛋白分析儀(Bio-Rad公司的SmartSpec^TM Plus Spectrophotometer)檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量。用無菌超純水將輕鏈質(zhì)粒稀釋至0.002ng/ml，然后采用5倍倍比稀釋，制備得到輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取10μl步驟1.2中制備的輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品作為DNA模板、正向引物JRTL1F 0.5μl(濃度10μM)、正反引物JRTL1R 0.5μl(濃度10μM)、SYBR Green PCR Mix 15μl(購自Applied Biosystems公司)以及無菌超純水4μl，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。其中采用的實(shí)時(shí)定量PCR儀為Bio-Rad公司的iQ5Real-Time PCR Detection System系統(tǒng)。定量PCR 反應(yīng)條件為95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。輕鏈的定量PCR擴(kuò)增曲線見圖1。

其中，正向引物JRTL1F的核苷酸序列為：5'-GCAGTGGAAGGTGGATAA-3'(如SEQ ID No.3所示)；反向引物JRTL1R的核苷酸序列為：5'-TTTGCTCAGTGTCAGGGT-3'(如SEQ ID No.4所示)。

根據(jù)以下公式計(jì)算質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)：

計(jì)算得到：1ng輕鏈質(zhì)粒含有的拷貝數(shù)為3.02×10⁸個(gè)，則輕鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)分別為：6.04×10⁶,1.21×10⁶,2.42×10⁵,4.83×10⁴,9.66×10³,1.93×10³。

以定量PCR儀軟件(儀器自帶的iQ5分析軟件)自動(dòng)優(yōu)化得到的Ct值作為縱坐標(biāo)，起始模板中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，PCR的擴(kuò)增效率91.6％，二者的曲線相關(guān)系數(shù)R2＝0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y＝-3.542X+38.459。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低檢測(cè)的拷貝數(shù)是1.93×10³，即1.93×10³/3723＝0.5，也就是能檢測(cè)到1個(gè)拷貝數(shù)，能夠勝任轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中檢測(cè)的需要；最大檢測(cè)的拷貝數(shù)是6.04×10⁶，即6.04×10⁶/3723＝1622，也就是最大能檢測(cè)到1622個(gè)拷貝數(shù)。

1.4、細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇一支轉(zhuǎn)染了抗體輕鏈基因的CHO細(xì)胞株，接種于無血清培養(yǎng)基中，37℃、5％CO₂搖床中培養(yǎng)，待細(xì)胞活力達(dá)到98％以上時(shí)，分別接種于另外二瓶搖瓶中，一瓶加入MTX(氨甲喋呤，Methotrexate)，另一瓶不另加入MTX，在相同條件下開始連續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第10、20、30、35、40代時(shí)，取細(xì)胞并離心，沉淀保存于-80℃冰箱。

1.5、細(xì)胞基因組DNA的制備

按照QIAmp DNA Mini Kit說明書，分別提取未轉(zhuǎn)染抗體分子的CHO細(xì)胞和轉(zhuǎn)染抗體輕鏈基因的CHO細(xì)胞株的基因組DNA，溶于無菌超純水中。獲得的基因組DNA用核酸蛋白分析儀(Bio-Rad公司的SmartSpec^TM Plus Spectrophotometer)檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，并分別用無菌超純水將基因組DNA稀釋至1ng/μl，作為定量PCR檢測(cè)的陰性對(duì)照和樣品，并用無菌超純水作為空白對(duì)照。

1.6、輕鏈基因的拷貝數(shù)的檢測(cè)：

各取基因組DNA 10μl作為PCR反應(yīng)模板，JRTL1F/JRTL1R分別為正反引物，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，并進(jìn)行熔解曲線的試驗(yàn)，結(jié)果見圖5和6。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下，定量PCR反應(yīng)的條件為95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。

熔解曲線的試驗(yàn)設(shè)置：針對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物從55℃開始，以0.5℃為間隔進(jìn)行升溫，至95℃，每個(gè)溫度保持30s并檢測(cè)熒光。反應(yīng)結(jié)束后，iQ5分析軟件自動(dòng)以熒光隨溫度變化率與溫度的關(guān)系繪圖，得到熔解曲線。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品基因組DNA，陰性對(duì)照基因組DNA和空白對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，供試樣品設(shè)多個(gè)復(fù)孔進(jìn)行平行檢測(cè)(≥3)。

從圖5、6中可以看出，樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)良好，而水和未轉(zhuǎn)染抗體分子的CHO細(xì)胞的基因組沒有任何擴(kuò)增，所有的樣品都僅在81℃左右出現(xiàn)一個(gè)單一吸收峰，說明PCR擴(kuò)增的特異性好。同時(shí)，所有的樣品的Ct值均落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍以內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后，分析軟件會(huì)自動(dòng)優(yōu)化得到Ct值，根據(jù)Ct值與輕鏈基因拷貝數(shù)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算10ng樣品DNA所含輕鏈基因拷貝數(shù)。

1.7、基因拷貝數(shù)的計(jì)算：

根據(jù)CHO基因組研究的進(jìn)展，CHO細(xì)胞的基因組大小為2.45Gb(Xu X等，Nat Biotechnol,2011,29(8):735-741)，則10ng的基因組DNA含有3723個(gè)DNA分子，可以按下列公式計(jì)算轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞基因組中含有的輕鏈基因拷貝數(shù)：

上述公式中，動(dòng)物細(xì)胞CHO細(xì)胞的基因組大小為2.45Gb。

結(jié)果見表1。為獲得更高的抗體表達(dá)，轉(zhuǎn)染抗體的CHO細(xì)胞需要經(jīng)過長(zhǎng)期的連續(xù)的MTX增加壓力的過程，這過程實(shí)際上就是抗體輕鏈基因在細(xì)胞基因組中拷貝數(shù)增加的過程(Cacciatore JJ等.Biotechnology Advances.2010,(28):673–681)。表1中也可看出采用MTX增加壓力的輕鏈基因拷貝數(shù)大于不加入MTX的輕鏈基因拷貝數(shù)。

Bubner B et.al.認(rèn)為，一般單個(gè)樣品的擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.3，就可以 認(rèn)為能夠精確測(cè)定樣品的拷貝數(shù)(Bubner B等，Plant Cell Rep.2004,23(5):263-271)。由表1可見，本方法每個(gè)樣品擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.3，說明我們的方法是準(zhǔn)確可靠的。

表1定量PCR檢測(cè)輕鏈基因的拷貝數(shù)

注：表1中，+MTX是指搖瓶中加入MTX，-MTX是指搖瓶中不加入MTX。

實(shí)施例2重鏈基因拷貝數(shù)的檢測(cè)方法

2.1、質(zhì)粒DNA的獲得：

a)設(shè)計(jì)針對(duì)重鏈基因的正向引物JHc-1F和反向引物JHc-1R：

正向引物JHc-1F的核苷酸序列為：5'-ATGCTAGCAAGCTTCCATGGGCGTCGACAAAGGGACCATCTGTGT-3'(如SEQ ID No.7所示)；反向引物JHc-1R的核苷酸序列為：5'-TAGGTACCTCGAGTCATTTACCAGGAGACAG-3'(如SEQ ID No.8所示)。

b)獲得重鏈pHc質(zhì)粒菌種

以完整抗體分子的重鏈DNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，獲得抗體分子重鏈Hc片段，然后插入到T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重鏈pLc質(zhì)粒菌種。

c)經(jīng)序列測(cè)定，獲得了分子大小為3718bp的pHc質(zhì)粒菌種。

2.2、重鏈標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的制備

將含有抗體重鏈基因的pHc質(zhì)粒菌種，接種于10ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，取1ml培養(yǎng)液，10000rpm離心棄上清，菌液沉淀按按Axygen公司“質(zhì)粒 DNA小量抽提試劑盒”說明書的方法抽提質(zhì)粒DNA，最終溶于60ml無菌超純水中。獲得的質(zhì)粒用核酸蛋白分析儀(Bio-Rad公司的SmartSpec^TM Plus Spectrophotometer)檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量。用無菌超純水將輕鏈質(zhì)粒稀釋至0.002ng/ml，然后采用5倍倍比稀釋，制備得到重鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取10μl制備的重鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品作為DNA模板，正反引物JRTH3F 0.5μl(濃度10μM)和反向引物JRTH3R 0.5μl(濃度10μM)、SYBR Green PCR Mix 15μl(購自Applied Biosystems公司)以及無菌超純水4μl，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。其中采用的實(shí)時(shí)定量PCR儀為Bio-Rad公司的iQ5Real-Time PCR Detection System系統(tǒng)。定量PCR反應(yīng)條件為95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。重鏈的定量PCR擴(kuò)增曲線見圖3。

其中，正向引物JRTH3F的核苷酸序列為：5'-CAAGCTGACCGTGGATAA-3'(如SEQ ID No.1所示)；反向引物JRTH3R的核苷酸序列為：5'-GACAGGCTCTTCTGAGTG-3'(如SEQ ID No.2所示)。

根據(jù)以下公式計(jì)算質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)：

計(jì)算得到：1ng重鏈質(zhì)粒含有的拷貝數(shù)為2.45×10⁸個(gè)，則重鏈質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)分別為：4.90×10⁶,9.80×10⁵,1.96×10⁵,3.92×10⁴,7.84×10³,1.57×10³。

以定量PCR儀軟件(儀器自帶的iQ5分析軟件)自動(dòng)優(yōu)化得到的Ct值作為縱坐標(biāo)，起始模板中標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，PCR的擴(kuò)增效率91.8％，二者的曲線相關(guān)系數(shù)R2＝1.000，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y＝-3.536X+38.388。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低檢測(cè)的拷貝數(shù)是1.57×10³，即1.57×10³/3723＝0.42，也就是能檢測(cè)到一個(gè)拷貝數(shù)，能夠勝任轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中檢測(cè)的需要；最大檢測(cè)的拷貝數(shù)是4.96×10⁶，即4.96×10⁶/3723＝1332，也就是最大能檢測(cè)到1332拷貝數(shù)?？紤]到輕鏈重鏈的一致性和檢測(cè)曲線的良好線性，應(yīng)該也可以測(cè)到1500拷貝數(shù)的，但如果嚴(yán)格地來描述，可以用1300為最大檢測(cè)值。

2.4、細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇一支轉(zhuǎn)染了抗體重鏈基因的CHO細(xì)胞株，接種于無血清培養(yǎng)基中，37℃，5％CO₂搖床中培養(yǎng)，待細(xì)胞活力達(dá)到98％以上時(shí)，分別接種于另外二瓶搖瓶中，一瓶加入MTX (氨甲喋呤，amethopterin)，另一瓶不另加入MTX，在相同條件下開始連續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第10、20、30、35、40代時(shí)，取細(xì)胞并離心，沉淀保存于-80℃冰箱。

2.5、細(xì)胞基因組DNA的制備

按照QIAmp DNA Mini Kit說明書，分別提取未轉(zhuǎn)染抗體分子的CHO細(xì)胞和轉(zhuǎn)染抗體輕鏈基因的CHO細(xì)胞株的基因組DNA，溶于無菌超純水中。獲得的基因組DNA用核酸蛋白分析儀(Bio-Rad公司的SmartSpec^TM Plus Spectrophotometer)檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，并分別用無菌超純水將基因組DNA稀釋至1ng/ml，作為定量PCR檢測(cè)的陰性對(duì)照和樣品，并用無菌超純水作為空白對(duì)照。

2.6、重鏈基因的拷貝數(shù)的檢測(cè)：

各取基因組DNA 10μl作為PCR反應(yīng)模板，JRTH3F/JRTH3R分別為正反引物，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，并進(jìn)行熔解曲線的試驗(yàn)，結(jié)果見圖7和8。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系如下，定量PCR反應(yīng)的條件為95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40個(gè)循環(huán)。

熔解曲線的試驗(yàn)設(shè)置：針對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物從55℃開始，以0.5℃為間隔進(jìn)行升溫，至95℃，每個(gè)溫度保持30s并檢測(cè)熒光。反應(yīng)結(jié)束后，iQ5分析軟件自動(dòng)以熒光隨溫度變化率與溫度的關(guān)系繪圖，得到熔解曲線。不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣品基因組DNA，陰性對(duì)照基因組DNA和空白對(duì)照，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，供試樣品設(shè)多個(gè)復(fù)孔進(jìn)行平行檢測(cè)(≥3)。

從7、8中可以看出，樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)良好，而水和未轉(zhuǎn)染抗體分子的CHO細(xì)胞的基因組沒有任何擴(kuò)增，所有的樣品都僅在81℃左右出現(xiàn)一個(gè)單一吸收峰，說明PCR擴(kuò)增的特異性好。同時(shí)，所有的樣品的Ct值均落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍以內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后，分析軟件會(huì)自動(dòng)優(yōu)化得到Ct值，根據(jù)Ct值與輕鏈基因拷貝數(shù)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算10ng樣品DNA所含輕鏈基因拷貝數(shù)。

2.7、基因拷貝數(shù)的計(jì)算：

根據(jù)CHO基因組研究的進(jìn)展，CHO細(xì)胞的基因組大小為2.45Gb(Xu X et.al.，Nat Biotechnol,2011,29(8):735-741)，則10ng的基因組DNA含有3723個(gè)DNA分子，可以按下列公式計(jì)算轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞基因組中含有的重鏈基因拷貝數(shù)：

結(jié)果見表2。為獲得更高的抗體表達(dá)，轉(zhuǎn)染抗體的CHO細(xì)胞需要經(jīng)過長(zhǎng)期的連續(xù)的MTX增加壓力的過程，這過程實(shí)際上就是抗體重鏈基因在細(xì)胞基因組中拷貝數(shù)增加的過程(Cacciatore JJ等.Biotechnology Advances.2010,(28):673–681)。表2中也可看出采用MTX增加壓力的重鏈基因拷貝數(shù)大于不加入MTX的重鏈基因拷貝數(shù)。

Bubner B et.al.認(rèn)為，一般單個(gè)樣品的擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.3，就可以認(rèn)為能夠精確測(cè)定樣品的拷貝數(shù)(Bubner B等，Plant Cell Rep.2004,23(5):263-271)。由表2可見，本方法每個(gè)樣品擴(kuò)增反應(yīng)的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于0.3，說明我們的方法是準(zhǔn)確可靠的。

表2定量PCR檢測(cè)重鏈基因的拷貝數(shù)

注：表2中，+MTX是指搖瓶中加入MTX，-MTX是指搖瓶中不加入MTX。

重組抗體的表達(dá)水平依賴于輕鏈和重鏈基因的協(xié)同表達(dá)，二者之間存在著一個(gè)合適的輕鏈重鏈比例(Chusainow J等，Biotechnol Bioeng.2009,102(4):1182-1196.；Ho SC1等，J Biotechnol.2013,165(3-4):157-166)。

采用本發(fā)明的方法對(duì)輕鏈基因和重鏈基因的拷貝數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可篩選出輕鏈和重鏈基因的拷貝數(shù)比較接近、處于比例合適的范圍的高表達(dá)細(xì)胞株，作為商業(yè)化的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，對(duì)于商業(yè)化的重組抗體的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性上有非常重要的作用。