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一種定量PCR檢測轉基因細胞中外源基因拷貝數(shù)的方法與流程

文檔序號:11936949閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中抗體重鏈基因拷貝數(shù)的方法,其特征在于,所采用的正向引物和反向引物分別是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子。

2.如權利要求1所述的SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中重鏈基因拷貝數(shù)的方法,其特征在于,具體包括如下步驟:

a)合成針對抗體重鏈基因的特異性正向引物JHc-1F和特異性反向引物JHc-1R,以完整抗體的重鏈DNA作為模板進行普通PCR擴增,制備出帶有重鏈片段的質粒DNA,從而制備重鏈質粒DNA標準品;所述JHc-1F的序列如SEQ ID No.7,所述JHc-1R的序列如SEQ ID No.8所示;

b)以SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物、以步驟a)中的帶有重鏈片段的質粒DNA標準品作為模板進行定量PCR反應,計算質粒DNA的拷貝數(shù),建立PCR反應標準曲線;

c)提取轉染抗體分子的動物細胞株的基因組DNA和未轉染抗體分子的動物細胞株的基因組DNA作為模板,采用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的正向引物和反應引物,進行定量PCR反應,同時用無菌超純水作為空白對照;定量PCR反應結束后獲得Ct值,并進行溶解曲線的試驗,根據(jù)Ct值和步驟b)中的標準曲線計算動物細胞中抗體分子的重鏈基因拷貝數(shù);

上述步驟b)和c)中,在進行定量PCR擴增時,其定量PCR反應的總體積是30μl:SYBR Green PCR Mix 15μl,10μM濃度的正向引物0.5μl,10μM濃度的反向引物0.5μl,DNA模板10μl,無菌超純水,4μl;

其定量PCR反應條件為:先95℃10min,隨后依次95℃30s、60℃30s、72℃30s,共40個循環(huán)。

3.如權利要求1或2所述的SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中重鏈基因拷貝數(shù)的方法,其特征在于,所述轉基因細胞選自CHO細胞。

4.一種SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中抗體分子輕鏈基因拷貝數(shù)的方法,其特征在于,所采用的輕鏈基因引物為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的DNA分子。

5.如權利要求4所述的SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中重鏈 基因拷貝數(shù)的方法,其特征在于,具體包括如下步驟:

a)合成針對抗體輕鏈基因的特異性正向引物JLc1F和特異性反向引物JLc1R,以完整抗體的輕鏈DNA作為模板進行普通PCR擴增,制備出帶有輕鏈片段的質粒DNA,從而制備輕鏈質粒DNA標準品;所述JLc1F的序列如SEQ ID No.5所示,所述JLc1R的序列如SEQ ID No.6所示;

b)以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的正向引物和反向引物、以步驟a)中的質粒DNA標準品作為模板進行定量PCR反應,計算質粒DNA的拷貝數(shù),建立PCR反應標準曲線;

c)提取轉染抗體分子的動物細胞株的基因組DNA和未轉染抗體分子的動物細胞株的基因組DNA作為模板,采用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的正向引物和反應引物,進行定量PCR反應,同時用無菌超純水作為空白對照;定量PCR反應結束后獲得Ct值,并進行溶解曲線的試驗,根據(jù)Ct值和步驟b)中的標準曲線計算動物細胞中抗體分子的重鏈基因拷貝數(shù);

上述步驟b)和c)中,在進行定量PCR擴增時,其定量PCR反應的總體積是30μl:SYBR Green PCR Mix 15μl,10μM濃度的正向引物0.5ml,10μM濃度的反向引物0.5μl,DNA模板10ml,無菌超純水4ml;

其定量PCR反應條件為:先95℃10min,隨后依次95℃30s、60℃30s、72℃30s,共40個循環(huán)。

6.如權利要求4或5所述的SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中重鏈基因拷貝數(shù)的方法,其特征在于,所述轉基因細胞選自CHO細胞。

7.如權利要求1-3中任一所述的SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中重鏈基因拷貝數(shù)的方法在篩選穩(wěn)定高表達的工程化細胞株中的應用。

8.如權利要求4-6中任一所述的SYBR-Green定量PCR方法檢測轉基因細胞中輕鏈基因拷貝數(shù)的方法在篩選穩(wěn)定高表達的工程化細胞株中的應用。

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