專利名稱：被調(diào)節(jié)的細(xì)胞程序死亡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與嵌合蛋白質(zhì)同二聚或多聚的，較好是非肽的有機(jī)分子的低聚合有關(guān)的材料、方法及應(yīng)用。借助對宿主細(xì)胞的重組修飾及其在基因治療中的應(yīng)用或可誘導(dǎo)基因表達(dá)的其他應(yīng)用，舉例說明了本發(fā)明的若干方面。
引言生物學(xué)特異性通常是由蛋白質(zhì)間高度特異性的相互作用而導(dǎo)致的。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)即是這一原理的實際例證，借助這一過程細(xì)胞外分子影響到細(xì)胞內(nèi)行為。許多途徑都是隨著細(xì)胞外配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合而發(fā)生的。在許多情況下，受體二聚合導(dǎo)致蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)磷酸化及補(bǔ)充，所述蛋白質(zhì)繼續(xù)進(jìn)行信號級聯(lián)反應(yīng)。認(rèn)識到膜受體可經(jīng)過同二聚作用而被激活是從受體可由交聯(lián)了兩個受體的抗體所激活這一觀察結(jié)果而得出的。其后，發(fā)現(xiàn)許多受體都有這些性質(zhì)。據(jù)信許多受體的細(xì)胞外和跨膜區(qū)域都通過配體依賴性二聚合或低聚合，將受體的胞漿區(qū)帶向密切接近處而發(fā)揮功能的，而受體的胞漿區(qū)則將特定信號傳遞給細(xì)胞的內(nèi)部對應(yīng)部分。
其他一些人已研究了配體-受體在不同的系統(tǒng)中的相互作用。例如Clark等人(Science(1992)258，123)描述了B細(xì)胞抗原受體復(fù)合物的胞漿效應(yīng)物。Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715)、Verweij等人(J.Biol.Chem.(1990)265，15788)和Shaw等人(Science(1988)241，202)報導(dǎo)NF-AT指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是嚴(yán)格處于抗原受體控制下的。Emmel等人(Science(1989)246，1617)和Flanagan等人(Nature(1991)352，803)報導(dǎo)了環(huán)孢菌素A(cyclosporin A)和FK506對NF-AT-指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的抑制作用。Durand等人(Mol.Cell.Biol.(1988)8，1715)和Mattila等人(EMBO J.(1990)9，4425)描述了NF-AT結(jié)合位點(diǎn)。描述ζ鏈的參考文獻(xiàn)包括0rloff，等人Nature(1990)347，189-191；Kinet，等人，Cell(1989)57.351-354；Weissman，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，9709-971 3和Lanier，Nature(1989)342，803-805。Byrn等人(Nature(1990)344，667-670)描述了CD4免疫粘附蛋白(immunoadhesin)。Irving等人(Cell(1992)64，891)，以及Letourner和Klausner(Science(1992)255，79)描述了CD8-ζ融合的蛋白質(zhì)。
描述與啟動子區(qū)域關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子和不同的活化作用和DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的文章包括Keegan等人，Nature(1986)231，699；Fields和Song，ibid(1989)340，245Jones，Cell(1990)61，9；Lewin，Cell(1990)61，1161；Ptashne and Gann，Nature(1990)346，329；Adams and Workman，Cell(1993)72，306。
描述孢囊擊靶和融合的文章包括Sollner等人，(1993)Nature 362，318-324；和Bennett and Scheller(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，2559-2563。
描述調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)降解的文章包括Hochstrasser等人(1990)Cell 61，697；Scheffher，M.等人(1993)Cell 75，495；Rogers等人(1986)Science 234，364-368。
提供合成技術(shù)和FK506及相關(guān)化合物的修飾方面的其他信息的公開包括GB 2 244 991 A；EP 0 455 427 A1；WO91/17754；EP0 465 426 A1；US 5,023,263和WO 92/00278。
涉及Fas抗原、p55 TNF受體(下文的“TNF受體”)和/或細(xì)胞程序死亡的描述性公開包括Itoh等人(1991)Cell 66，233-243；Nagata等人，歐洲專利申請公開號510691(1992)；Suda等人，Cell(1993)，75(6)1169-78；Oehm等人，J.Biological Chem.(1992)267(15)，10709-10715；和Wong and Goeddel，JImmunol(1994)，152(4)，1751-5。
有關(guān)基因治療的方法和材料的討論見于Watson，Gilman，Witkowski和Zoller，RECOMBINANT DNA，2d edition(WHFreeman&Co，1992)的第28章以及該文文獻(xiàn)目錄中引用的參考文獻(xiàn)，尤其是pp564-565中。
然而，如從本說明書中可以清楚地看出的，前述作者都沒有描述或提示本發(fā)明。下文中詳細(xì)公開的我們的發(fā)明包括利用蛋白質(zhì)在活細(xì)胞內(nèi)同二聚合、異二聚合和低聚合的普遍適用的方法及材料。(本文所用術(shù)語低聚體、低聚合化和低聚合作用包含二聚體、三聚體和更高級的低聚體及其形成)。嵌合應(yīng)答蛋白質(zhì)是作為有特異性受體區(qū)的融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的。用與受體區(qū)域結(jié)合的細(xì)胞可穿透性多價配體試劑處理細(xì)胞，導(dǎo)致嵌合體的二聚合或低聚合。與其他嵌合受體(如參見Weiss，Cell(1993)73，209)相似，設(shè)計嵌合蛋白質(zhì)以使低聚合作用激發(fā)細(xì)胞死亡，在某些具體實施方案中，可激發(fā)任選的其他繼后的變化過程，如細(xì)胞內(nèi)信號通過繼后的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用傳播，從而激活特異性亞群的轉(zhuǎn)錄因子?？墒褂檬荏w基因檢測法檢測轉(zhuǎn)錄的開始。由合成配體在細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)嵌合蛋白質(zhì)對于各種細(xì)胞過程的基礎(chǔ)研究、工程細(xì)胞中可調(diào)節(jié)地發(fā)動細(xì)胞死亡和在調(diào)節(jié)有治療或農(nóng)業(yè)重要性之蛋白質(zhì)的合成中具有潛在作用。此外，配體介導(dǎo)的低聚合目前已使調(diào)節(jié)的基因治療得以可能實現(xiàn)。在這種情況下，它提供了-種新方法以提高用基因治療得到的安全性、表達(dá)水平及總體效果。
發(fā)明的概述本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞基因工程的材料和方法，以使所述細(xì)胞及其后代以可調(diào)節(jié)的方式對有程序的細(xì)胞死亡(細(xì)胞程序死亡)敏感。本發(fā)明可用作消除在培養(yǎng)基中或體內(nèi)生長的工程細(xì)胞的群體的手段，因此它可為基因治療中所用的基因工程細(xì)胞提供特別的具有自動防止故障特性的機(jī)理。
本發(fā)明涉及新的嵌合的(或“融合的”)蛋白質(zhì)、編碼它們的DNA構(gòu)建體，以及能夠使嵌合蛋白質(zhì)低聚合的配體分子。該嵌合蛋白質(zhì)至少含有一個與下文詳述的能在細(xì)胞中啟動程序死亡的作用區(qū)域融合的配體結(jié)合(或“受體”)區(qū)域。如下文也將述及的，嵌合蛋白質(zhì)也可含有附加區(qū)域。就其各個區(qū)域是得自不同的來源，因而并非同時存在于自然界(即是異種的)這個意義上說，嵌合蛋白質(zhì)是重組的。
本發(fā)明提供了編碼新的嵌合蛋白質(zhì)的DNA分子(“構(gòu)建體”)，它可用于宿主細(xì)胞的基因工程。這些構(gòu)建體就其組成部分，如編碼特定區(qū)域或表達(dá)控制序列的各部分并非在自然界中被發(fā)現(xiàn)彼此直接相連這個意義上說，它們是重組體。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生和使用所述經(jīng)修飾細(xì)胞的方法和組合物。
為了產(chǎn)生經(jīng)修飾細(xì)胞，有人將編碼所需嵌合體的DNA引入選定的宿主細(xì)胞，這可以通過使用常規(guī)的載體(可以商購多種載體)和技術(shù)來完成。如有必要，還可通過常規(guī)方法從其他細(xì)胞中篩選、分離出經(jīng)修飾細(xì)胞并培養(yǎng)之。
用于實施本發(fā)明的低聚合化配體能與兩個(或多個)受體區(qū)域，即含有這種受體區(qū)域的兩個或多個嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合。低聚合化配體可以任一順序或同時與嵌合體結(jié)合，優(yōu)選Kd值低于大約10-6，更優(yōu)選的低于約10-7，甚至最好的是低于大約10-8，并且在某些實施方案中Kd值低于約10-9M。優(yōu)選的配體不是蛋白質(zhì)，并且具有小于大約5kDa的分子量。如此低聚合的嵌合蛋白質(zhì)的受體區(qū)域可以是相同或不同的。嵌合蛋白質(zhì)能夠在暴露于配體之后，即嵌合體低聚合后啟動其宿主細(xì)胞的程序死亡。因此，本發(fā)明基因工程細(xì)胞的程序死亡發(fā)生在細(xì)胞暴露于能使嵌合體低聚合化的配體之后。換句話說，本發(fā)基因工程細(xì)胞含有上述嵌合體蛋白質(zhì)，并且對能使那些嵌合體低聚合化的配體的存在有反應(yīng)。這種反應(yīng)性可通過對細(xì)胞死亡的啟動來證實。
被編碼的嵌合蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包含能夠?qū)⑶逗系鞍踪|(zhì)導(dǎo)向預(yù)期的細(xì)胞對應(yīng)部分的細(xì)胞內(nèi)靶向區(qū)域。靶向區(qū)域可能是分泌性前導(dǎo)序列、跨膜序列區(qū)、膜結(jié)合區(qū)或指導(dǎo)蛋白質(zhì)例如與泡囊或與核聯(lián)系的序列。
嵌合蛋白質(zhì)的作用區(qū)域可選自通過交聯(lián)激發(fā)細(xì)胞程序死亡的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)區(qū)域(優(yōu)選為人類來源或序列)，包括例如Fas抗原的胞質(zhì)區(qū)域。
正如下文將更詳細(xì)討論的，舉例來說，本發(fā)明多個實施方案中，嵌合蛋白質(zhì)能夠結(jié)合FK506型配體、環(huán)孢菌素A型配體、四環(huán)素或類固醇配體。這種結(jié)合導(dǎo)致嵌合蛋白質(zhì)與其他可以相同或不同的嵌合蛋白質(zhì)分子的低聚合。
除了編碼上述嵌合體(“初級”嵌合體)的構(gòu)建體以外，細(xì)胞還可任選地進(jìn)一步含有另外的異源DNA構(gòu)建體用以一個或多個所需基因的可調(diào)節(jié)性或組成性表達(dá)。例如，細(xì)胞另外還可含有一個或多個編碼任選嵌合體的其他構(gòu)建體，否則如上所述只含有作用區(qū)域，它通過配體誘導(dǎo)的低聚合作用可激發(fā)生物過程而不是細(xì)胞程序死亡。這種其他的作用區(qū)域可選自能夠在該嵌合蛋白質(zhì)低聚合后影響所需生物學(xué)結(jié)果的多種不同蛋白質(zhì)的區(qū)域。例如，作用區(qū)可包含如CD 3 zeta(ζ)亞單位這樣的蛋白質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域在接觸配體并繼而低聚后，能夠發(fā)起可檢測的細(xì)胞內(nèi)信號；作用區(qū)還包含如Gal4這樣的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，或如VP16這樣的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。本文提供了許多其他的例子。可檢測之細(xì)胞內(nèi)信號的一個例子是在可對低聚合作用反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件(如增強(qiáng)子和/或啟動子元件等)的轉(zhuǎn)錄控制下，激活基因轉(zhuǎn)錄的信號。優(yōu)選地，可使初級嵌合體低聚合化并導(dǎo)致細(xì)胞程序死亡的配體不會導(dǎo)致任選嵌合體蛋白質(zhì)的低聚合。通常甚至更優(yōu)選的是可使任選嵌合體低聚合化并影響任選的生物學(xué)過程，如經(jīng)調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄的配體不會導(dǎo)致初級嵌合體的低聚合或激發(fā)細(xì)胞程序死亡。不同套的配體在某種意義上來說是正交的。
正如下文將更詳細(xì)討論的，在本發(fā)明各種實施方案中，嵌合蛋白質(zhì)能夠結(jié)合FK506型配體、環(huán)孢菌素A型配體、四環(huán)素或類固醇配體。這種結(jié)合可導(dǎo)致嵌合蛋白質(zhì)分子與其他可以相同或不同的嵌合蛋白質(zhì)分子的低聚合。
可任意選擇的是，細(xì)胞還可以含有另一個重組構(gòu)建體或這類構(gòu)建體系列，該構(gòu)建體包含處于轉(zhuǎn)錄控制元件(如啟動子/增強(qiáng)子)的轉(zhuǎn)錄控制下的靶基因，所說的轉(zhuǎn)錄控制元件對由配體介導(dǎo)的任選嵌合蛋白質(zhì)的低聚合，即細(xì)胞暴露于相關(guān)配體所激發(fā)的信號有反應(yīng)。就靶基因并非天然處于反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控制之下而言，這些構(gòu)建體是重組的。
這種任選的靶基因構(gòu)建體可含有(a)對上述任選嵌合蛋白質(zhì)的低聚合起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件，和(b)來自靶基因的側(cè)翼DNA序列，該序列允許轉(zhuǎn)錄控制元件同源重組到與靶基因相關(guān)聯(lián)的宿主細(xì)胞中。在另外的實施方案中，構(gòu)建體含有所需基因和允許靶基因同源重組到所需座位中之靶座位的側(cè)翼DNA序列(參見例如Mansour等人，1988，Nature 336，348-352以及M.Capecchi等人后來的論文)。構(gòu)建體還可含有反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄控制元件，或可由座位提供的反應(yīng)性元件。靶基因可編碼如表面膜蛋白質(zhì)、分泌性蛋白質(zhì)、胞質(zhì)蛋白質(zhì)或核酶(ribozyme)或反義序列。
本發(fā)明的構(gòu)建體還可含有允許構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中并選擇含有該構(gòu)建體之轉(zhuǎn)染體的可選擇標(biāo)志。本發(fā)明進(jìn)一步包括DNA載體，它含有各種本文所述的構(gòu)建體，可用于將此構(gòu)建體引入進(jìn)行組織培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中，也可在活體內(nèi)將此構(gòu)建體施用給整個生物體以引進(jìn)細(xì)胞中。在任一種情況下，此構(gòu)建體可通過附加體引入或用于染色體整合。該載體可以是病毒載體，例如包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明還包括由我們的任何一個DNA構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)，以及含有和/或表達(dá)它們的細(xì)胞，包括原核和真核細(xì)胞，特別是各種類型和譜系的酵母、蠕蟲、昆蟲、小鼠或其他嚙齒動物、以及包括人細(xì)胞在內(nèi)的其他哺乳動物細(xì)胞，其可以是冷凍的或呈活體生長的，或培養(yǎng)中的或含有它們的整體生物。
概括地說，本發(fā)明提供了含有編碼初級嵌合蛋白質(zhì)的第一個DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，優(yōu)選但并非一定是哺乳動物細(xì)胞，其中所說的嵌合蛋白質(zhì)包含(i)至少一個能夠與本發(fā)明選擇的低聚合化配體結(jié)合的受體區(qū)域以及(ii)另一個蛋白質(zhì)區(qū)域，它與有關(guān)的受體區(qū)域異源，但與一個或多個其他類似區(qū)域低聚合后能夠激發(fā)細(xì)胞的程序死亡。將細(xì)胞暴露于選定的配體之后，即可發(fā)生程序化的細(xì)胞死亡。
在一些實施方案中，剛剛描述過的細(xì)胞也可含有編碼一個或多個嵌合蛋白質(zhì)的一個或多個任選的DNA構(gòu)建體，其中所說的嵌合蛋白質(zhì)包含(i)至少一個能夠與本發(fā)明選擇的低聚合化配體結(jié)合的受體區(qū)域以及(jj)另一個蛋白質(zhì)區(qū)域，它與有關(guān)的受體區(qū)域異源，但與這些任選的嵌合體低聚合后能夠激發(fā)(直接或間接)靶基因在對所說的低聚合起反應(yīng)之轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控制下的轉(zhuǎn)錄過程活化。這些細(xì)胞通常也可含有處在對所說的低聚合配體起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件之表達(dá)控制下的靶基因。在暴露于選擇的配體之后，靶基因得以表達(dá)。另外，能夠使初級嵌合體低聚合化的配體和能夠使任選的嵌合體低聚合化的配體應(yīng)能正交。
在其他實施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞也可含有編碼第一任選嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體，其中所說的嵌合蛋白質(zhì)包含DNA結(jié)合區(qū)和至少一個能與第一個選擇的配體部分結(jié)合的受體區(qū)域。所述細(xì)胞進(jìn)一步包括含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域及至少一個能與第二個選擇的配體部分(其可以與第一個選擇的配體部分相同或不同)結(jié)合的受體區(qū)域的第二任選嵌合蛋白質(zhì)。所述細(xì)胞另外還含有編碼處于異源轉(zhuǎn)錄控制序列的轉(zhuǎn)錄控制下的靶基因的DNA構(gòu)建體，靶基因具有相關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)以結(jié)合到DNA結(jié)合區(qū)域并對轉(zhuǎn)錄激活區(qū)發(fā)生反應(yīng)，從而在細(xì)胞暴露于含有選擇之配體部分的低聚合化配體之后即可表達(dá)靶基因。
用于實施本發(fā)明各方面的DNA組合物包括那些編碼任選嵌合體的DNA組合物，那些組合物含有編碼嵌合蛋白質(zhì)之第一DNA構(gòu)建體和編碼靶基因之第二DNA構(gòu)建體，其中所說的嵌合蛋白質(zhì)包含至少一個能與選擇的配體結(jié)合的受體區(qū)，該受體區(qū)則融合于能夠在暴露于低聚配體后，即嵌合蛋白質(zhì)低聚合后發(fā)起生物學(xué)過程的異源附加蛋白質(zhì)區(qū)；且其中所說的靶基因處于對低聚配體起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控制下。
用于實施本發(fā)明各方面的另一類型的DNA組合物包含編碼第一和第二個嵌合蛋白質(zhì)的第一系列DNA構(gòu)建體，以及編碼靶基因的第二DNA構(gòu)建體，所說的靶基因處在對嵌合蛋白質(zhì)分子低聚合起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控制下。編碼第一個嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體包含(a)至少一個能與選擇的第一配體部分結(jié)合的第一受體區(qū)域，以及與受體區(qū)域融合的(b)能夠在接觸低聚合配體，即第一嵌合蛋白質(zhì)低聚成第二嵌合蛋白質(zhì)分子后起動生物學(xué)過程的異源附加蛋白質(zhì)區(qū)域。編碼第二個嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體包含(i)至少一個能夠與選擇的第二配體部分結(jié)合的受體區(qū)域，以及與該區(qū)域融合的(ii)能夠在接觸低聚配體后，即與第一個嵌合蛋白質(zhì)低聚合后起動生物學(xué)過程的異源附加蛋白質(zhì)區(qū)域。在這些情況下，第一和第二受體部分可以是相同或不同的，并且第一和第二選擇配體部分也同樣可以是相同或不同的。
我們的配體是能夠與本發(fā)明的兩個或多個嵌合蛋白質(zhì)分子結(jié)合，以形成其低聚體的分子，并有下列通式接頭-[rbm1，rbm2，…rbm n]其中n是2至大約5的整數(shù)，rbm(1)-rbm(n)是可以相同或不同的并能與嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的受體結(jié)合部分。rbm部分共價連接到接頭部分上，所說的接頭部分是能夠與兩個或多個rbm部分共價結(jié)合(“-”)的雙或多功能分子。優(yōu)選的配體分子量小于大約5kDa，并且不是蛋白質(zhì)。這樣的配體的例子包括其中rbm部分相同或不同者，而且包含F(xiàn)K506-型部分，環(huán)孢菌素型部分、類固醇或四環(huán)素。環(huán)孢菌素型部分包括環(huán)孢菌素及能夠與親環(huán)素(cyclophilin)結(jié)合的，天然或經(jīng)修飾的，較好有低于大約10-6M之Kd值的其衍生物。在某些實施方案中，配體較好以大于約10-6M，更好以大于約10-5M的Kd值結(jié)合到天然存在的受體上。本發(fā)明的說明性配體是其中至少-個rbm包含F(xiàn)K506、FK520、雷帕霉素或其在C9、C10或兩位置上經(jīng)修飾之衍生物的分子者，這些配體以比其天然存在之受體蛋白質(zhì)結(jié)合的Kd值小至少1個，較好2、更好3個，甚至最好4或5個或更大數(shù)量級的Kd值，與經(jīng)過修飾的受體或含有經(jīng)過修飾之受體區(qū)域的嵌合分子結(jié)合。接頭部分也在下面詳細(xì)描述，但作為說明其可包括如C2-C20亞烷基、C4-C18氮雜亞烷基、C6-C24N-亞烷基氮雜亞烷基，C6-C18亞芳基，C8-C24芳基二亞烷基或C8-C36雙羧酰氨基亞烷基部分。
本發(fā)明的單體rbm，以及含有單一rbm拷貝的化合物是低聚合拮抗劑，其能夠與我們的嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合但不影響其二聚合或更高級的聚合或低聚合(從個別rbm的單體性質(zhì)來看)。
在本發(fā)明的一個重要的方面，本發(fā)明的基因工程細(xì)胞可以與其他細(xì)胞一起培養(yǎng)，通過加入有效量的相應(yīng)于(即可結(jié)合于)初級嵌合蛋白質(zhì)的低聚合配體可從細(xì)胞混合物中有選擇地清除出此基因工程細(xì)胞。因此，將此細(xì)胞與低聚合配體接觸可激發(fā)工程細(xì)胞的細(xì)胞死亡。例如，可允許這種細(xì)胞在需要的期間內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源或異源產(chǎn)物，然后通過加入配體使之缺失。在這種情況下，細(xì)胞被工程化以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的初級嵌合體?？砂闯Ｒ?guī)方法在培養(yǎng)物中培養(yǎng)將進(jìn)一步被工程化以在配體誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)下表達(dá)所需基因的細(xì)胞。在那種情況下，向培養(yǎng)基中加入任選嵌合體的配體可導(dǎo)致所需基因的表達(dá)和所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。如下文詳細(xì)描述的，然后向培養(yǎng)基中加入低聚合拮抗劑即可關(guān)閉基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在其他情況下，蛋白質(zhì)的產(chǎn)生是組成型的。無論怎樣，在這些工程細(xì)胞已完成其所要完成的使用目的(如產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物)之后，可通過向培養(yǎng)基中加入有效量的適當(dāng)?shù)途酆匣潴w以導(dǎo)致初級嵌合體的低聚合并誘導(dǎo)工程細(xì)胞的程序死亡，從而從細(xì)胞培養(yǎng)物中清除這些工程細(xì)胞。本發(fā)明的工程化改造的細(xì)胞也可以在體內(nèi)用于修飾整體生物，例如包括人在內(nèi)的動物，以使含有這些細(xì)胞的動物體內(nèi)由這些細(xì)胞產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)或其他效果。這類應(yīng)用包括進(jìn)行基因治療。另外，可以在細(xì)胞外使用嵌合蛋白質(zhì)和低聚分子，以將協(xié)同發(fā)揮啟動生理學(xué)作用的蛋白質(zhì)帶到一起。
因此本發(fā)明提供了在對加入低聚合配體反應(yīng)中，有選擇地清除細(xì)胞的材料和方法。該方法包括提供按照本發(fā)明進(jìn)行工程改造的細(xì)胞，并使細(xì)胞與配體接觸。
因此，本發(fā)明提供了使用如本文所述的工程化細(xì)胞通過可調(diào)節(jié)地激活細(xì)胞中靶基因的轉(zhuǎn)錄從而產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)，并在需要時清除工程細(xì)胞的方法。該方法包括可提供本發(fā)明的細(xì)胞，它可表達(dá)初級嵌合蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)在低聚合后可啟動細(xì)胞程序死亡，該細(xì)胞進(jìn)一步包含并能表達(dá)(a)至少一個可編碼嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體，此蛋白質(zhì)在低聚合后可激活(b)靶基因的轉(zhuǎn)錄。嵌合蛋白質(zhì)包含至少一個能夠與選擇的低聚合配體結(jié)合的受體區(qū)域。該受體區(qū)域融合到一個在暴露于低聚配體之后，即與一個或多個含有另一作用區(qū)域之拷貝的其他嵌合蛋白質(zhì)低聚合后，能夠啟動細(xì)胞內(nèi)信號的作用區(qū)域上。此信號能夠激活基因的轉(zhuǎn)錄，例如在這種情況下可激活處于對此信號起反應(yīng)之轉(zhuǎn)錄控制元件的轉(zhuǎn)錄控制下之靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此該方法包括使細(xì)胞暴露子能夠與導(dǎo)致靶基因表達(dá)的有效量嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的低聚合配體。在細(xì)胞生長于培養(yǎng)基中的情況下，向培養(yǎng)基中加入配體即可使細(xì)胞暴露于配體。在細(xì)胞存在于宿主生物體內(nèi)的情況下，則將配體投藥于宿主生物體，即可實現(xiàn)細(xì)胞與配體的接觸。例如，在宿主生物體是動物，特別是哺乳動物(包括人)的情況下，可將配體在其適當(dāng)?shù)妮d體中，經(jīng)口服、口內(nèi)(bucal)、舌下、經(jīng)皮、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)或吸入等途徑對宿主動物給藥。為了清除工程細(xì)胞，可根據(jù)具體情況在培養(yǎng)基中加入或給宿主生物體、施用能夠使初級嵌合體低聚合化的第二低聚合化配體。
本發(fā)明進(jìn)一步包括藥用組合物，用于從包括動物組織或含有這種工程細(xì)胞的個體在內(nèi)的不同細(xì)胞混合物中清除本發(fā)明的基因工程細(xì)胞。這種藥用組合物含有與可藥用的載體及任選的一種或多種可藥用的賦形劑相混合的本發(fā)明低聚合配體。如在本文其它部分所詳述的，低聚合配體可以是同低聚合試劑或異低聚合試劑，只要它能與本發(fā)明的初級嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合或能激發(fā)本發(fā)明工程細(xì)胞的程序死亡。同樣，本發(fā)明還包括一種藥用組合物，它含有與可藥用的載體并可選擇地與一種或多種可藥用的賦形劑相混合的本發(fā)明低聚合拮抗劑，用于完全或部分地防止或降低細(xì)胞培養(yǎng)物或個體內(nèi)本發(fā)明工程細(xì)胞中嵌合蛋白質(zhì)的低聚合水平，因此可防止或消除相關(guān)細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。因此使用低聚合試劑和低聚合拮抗劑制備的藥用組合物包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明還貢獻(xiàn)一種提供對本發(fā)明的低聚合配體有反應(yīng)的宿主生物體，優(yōu)選是動物，在許多情況下是哺乳動物的方法。該方法包括引入已按本發(fā)明進(jìn)行離體(ex vivo)工程化改造的，即含有編碼前述之嵌合蛋白質(zhì)之DNA構(gòu)建體的生物體細(xì)胞。另外，亦可在允許體內(nèi)轉(zhuǎn)染一個或多個宿主哺乳動物細(xì)胞的條件下將本發(fā)明的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入宿主生物體，如哺乳動物體內(nèi)。
我們進(jìn)一步提供了產(chǎn)生對配體調(diào)節(jié)的細(xì)胞程序死亡敏感之細(xì)胞的試劑盒。一種試劑盒包含至少一個編碼我們的初級嵌合蛋白質(zhì)之一的DNA構(gòu)建體，所說的嵌合蛋白質(zhì)則含有至少一個受體區(qū)域和作用區(qū)域(例如Fas或TNF受體的胞質(zhì)區(qū)，如前所述)。在一個實施方案中，DNA構(gòu)建體含有常規(guī)的多接頭以給實踐者提供摻入細(xì)胞型特異性表達(dá)控制元件(啟動子和/或增強(qiáng)子元件)的位點(diǎn)，從而提供一個或多個嵌合體的細(xì)胞型或組織特異性表達(dá)。該試劑盒可含有一定量能夠使由試劑盒中的DNA構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)分子低聚合的本發(fā)明的配體，另外并可含有一定量的低聚合拮抗劑，如單體配體試劑。在由構(gòu)建體編碼單一嵌合蛋白質(zhì)時，低聚配體是同低聚合配體。如編碼一個以上這樣的嵌合蛋白質(zhì)，則可包括異低聚合配體。該試劑盒可進(jìn)一步包含另外的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體編碼任選的嵌合體和/或靶基因構(gòu)建體和/或?qū)η逗系鞍踪|(zhì)分子的低聚合起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件。DNA構(gòu)建體較好是與一個或多個便于選擇轉(zhuǎn)染體的選擇標(biāo)志，以及用于在原核細(xì)胞中復(fù)制、在真核細(xì)胞中表達(dá)等的其他常規(guī)載體元件相聯(lián)系的。對于每個不同的DNA構(gòu)建體來說選擇標(biāo)志可以是相同或不同的，從而便于選擇含有這種DNA構(gòu)建體的多種聯(lián)合的細(xì)胞。
例如，本發(fā)明的一種試劑盒含有編碼如本文其它部分所述的初級嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體，編碼嵌合蛋白質(zhì)的第一任選的DNA構(gòu)建體，其中嵌合蛋白質(zhì)包含至少一個融合到轉(zhuǎn)錄激活物區(qū)域上的受體區(qū)域(能夠與選擇的配體結(jié)合)；編碼嵌合蛋白質(zhì)的第二任選的DNA構(gòu)建體，其中嵌合蛋白質(zhì)至少含有一個融合到DNA結(jié)合區(qū)域上的受體區(qū)域(能夠與選擇的配體結(jié)合)；以及編碼靶基因的靶基因DNA構(gòu)建體，其中靶基因處于含有一DNA序列的轉(zhuǎn)錄控制元件的控制下，所說的DNA序列上結(jié)合了DNA結(jié)合區(qū)并且它是在第一和第二個任選的嵌合蛋白質(zhì)存在下經(jīng)暴露于配體而被轉(zhuǎn)錄激活的。
另外，用于導(dǎo)入處于反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄控制元件控制下之靶基因的DNA構(gòu)建體可含有一代替靶基因的克隆位點(diǎn)，以為工程化細(xì)胞提供可誘導(dǎo)地表達(dá)由實際工作者將提供的基因提供適用試劑盒。
本發(fā)明的其他試劑盒可包含一個或兩個(或多個)表達(dá)嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體，其中一個或多個構(gòu)建體含有克隆位點(diǎn)代替作用區(qū)域(轉(zhuǎn)錄起始信號發(fā)生元件、轉(zhuǎn)錄激活因子、DNA結(jié)合蛋白質(zhì)等)，以允許使用者插入她/他所希望的某一個作用區(qū)域。這樣的試劑盒亦可任選包含上述的其他元件，如表達(dá)處于反應(yīng)性表達(dá)控制下之靶基因的DNA構(gòu)建體、低聚合配體、拮抗劑等。
任何試劑盒還都可含有用本發(fā)明的構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的陽性對照細(xì)胞，以使它們在對細(xì)胞與配體接觸發(fā)生反應(yīng)中表達(dá)報導(dǎo)基因(編碼CAT、β-半乳糖苷酶或任何可方便地檢測的基因產(chǎn)物)。還可提供檢測和/或定量報導(dǎo)基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。
附圖的簡要描述

圖1是質(zhì)粒pSXNeo/IL2(IL2-SX)的示意圖。NF-AT-SX中，來自含IL2增強(qiáng)子/啟動子之IL2-SX的HindIII-ClaI DNA片段，被賦予基本轉(zhuǎn)錄的最小IL-2啟動子和含有3個串聯(lián)NFAT結(jié)合位點(diǎn)的可誘導(dǎo)元件所取代(詳見下述)。
圖2是制備細(xì)胞內(nèi)信號傳輸嵌合體質(zhì)粒p#MXFn和p#MFnZ的流程圖，其中n是指示結(jié)合區(qū)域的數(shù)目。
圖3A和3B是制備細(xì)胞外信號傳輸嵌合體質(zhì)粒p#1FK3/pBJ5的流程圖。
圖4A、4B和4C是構(gòu)建主題發(fā)明所用質(zhì)粒中使用的引物的序列。
圖5是具有不同增強(qiáng)子群的報導(dǎo)構(gòu)建體對受體TAC/CD3ζ與配體反應(yīng)的反應(yīng)曲線。
圖6是各種配體與實施例1中所述TAg Jurkat細(xì)胞的活性的曲線圖。
圖7是配體FK1012A(8，圖9B)與細(xì)胞外受體1FK3(FKBPx3/CD3ζ)之活性的曲線圖。
圖8是通過肉豆蔻?；腃D3ζ/FKBP12嵌合體經(jīng)信號傳遞激活NFAT報導(dǎo)基因的曲線圖。
圖9A和9B分別是烯丙基連接的FK506變異體和環(huán)己基連接的FK506變異體的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖10是合成FK520的衍生物的流程圖。
圖11A和B是合成FK520衍生物的流程圖，和FK520的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其設(shè)計底部結(jié)構(gòu)以接到突變體FKBP12上。
圖12是圖解說明在假定的溝中的有經(jīng)修飾之FK520的突變體FKBP。
圖13是合成FK520和環(huán)孢菌素之異二聚體的流程圖。
圖14是圖解顯示嵌合蛋白質(zhì)的低聚合，舉例的嵌合蛋白質(zhì)含有親免素部分作為受體區(qū)。
圖15說明配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)的低聚合，圖解顯示對轉(zhuǎn)錄起始信號的激發(fā)。
圖16描繪基于FK-506型部分的MED和HOD試劑的合成流程。
圖17描繪以CsA開始的(CsA)2的合成。
圖18是融合cDNA構(gòu)建體和蛋白質(zhì)MZF 3E的概觀。
圖19顯示FK1012誘導(dǎo)的，用肉豆蔻酰化Fas-FKBP 12融合蛋白質(zhì)(MF3E)轉(zhuǎn)染之Jurkat T細(xì)胞系的細(xì)胞死亡，根據(jù)降低的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性指示結(jié)果。
圖20A是在瞬間轉(zhuǎn)染試驗中對親環(huán)素-Fas(和Fas-親環(huán)素)融合構(gòu)建體的分析。在該系列中顯示MC3FE是最有效的。
圖20B描繪親免素-Fas抗原嵌合體，和在用大的T抗原穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的Jurkat T細(xì)胞中瞬間表達(dá)實驗的結(jié)果。Myr取自編碼殘基1-14之pp60c-grc的肉豆蔻?；蛄?Wilson等人，Mol.εCellBiol.94(1989)1536-44)FKBP人FKBP12；CypC編碼殘基6-212的鼠親環(huán)素C序列；(Freidman等人，Cell 664(1991)799-806)；Fas編碼殘基179-319之人Fas抗原的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域(Oehm等人，J.Biol.Chem.267.15(1992)10709-15)。細(xì)胞用編碼分泌的堿性磷酸酶報導(dǎo)基因(該報導(dǎo)基因處于3個串聯(lián)AP1啟動子控制下)的質(zhì)粒連同6倍摩爾過量的親免素融合構(gòu)建體經(jīng)電穿孔而轉(zhuǎn)染。24小時后用PMA(50ng/ml)(借以刺激報導(dǎo)基因的合成)和(CsA)2刺激細(xì)胞。在第48小時，檢測細(xì)胞的報導(dǎo)基因活性。在24小時用抗HA表位抗體進(jìn)行Western印跡試驗。
圖21描繪經(jīng)修飾的FK506型化合物的合成。
本發(fā)明的描述I.一般性討論本發(fā)明提供了嵌合蛋白質(zhì)，用于低聚合嵌合蛋白質(zhì)的有機(jī)分子及使用它們的系統(tǒng)。融合的蛋白質(zhì)(嵌合體)有一個用于與(較好是小的)有機(jī)低聚合分子結(jié)合的結(jié)合區(qū)域和一個作用區(qū)域，作為嵌合蛋白質(zhì)低聚合的結(jié)果其可導(dǎo)致某生理學(xué)作用或細(xì)胞過程。
圖14中圖解說明了可誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聯(lián)系的基本概念。可發(fā)揮異二聚合(或異低聚合，“HED”)劑和同二聚合(或同低聚合，“HOD”)劑作用的配體是啞鈴形結(jié)構(gòu)給出的。
(同二聚和同低聚是指相似部分結(jié)合，例如它們借助本發(fā)明的配體相連接而形成二聚體或低聚體。異二聚和異低聚是指不相似的組分結(jié)合形成二聚體或低聚體。因此同低聚體包含特定成分的多個拷貝的結(jié)合，而異低聚體包含不同成分之拷貝的結(jié)合。本文所使用的術(shù)語“低聚合作用”、“低聚合化”和“低聚體”，如無明顯的相矛盾的指示，不管有無字首，都意欲包括“二聚合作用”、“二聚合化”和“二聚體”。
圖14中描繪的是含有有用靶蛋白質(zhì)區(qū)域(“作用區(qū)域”)和一個或多個可與配體結(jié)合之受體區(qū)域的融合蛋白質(zhì)分子。對于細(xì)胞內(nèi)嵌合蛋白質(zhì)，即定位于產(chǎn)生它們的細(xì)胞之內(nèi)的蛋白質(zhì)，較好還存在一細(xì)胞擊靶序列(包括細(xì)胞器擊靶氨基酸序列)。配體與受體區(qū)域的結(jié)合導(dǎo)致融合蛋白質(zhì)的異或同二聚合。低聚作用使得作用區(qū)域彼此密切靠近，從而激發(fā)正常情況下與各個作用區(qū)域相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞過程-例如細(xì)胞程序死亡或TCR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
可由低聚作用激發(fā)的細(xì)胞過程包括狀態(tài)的改變，例如構(gòu)象改變、結(jié)合對象改變、細(xì)胞死亡、起始轉(zhuǎn)錄、通道開放、離子(如Ca+2等)釋放等物理狀態(tài)的改變，或者例如酶解催化的化學(xué)反應(yīng)，如?；?、甲基化、水解、磷酸化或去磷酸化、氧化還原狀態(tài)改變、重排等化學(xué)狀態(tài)的改變。因此，任何這類可由配體介導(dǎo)的低聚合作用激發(fā)的過程均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，盡管本文最初的焦點(diǎn)是細(xì)胞程序死亡。
在本發(fā)明的主要特征中，細(xì)胞經(jīng)修飾以便能與配體分子反應(yīng)，該配體分子能與本文公開的初級嵌合體結(jié)合。因此能使嵌合體低聚合化。例見以下實施例4(B)和4(C)。這種工程細(xì)胞通過進(jìn)行細(xì)胞程序死亡而對配體的存在發(fā)生反應(yīng)，因此在必需或需要清除經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞的基因治療和其他場合的應(yīng)用中可以清除這種工程細(xì)胞。例如，經(jīng)修飾的細(xì)胞可以變成癌性或者要不然變成有害的或多余的細(xì)胞。
經(jīng)修飾的細(xì)胞的特征在于其基因組含有基因構(gòu)建體(或其系列)，此構(gòu)建體編碼可允許配體調(diào)節(jié)的細(xì)胞程序死亡的本發(fā)明初級嵌合蛋白質(zhì)，此初級嵌合體含有例如Fas抗原或Apo-1抗原的胞質(zhì)區(qū)域，當(dāng)其交叉連接時可誘導(dǎo)大多數(shù)細(xì)胞類型的細(xì)胞程序死亡(Trauth等人，(1989)Science 245，301-305Watanaba-Fukunaga等人，(1992)Nature 356，314)。通過這種方式可為工程細(xì)胞的群體提供配體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
可將細(xì)胞進(jìn)一步工程化改造以產(chǎn)生能與選定的配體分子結(jié)合并反應(yīng)的任選的其他嵌合蛋白質(zhì)。這種進(jìn)一步任選的工程改造給予細(xì)胞額外的配體調(diào)節(jié)的功能，此功能可用于包括體外細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用及基因治療的應(yīng)用。優(yōu)選地，能與任選的其他嵌合體結(jié)合并能調(diào)節(jié)任選的其他細(xì)胞過程(如基因轉(zhuǎn)錄)的配體分子不能與初級嵌合體分子交叉反應(yīng)，因此它不能激發(fā)工程細(xì)胞的程序死亡。
這種進(jìn)一步經(jīng)修飾的細(xì)胞可用于需要調(diào)節(jié)如靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯(兩者統(tǒng)稱為表達(dá))的細(xì)胞過程調(diào)節(jié)的應(yīng)用中。這種細(xì)胞的特征在于其基因組至少含有第一或第一系列(該系列可能只包括一個構(gòu)建體)基因構(gòu)建體，此基因構(gòu)建體編碼任選的其他嵌合體，并可望包括第二或第二系列(該系列可以只包括一個構(gòu)建體)靶基因構(gòu)建體。
所述基因構(gòu)建體的性質(zhì)和數(shù)目將取決于嵌合蛋白質(zhì)的性質(zhì)及其在細(xì)胞中所起的作用。例如，在一些實施方案中任選的其他嵌合蛋白質(zhì)是將與靶基因(其可含有指導(dǎo)嵌合蛋白質(zhì)將與細(xì)胞表面膜或與核或泡囊等細(xì)胞器相聯(lián)系的細(xì)胞內(nèi)擊靶序列或區(qū)域)的表達(dá)相聯(lián)系的，這樣正常情況下將至少有兩個系列的這種其他構(gòu)建體編碼嵌合蛋白質(zhì)的第一系列，該蛋白質(zhì)在配體介導(dǎo)低聚合后起動信號指導(dǎo)靶基因表達(dá)，以及更理想的是還有第二個包括靶基因和/或其表達(dá)控制元件(該元件對信號有應(yīng)答)的系列。
在包括同低聚體通常是同二聚體時，第一系列中將只需要單一的構(gòu)建體，而當(dāng)包括異低聚體時，則可能涉及兩個或多個且通常不多于三個構(gòu)建體。由第一系列構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)將與基因轉(zhuǎn)錄的啟動相關(guān)并且通常將被指引向表面膜或核，在那里低聚合的嵌合蛋白質(zhì)能夠直接或間接地啟動一個或多個靶基因的轉(zhuǎn)錄。在導(dǎo)入外源基因，或者為表達(dá)內(nèi)源基因而導(dǎo)入外源或重組表達(dá)控制序列時(例如通過同源重組)，將需要第二系列的附加構(gòu)建體，每種情況下其轉(zhuǎn)錄均將因嵌合蛋白質(zhì)的低聚合而激活。
在嵌合蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)的并且能直接起作用而沒有引發(fā)另一個基因的轉(zhuǎn)錄的情況下，則利用不同的第一系列其他構(gòu)建體。例如，能夠可誘導(dǎo)地或構(gòu)成上地表達(dá)與胞吐作用相關(guān)的蛋白質(zhì)，此時蛋白質(zhì)除非在低聚分子存在下，一般將不發(fā)生復(fù)合。通過利用具有任何或所有下列這些性質(zhì)的蛋白質(zhì)，即在宿主細(xì)胞中不復(fù)合；經(jīng)與其他蛋白質(zhì)復(fù)合而受到抑制，且其抑制作用可因與配體低聚而得到克服；需要通過一個宿主細(xì)胞中不可得到的過程來激活；或者通過修飾指導(dǎo)泡囊與胞漿膜融合的蛋白質(zhì)以形成嵌合蛋白質(zhì)，此時復(fù)合物形成和膜融合的程度因有低聚分子的存在而提高，胞吐作用具有將被低聚分子誘導(dǎo)的能力。
可以同樣地修飾和使用其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如激酶、磷酸酶及細(xì)胞周期控制蛋白質(zhì)。
對本發(fā)明實際可用的各類任選的其他基因構(gòu)建體描述如下(1)編碼包括結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其中結(jié)合區(qū)是細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的，作用區(qū)是細(xì)胞內(nèi)的，這樣配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)的低聚合作用，包括其自身的低聚合(形成同低聚體)或與包含不同作用區(qū)之不同融合蛋白質(zhì)的低聚合(形成異低聚體)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生導(dǎo)致一系列過程的信號，進(jìn)而激活一個或多個基因的轉(zhuǎn)錄；(2)編碼包括有結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其中結(jié)合區(qū)和作用區(qū)在同一核內(nèi)，這樣配體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)的低聚合，包括其自身的低聚合(形成同低聚物)或與包括不同作用區(qū)之不同的融合蛋白質(zhì)的低聚合(形成異低聚物)，即可誘導(dǎo)直接通過低聚物與DNA轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的復(fù)合而發(fā)動轉(zhuǎn)錄過程(3)編碼包括結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其中結(jié)合區(qū)和作用區(qū)是胞質(zhì)內(nèi)的，這樣配體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)低聚合作用，包括其自身的低聚合(形成同低聚體)或與包含有不同作用區(qū)之不同的融合蛋白質(zhì)的低聚合(形成異低聚體)，即可導(dǎo)致胞吐作用；和(4)編碼包括結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，其中結(jié)合區(qū)和作用區(qū)是細(xì)胞外的，而且作用區(qū)與發(fā)動生物學(xué)活性相關(guān)聯(lián)(作為非限制性舉例說明，作用區(qū)可以自身與一種物質(zhì)，即受體或其他膜蛋白質(zhì)結(jié)合，在經(jīng)過配體介導(dǎo)的嵌合體低聚合之后，橋接一種或多種相似或不相似的分子或細(xì)胞)；以及(5)編碼去穩(wěn)定化的、失活的或短壽命的具有結(jié)合區(qū)和作用區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，這樣一來配體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與含有不同作用區(qū)之靶蛋白質(zhì)的低聚合便導(dǎo)致所說低聚合的靶蛋白質(zhì)的去穩(wěn)定和/或降解或失活。
II.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上述(1)和(2)類構(gòu)建體被看作是第一系列。(1)類構(gòu)建體在其作用上不同于(2)類構(gòu)建體。(1)類構(gòu)建體是稍有多效性的，即能夠激活許多野生型基因，以及靶基因。另外，(1)類基因的表達(dá)產(chǎn)物對配體的反應(yīng)相對較慢。(2)類構(gòu)建體可被導(dǎo)向特異性靶基因并能夠限制將被轉(zhuǎn)錄之基因的數(shù)目。(2)類構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物對配體的反應(yīng)十分迅速。
(1)和(2)類的主題系統(tǒng)將包括第一系列含有編碼嵌合蛋白質(zhì)的DNA序列的構(gòu)建體，通常包括一至三個，一般是一至兩個不同的構(gòu)建體。該系統(tǒng)通常還包括第二系列將便于一個或多個基因，常常是外源基因表達(dá)的構(gòu)建體?！巴庠椿颉笔侵覆煌谡Ｇ闆r下的由細(xì)胞表達(dá)的基因，原因例如可以是由于細(xì)胞的性質(zhì)、細(xì)胞的遺傳缺陷、基因來源于不同的種或者是突變的或合成的基因等情況。這樣的基因可能編碼蛋白質(zhì)、反義分子、核酶等，或者可以是包含一表達(dá)控制序列的DNA序列，所說的表達(dá)控制序列被連接或?qū)⒁B接到一個正常情況下表達(dá)控制序列并不與之聯(lián)系的外源基因上。因此，如上所述，該構(gòu)建體可含適于配體誘導(dǎo)的外源基因表達(dá)的外源或重組表達(dá)控制序列。
常常優(yōu)選的是，由(1)、(2)和(3)類構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)可以有一個細(xì)胞內(nèi)擊靶區(qū)，其包含將嵌合蛋白質(zhì)指向所需之區(qū)如表面膜、核、泡囊膜或其他部位的序列，在這些部位由配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)的低聚合作用，至少是二聚合發(fā)動所需的生理學(xué)活性。
嵌合蛋白質(zhì)含有能夠與至少一個配體分子結(jié)合的第二(“結(jié)合”或“受體”)區(qū)域。由于配體可含有一個以上的結(jié)合位點(diǎn)或表位，所以其可與本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)形成二聚體或更高級的同或異低聚體。嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)可具有一個或多個結(jié)合位點(diǎn)，從而可與二價配體形成同低聚體。因為有兩個或多個能結(jié)合第二區(qū)域的表位，故配體可以以這種方式低聚嵌合蛋白質(zhì)，從而為嵌合蛋白質(zhì)的更高級低聚合作好準(zhǔn)備。
嵌合蛋白質(zhì)還含有能夠在通過結(jié)合區(qū)實現(xiàn)配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)分子的低聚合后發(fā)動生物學(xué)活性的第三(“作用”)區(qū)域。因此，作用區(qū)可以作為配體介質(zhì)的低聚合的結(jié)果，與信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)聯(lián)。所述信號，例如可依據(jù)于參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定中間成分，導(dǎo)致一個或多個基因轉(zhuǎn)錄的開始。圖15描繪了一個有代表性的嵌合蛋白質(zhì)，其中細(xì)胞內(nèi)擊靶區(qū)包含肉豆蔻酸酯部；受體區(qū)包含三個FKBP12部分；且作用區(qū)包含一個ζ亞單位。在其它嵌合蛋白質(zhì)中，作用區(qū)可含有轉(zhuǎn)錄因子，其在低聚合后導(dǎo)致一個或多個靶基因(內(nèi)源和/或外源的)的轉(zhuǎn)錄開始。作用區(qū)可包含與泡囊膜同表面或其他膜的融合相關(guān)的蛋白質(zhì)或其部分，如SNAP和SNARE組群的蛋白質(zhì)(參見Sollner等人，Nature(1993)362，318 and 353Cell(1993)72，43)。
A.表面膜受體本發(fā)明的一類其他任選的嵌合蛋白質(zhì)是與表面膜相關(guān)的并且是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)引起一個或多個基因轉(zhuǎn)錄的信號。該過程涉及許多在最終實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因相關(guān)啟動子區(qū)域結(jié)合的一系列相互作用中的輔助蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到與其他基因相關(guān)的啟動子區(qū)域上的情況下，此處也發(fā)起轉(zhuǎn)錄。編碼本實施方案之嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，可以編碼能受到加工并因而可能不存在于成熟嵌合蛋白質(zhì)中的信號。嵌合蛋白質(zhì)在任何過程中都將包括(a)能夠結(jié)合預(yù)定配體的結(jié)合區(qū)域，(b)任選的(但在許多實例中又是優(yōu)選的)膜結(jié)合區(qū)，其包括為使融合的蛋白質(zhì)向細(xì)胞表面/膜上轉(zhuǎn)移，和維持結(jié)合到細(xì)胞表面膜上的蛋白質(zhì)所需的跨膜區(qū)或結(jié)合脂質(zhì)，以及(c)作為作用區(qū)的胞質(zhì)信號起始區(qū)。胞質(zhì)信號起始區(qū)能夠發(fā)動導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄的信號，所述基因在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)中有識別起始之信號的序列。
本文中所說的其表達(dá)受來自嵌合蛋白質(zhì)之信號調(diào)節(jié)的基因是指“靶”基因，包括處于內(nèi)源或外源(或雜種)表達(dá)控制序列的表達(dá)控制下的外源基因或內(nèi)源基因。促使與膜結(jié)合之嵌合蛋白質(zhì)的分子部分也稱為“保留區(qū)域”。適當(dāng)?shù)谋Ａ魠^(qū)包括直接與膜的脂質(zhì)層結(jié)合的部分，如通過脂質(zhì)參與膜中或通過膜延伸等。如圖15中所示，在這些情況下蛋白質(zhì)逐漸向膜特別是細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移并與之結(jié)合。
B.核轉(zhuǎn)錄因子另一個任選的第一構(gòu)建體編碼含有細(xì)胞擊靶序列的嵌合蛋白質(zhì)，所說的序列適于使蛋白質(zhì)向核轉(zhuǎn)位的需要。該(“信號共有序列”)序列具有多個堿性氨基酸，稱為由兩部分組成的堿性重復(fù)序列(參見Garcia-Bustos et al.，Biochimica et Biophysica Acta(1991)1071，83-101)。該序列可以出現(xiàn)在分子內(nèi)部或接近于N或C末端的僑何部分，并可致使嵌合蛋白質(zhì)成為核內(nèi)的。本發(fā)明一個實施方案的實踐將涉及至少兩種(“第一系列”)嵌合蛋白質(zhì)(1)一種具有與靶基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的DNA結(jié)合的作用區(qū)域，以及(2)含有作為作用區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域的另一種不同的嵌合蛋白質(zhì)，其能夠與第一個嵌合蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合區(qū)聯(lián)合，發(fā)動靶基因的轉(zhuǎn)錄。兩個作用區(qū)域或轉(zhuǎn)錄因子可衍生于相同或不同的蛋白質(zhì)分子。
對于細(xì)胞宿主來說，轉(zhuǎn)錄因子可以是內(nèi)源的或外源。如果轉(zhuǎn)錄因子是外源的，但在宿主內(nèi)發(fā)揮功能并且可以與內(nèi)源性RNA聚合酶(而不是需要可導(dǎo)入基因的外源性RNA聚合酶)協(xié)同作用，一起提供隨融合的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的外源性啟動子元件則配有用于調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的第二個構(gòu)建體。借助這一手段，可使轉(zhuǎn)錄的起始限制到與外源啟動子區(qū)域相聯(lián)系的基因，即靶基因。
已知大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子為發(fā)揮活性需要有兩個亞單位。另外，在單一轉(zhuǎn)錄因子可以分成兩個獨(dú)立的功能區(qū)域(如轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和DNA結(jié)合區(qū))的情況下，構(gòu)個區(qū)域可各自失活，但是當(dāng)使它們在一起密切接近時，則又恢復(fù)了轉(zhuǎn)錄活性?？梢允褂玫霓D(zhuǎn)錄因子包括由Fields和Song(文獻(xiàn)同上)描述的可分成兩個區(qū)域的酵母GAL4。作者使用了GAL4(1-147)-SNF1和SNF4-GAL4(768-881)的融合體，其中SNF1和-4可以被主題結(jié)合蛋白質(zhì)(作為結(jié)合區(qū))所取代?？衫肎AL4和VP16或HNF-1的結(jié)合體。其他轉(zhuǎn)錄因子是Jun、Fos和ATF/CREB家族的成員，Oct1、Sp1、HNF-3、類固醇受體總家庭等的成員。
作為不同于的聯(lián)合使用DNA結(jié)合區(qū)和天然存在之激活區(qū)或其修飾形式的可代用方式，可以用與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和RNA聚合酶(包括但不只限于RNA聚合酶II)間的橋接有關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)之一取代激活區(qū)。這些蛋白質(zhì)包括稱為TAF′s的蛋白質(zhì)、TFII蛋白質(zhì)，特別是B和D等。因此，可使用任何一種蛋白質(zhì)或組合，例如融合蛋白質(zhì)或其結(jié)合部分，用于橋接DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和RNA聚合酶并用于發(fā)動轉(zhuǎn)錄。在與DNA結(jié)合區(qū)接合以發(fā)動轉(zhuǎn)錄中，較好使用最接近RNA聚合酶的蛋白質(zhì)。如果需要，主題構(gòu)建體可為將三個或更多個，通常不超過約4個，蛋白質(zhì)帶到一起作好準(zhǔn)備，以提供轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。
可使用失活化區(qū)，如ssn-6/TUP-1或Krüppel家族阻遏區(qū)，而不是有作為作用區(qū)的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。以這種方式，調(diào)節(jié)導(dǎo)致構(gòu)成型表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)閉。例如，在基因治療情況下，可以提供構(gòu)成型表達(dá)的一種激素(如生長激素)、血液蛋白質(zhì)、免疫球蛋白等。利用編碼一種含有與配體結(jié)合區(qū)連接之DNA結(jié)合區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)，和另一種含有與配體結(jié)合區(qū)連接之失活化區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，即可通過配體介導(dǎo)的低聚合作用抑制基因的表達(dá)。
設(shè)計編碼特別含有與轉(zhuǎn)錄激活區(qū)或亞單位、轉(zhuǎn)錄失活化區(qū)或DNA結(jié)合區(qū)融合之配體結(jié)合區(qū)的嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體，并按照組裝其他構(gòu)建體的同樣方式組裝之。轉(zhuǎn)錄因子的N-末端將常常結(jié)合到配體結(jié)合區(qū)的C-末端上，盡管在某些情況下是反過來的，例如單一轉(zhuǎn)錄因子的兩個不同的區(qū)域分在兩個不同的嵌合體間。
III.胞吐作用配體介導(dǎo)的低聚合機(jī)制的另一個應(yīng)用是胞吐作用，其中蛋白質(zhì)的輸出面不是轉(zhuǎn)錄作用受到配體的控制。此可與一種或多種有用蛋白質(zhì)的表達(dá)相配合，作為一種可替代方式促成通過分泌信號序列分泌有用蛋白質(zhì)。該實施方案涉及兩種不同的第一構(gòu)建體。一種構(gòu)建體編碼將蛋白質(zhì)引向泡囊以整合到泡囊膜中的嵌合蛋白質(zhì)(Sollner et al.，文獻(xiàn)出處同上)。可用作泡囊結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)包括單獨(dú)或合用的VANP(synaptobrevin)、SNC2、rab3、SEC4、synaptotagmin等。細(xì)胞膜蛋白質(zhì)可包括單獨(dú)或組合的syntaxin、SSO1、SSO2、neurexin等。其他構(gòu)建體則為向表面膜運(yùn)輸作準(zhǔn)備，并利用上述的肉豆蔻酰信號序列、其他胞漿膜擊靶序列(為用于異戊烯化)或跨膜保留區(qū)。上述參考文獻(xiàn)中描述了所編碼的蛋白質(zhì)，作為作用區(qū)的全部或其功能性部分?？稍谂c外源蛋白質(zhì)表達(dá)的配合中使用這些構(gòu)建體，其適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行編碼以運(yùn)輸泡囊或內(nèi)吞內(nèi)源性蛋白質(zhì)，以提高內(nèi)源性蛋白質(zhì)的輸出。
有多種機(jī)制可用于胞吐作用。依據(jù)細(xì)胞類型以及何種蛋白質(zhì)對該細(xì)胞內(nèi)的胞吐作用是限制性的，可由一種或多種具有被配體激活之反應(yīng)性元件的構(gòu)建體編碼一種或多種泡囊結(jié)合的蛋白質(zhì)或細(xì)胞蛋白質(zhì)。特別有用的是組合VAMP和syntaxin。另外，亦可提供控制胞吐作用的非限制性蛋白質(zhì)的構(gòu)成型表達(dá)，以及提供配體調(diào)節(jié)胞吐作用限制性蛋白質(zhì)的表達(dá)。最后，可以提供與胞吐作用相關(guān)的嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)成型表達(dá)，從而由嵌合蛋白質(zhì)與配體的低聚合控制胞吐作用。使用適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合區(qū)域，可以使不同的嵌合蛋白質(zhì)將在泡囊表面上低聚合以形成活性復(fù)合物，和/或通過配體使泡囊蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜表面蛋白質(zhì)連接。在沒有配體的情況下，由于對配體的修飾如缺失、突變等，實質(zhì)上降低了蛋白質(zhì)控制的胞吐作用間的結(jié)合親合性，嵌合蛋白質(zhì)沒有可能提供胞吐作用?？梢允褂酶鱾€蛋白質(zhì)的交迭片段并確定那一個片段保留有活性便可很容易地確定這些修飾的存在?？梢赃M(jìn)一步使用丙氨酸取代修飾各片段，以確定實質(zhì)上影響結(jié)合的各個氨基酸(Beohncke等人，J.Immunol.(1993)150，331-341，Evavold等人，出處同上(1992)148，347-253)。
如上所述，可以在構(gòu)成上或可誘導(dǎo)地表達(dá)組裝在泡囊腔中的蛋白質(zhì)，以及與胞吐作用相關(guān)的融合蛋白質(zhì)。是涉及內(nèi)源性或是外源性蛋白質(zhì)，將被輸出的蛋白質(zhì)是構(gòu)成型表達(dá)還是可誘導(dǎo)地表達(dá)，是否可使用同樣配體發(fā)動與胞吐作用相關(guān)聯(lián)之融合蛋白質(zhì)以及將被輸出之蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，或者是否不同的蛋白質(zhì)要受制于不同的可誘導(dǎo)信號，均可依據(jù)胞吐作用的目的確定控制表達(dá)的方式。一個方面，胞吐作用機(jī)制應(yīng)只是由配體控制的過程。在另一方面，至少一種蛋白質(zhì)的表達(dá)以及胞吐作用均可受到配體控制。
通過引入使蛋白質(zhì)向泡囊轉(zhuǎn)位的細(xì)胞擊靶序列，而不丟失所述蛋白質(zhì)的生理學(xué)活性來修飾各種蛋白質(zhì)?？墒褂冒伦饔米鳛獒尫艡C(jī)制，依據(jù)宿主的性質(zhì)，在短時間內(nèi)釋放相對高的劑量蛋白質(zhì)，在維管系統(tǒng)中產(chǎn)生高度定位水平的或高濃度的蛋白質(zhì)。令人感興趣的有意義蛋白質(zhì)包括胰島素、組織血纖維蛋白溶酶原激活劑、細(xì)胞激活素、促紅細(xì)胞生成素、集落刺激因子、生長因子、炎性肽、細(xì)胞遷移因子。
可從與胞吐作用相關(guān)的泡囊結(jié)合蛋白質(zhì)得到將蛋白質(zhì)導(dǎo)向泡囊的編碼序列(如參見Sollner，等人，文獻(xiàn)出處同上)。
低聚合機(jī)制的另一個應(yīng)用是控制蛋白質(zhì)降解或失活。例如，可以借助與本發(fā)明不同的嵌合蛋白質(zhì)(其具有相對短的半壽期或去穩(wěn)化或以趨向于降解的低聚物)的配體介導(dǎo)的低聚合作用，使本發(fā)明的相對穩(wěn)定的或有長壽期的嵌合蛋白去穩(wěn)定化或趨向于降解。在這一實施方案中，配體介導(dǎo)的低聚合通過賦予蛋白質(zhì)以縮短的半壽期而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。后來的嵌合蛋白質(zhì)可含有使蛋白質(zhì)對準(zhǔn)溶酶體的區(qū)域或使蛋白質(zhì)易在細(xì)胞溶質(zhì)或核或非溶酶體細(xì)胞器中對蛋白水解裂解敏感的區(qū)域。
可根據(jù)許多因素確定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的半壽期，這些因素包括在所說的蛋白質(zhì)內(nèi)存在富含氨基酸殘基脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的短氨基酸序列(因此是“害蟲(PEST)”)、有相似功能的其他序列、蛋白酶敏感性裂解位點(diǎn)及遍在蛋白化狀態(tài)。遍在蛋白化是由針對蛋白質(zhì)降解的一個或多個短肽鏈單位、遍在蛋白完成的對蛋白質(zhì)的修篩。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)遍在蛋白化的速率主要是由被加工蛋白質(zhì)N-末端氨基酸的同一性以及靠近氨基末端的一個或多個特有賴氨酸殘基決定的。
IV.其他調(diào)節(jié)系統(tǒng)可由與個別蛋白質(zhì)有關(guān)的特定活性的低聚作用控制的其他生物學(xué)功能是蛋白質(zhì)激酶或磷酸酶活性、還原酶活性、環(huán)氧合酶活性、蛋白酶活性或依賴于亞單位聯(lián)系的酶促反應(yīng)。另外，還可以提供與細(xì)胞周期有關(guān)的G蛋白質(zhì)與受體蛋白質(zhì)的聯(lián)系，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclins)和cdc激酶、多單位解毒酶。
V.構(gòu)建體的成分與(1)和(2)類任選的其他嵌合蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的第二或其他任選的構(gòu)建體(靶基因構(gòu)建體)包括有指明的靶識別序列或反應(yīng)性元件的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，以便對來自活化受體或活化轉(zhuǎn)錄因子的起始信號作出應(yīng)答，導(dǎo)致至少一個有意義基因轉(zhuǎn)錄成有意義序列，通常是mRNA，其轉(zhuǎn)錄及適當(dāng)情況下的翻譯可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表達(dá)，和/或?qū)ζ渌虻恼{(diào)節(jié)，如反義鏈、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、膜融合蛋白質(zhì)的表達(dá)等。
為不同的目的，可以使用不同的位點(diǎn)，不同的結(jié)合區(qū)域和不同的胞質(zhì)區(qū)域。對于與表面膜相關(guān)聯(lián)的嵌合蛋白質(zhì)受體，如果配體結(jié)合區(qū)是細(xì)胞外的，可以設(shè)計嵌合蛋白質(zhì)使之含有一個選自各種表面膜蛋白質(zhì)的細(xì)胞外區(qū)域。同樣，可以根據(jù)由胞質(zhì)部分調(diào)節(jié)的那個內(nèi)源性基因，而使用能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的表面膜蛋白質(zhì)的不同的胞漿或細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。如嵌合蛋白質(zhì)是內(nèi)在的，在表面膜蛋白內(nèi)或與例如核、泡囊等細(xì)胞器相聯(lián)系的，則配體結(jié)合區(qū)部分將受制于能夠與可穿過表面膜或其他膜(如果適宜的話)的分子結(jié)合的區(qū)域。因此，這些結(jié)合區(qū)域一般將同小的天然存在的或并不包括蛋白質(zhì)或核酸的合成的配體分子結(jié)合。
A.胞質(zhì)區(qū)域(1)類似嵌合蛋白質(zhì)受體可以含有胞質(zhì)區(qū)域，后者來自各種細(xì)胞表面膜受體之一，包括其突變蛋白，其中參與與胞質(zhì)區(qū)域相關(guān)聯(lián)之起始轉(zhuǎn)錄的識別序列是已知的，或者對這些序列有反應(yīng)的基因是已知的。有意義的突變受體將使靶基因的轉(zhuǎn)錄激活同可能與有害付作用(如失調(diào)的細(xì)胞生長或細(xì)胞激活素的不適當(dāng)釋放)相關(guān)之基因的活化脫離聯(lián)系。特別令人感興趣的受體相關(guān)的胞質(zhì)區(qū)域?qū)⒕哂邢铝刑卣鲗ο鄬苌俚?可望少于100)并且一般在細(xì)胞宿主中無害的基因，受體活化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的起始；由受體活化發(fā)動的轉(zhuǎn)錄所必需的其他因子存在于細(xì)胞宿主中；靶基因以外的基因被激活將不影響期望使用這些細(xì)胞要達(dá)到的目的；胞質(zhì)區(qū)域的低聚合作用或其他可利用的機(jī)制導(dǎo)致信號發(fā)動；胞質(zhì)區(qū)域連接到所需的配體結(jié)合區(qū)上將不干擾信號發(fā)送。許多不同的胞質(zhì)區(qū)是已知的。這些區(qū)域中許多是酪氨酸激酶或是與酪氨酸激酶復(fù)合的，如CD3ζ、IL-2R、IL-3R等(參見Cantley，etal.，Cell(1991)64，281中的綜述)。經(jīng)交聯(lián)如二聚合(基于首先由Yarden和Ulrich[Annu.Rev.Biochem.(1988)57，443]提出的命名)而活化的酪氨酸激酶受體包括I亞類EGF-R、ATR2/neu、HER2/neu、HER3/c-erbB-3、Xmrk；II亞類胰島素-R、JGF-1-R[胰島素樣生長因子受體]、IRR；III亞類PDGF-R-A、PDGF-R-B、CSF-1-R(M-CSF/c-Fms)、c-kit、STK-1/Flk-2；以及IV亞類FGF-R、flg[酸性FGF]、bek[堿性FGF]神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶Trk家族，包括NGF-R、Ror1，2。與交聯(lián)后酪氨酸激酶相聯(lián)系的受體包括CD3ζ家族CD3ζ和CD3η(主要見于T細(xì)胞，與Fyn相聯(lián)系)；FcεRI的β和γ鏈(主要見于肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞中)；FcrRIII/CD16的γ鏈(主要見于巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞中)；CD3γ、-δ和-ε(主要見于T細(xì)胞中)；Ig-α/MB-1和Ig-β/B29(主要見于B細(xì)胞中)。許多細(xì)胞激活因子和生長因子受體與共同的β亞單位相關(guān)聯(lián)，β亞單位與酪氨酸激酶和/或其他信號發(fā)送分子相互作用，并且可在本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)中用作胞質(zhì)區(qū)域。這些β亞單位包括(1)由GM-CSF、IL-3和IL-5受體分享的通用β亞單位；(2)與IL-6、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)性因子(CNTF)、制瘤素M和IL-11受體相關(guān)的β鏈gp130；(3)也與IL-4、IL-7和IL-13(及可能的IL-9)的受體相關(guān)的IL-2受體γ亞單位；以及(4)與G-CSF受體之胞質(zhì)區(qū)域同源的IL-2受體的β鏈。
可以使用包括干擾素α/β和γ(其可以激活酪氨酸激酶之JAK、TyK家族的一個或多個成員)在內(nèi)的干擾素家庭的受體、以及生長激素、促紅細(xì)胞生成素和催乳素(可能也激活JAK2)受體作為胞質(zhì)區(qū)域的來源。
胞質(zhì)區(qū)域的其他來源包括細(xì)胞表面受體的TGF-β家族(Kingslkey，D.，Genes and Devel opment(1994)8，133)。該受體家族在其胞質(zhì)區(qū)域包含絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，據(jù)信是經(jīng)交聯(lián)而被激活的。
與轉(zhuǎn)錄因子的活化和去活化相關(guān)的酪氨酸激酶在提供可受控制的、并可用以發(fā)動或抑制外源基因表達(dá)的特殊途徑中是特別有用的。
下表中列出了一些受體和與受體相關(guān)的性質(zhì)，以及其激活基因的核反應(yīng)性元件。該表不是無遺漏的，所列出的只是可適用于主題本發(fā)明的舉證性的系統(tǒng)。
在許多狀態(tài)下可以得到突變的胞質(zhì)區(qū)，其中被轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號可能不同于野生型，從而產(chǎn)生與野生型相比受限制的或不同的途徑。例如，對于EGF和FGF等生長激素，已報導(dǎo)了其突變情況，其中信號與細(xì)胞生長相脫離，但仍由c-fos保留(Peters et al.，Nature(1992)358，678)。
在全身的各種細(xì)胞上，都可以發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體。相反，CD3ζ家族、Ig家族和淋巴激活素β鏈?zhǔn)荏w家族則主要見于造血細(xì)胞、特別是T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞及天然殺傷細(xì)胞上。NF-AT轉(zhuǎn)錄所需要的信號主要來自抗原受體的zeta(ζ)鏈，較少來自CD3γ、δ、ε。
由于天然存在的或被截短的、修飾的或突變的，胞質(zhì)區(qū)域至少約10個，一般至少約30個，更通常至少約50個氨基酸，并且通常不超過約400個氨基酸，更好是不超過約200個氨基酸(參見Romeo，et al.，Cell(1992)68，889-892)。雖然任何種均可使用，但較好使用內(nèi)源于宿主細(xì)胞的種。然而，在許多情況下，可以有效地使用來自不同種的胞質(zhì)區(qū)。上文指出的任何胞質(zhì)區(qū)，以及目前已知的或繼后可能被發(fā)現(xiàn)的其他胞質(zhì)均可使用。
表1

對于大部分與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的其他嵌合蛋白質(zhì)來說，主要不同在于具有將嵌合蛋白質(zhì)導(dǎo)向核膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞擊靶序列，并具有作為作用區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子或其部分。通常，轉(zhuǎn)錄因子作用區(qū)域可分為“DNA結(jié)合區(qū)”和“激活區(qū)”?？梢蕴峁┯幸粋€或多個配體結(jié)合區(qū)的DNA結(jié)合區(qū)，以及有一個或多個配體結(jié)合區(qū)的激活區(qū)。以這種方式，DNA結(jié)合區(qū)可以與多個結(jié)合區(qū)和/或激活區(qū)偶聯(lián)。另外，對涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的與表面膜有關(guān)之嵌合蛋白質(zhì)的討論也適用于指導(dǎo)與基因組DNA結(jié)合的嵌合蛋白質(zhì)。同樣，與胞吐作用相關(guān)的嵌合蛋白質(zhì)，代替轉(zhuǎn)導(dǎo)性胞質(zhì)蛋白質(zhì)，基本上不同于與泡囊膜同表面膜的融合相關(guān)的蛋白質(zhì)。
B.細(xì)胞擊靶區(qū)域信號肽或序列使嵌合蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面膜，此時相同或其他的序列可以編碼與細(xì)胞表面膜結(jié)合的嵌合蛋白質(zhì)。雖然有一個通用的信號序列部分，在兩個或三個N末端極性氨基酸之后是大約15-20個基本上疏水的氨基酸，但個別氨基酸可能有很大的變化。因此，實質(zhì)上任何在宿主中有功能活性的，并且可能或可能不與嵌合蛋白質(zhì)的其他區(qū)域之一相聯(lián)系的信號肽均可利用。正常情況下，信號肽要經(jīng)過加工并且將不保留在成熟的嵌合蛋白質(zhì)中。編碼信號肽的序列是在編碼序列的5′端，并且將包括起始蛋氨酸密碼子。
選擇膜保留區(qū)域?qū)τ诒景l(fā)明來說不是很重要的，因為發(fā)現(xiàn)這些膜保留區(qū)域?qū)嵸|(zhì)上是可替代的，并且結(jié)合或為激活而結(jié)合到其他膜區(qū)域上都不要求有嚴(yán)格的氨基酸。因此，不管是否是宿主內(nèi)源的，從任何方便的表面膜或胞漿蛋白質(zhì)中都可以分離膜保留區(qū)域。
至少有兩個不同的膜保留區(qū)跨膜保留區(qū)，其為橫跨膜延伸的氨基酸序列；以及脂質(zhì)膜保留區(qū)，其脂質(zhì)與細(xì)胞表面膜的脂質(zhì)相聯(lián)。
為了易于構(gòu)建，大部分都可使用胞質(zhì)區(qū)域或受體區(qū)域的跨膜區(qū)，這樣可趨向于簡化融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建。然而，對于脂質(zhì)膜保留區(qū)，通常在與膜結(jié)合的N末端編碼序列的5′端，和接近C末端結(jié)合區(qū)編碼序列的3′端加上加工信號。脂質(zhì)膜保留區(qū)具有約12到24個碳原子，特別是14個碳原子，更具體是有肉豆蔻酰基，與甘氨酸連接的脂質(zhì)。脂質(zhì)結(jié)合區(qū)的信號序列是一N末端序列并且可有很寬范圍的變化，通常在2位殘基上是甘氨酸且在7位殘基上是賴氨酸或精氨酸(Kaplan，et al.，Mol.Cell.Biol.(1988)8，2435)。Carr等人(PNAS，USA(1988)79，6128)、Aitken等人(FEBS Lett.(1982)150，314)、Henderson等人(PNAS，USA(1983)80，319)、Schulz等人(Virology(1984)123，2131)、Dellman等人(Nature(1985)314，374)都已描述過，并在Ann.Rev.of Biochem.(1988)57，69中也已綜述過參與翻譯后加工以提供脂質(zhì)膜結(jié)合的肽序列。有意義的氨基酸序列包括序列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-R。多種DNA序列均可用于編碼融合之受體蛋白質(zhì)中的所述序列。
一般說來，跨膜區(qū)域有大約18-30個氨基酸，更常見是約20-30個氨基酸，其中心部分主要是中性、非極性氨基酸，并且該區(qū)域的末端是極性氨基酸，常常是帶電荷的氨基酸，一般約帶1-2個電荷，跨膜區(qū)域的末端主要是堿性氨基酸，其后是螺旋斷裂殘基，如pro-或gly-。
C.配體結(jié)合區(qū)域本發(fā)明任何嵌合蛋白質(zhì)的配體結(jié)合(“二聚合”或“受體”)區(qū)可以是任何允許使用或結(jié)合天然或非天然配體，較好是非天然合成配體進(jìn)行誘導(dǎo)的適宜區(qū)域。根據(jù)構(gòu)建體的性質(zhì)和選擇的配體不同，結(jié)合區(qū)域可以是細(xì)胞膜內(nèi)部的或外部的。多種包括受體在內(nèi)的結(jié)合蛋白質(zhì)，包括與上文指出的胞質(zhì)區(qū)相關(guān)的結(jié)合蛋白質(zhì)都是已知的。其中特別有用的是已知其配體的(較好是小的有機(jī)配體)或可以容易產(chǎn)生的結(jié)合蛋白質(zhì)。這些受體或配體結(jié)合區(qū)域包括FKBP和親環(huán)素受體、類固醇受體、四環(huán)素受體、上文指出的其他受體等，以及可從抗體，特別是重或輕鏈亞單位、其突變序列得到的“非天然”受體、以隨機(jī)程序、組合合成等方法得到的隨機(jī)氨基酸序列。在大多數(shù)情況下，受體區(qū)作為天然區(qū)域或其截短的活性部分，至少有大約50個氨基酸、且少于約350個氨基酸，通常少于200個氨基酸。結(jié)合區(qū)較好是小的(＜25kDa，以允許在病毒載體中有效轉(zhuǎn)染)、單體的(這就排除了抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng))、非免疫原性的，并且應(yīng)是易于合成上的、可透過細(xì)胞的、可二聚成形的無毒性配體。
依據(jù)編碼嵌合蛋白質(zhì)之構(gòu)建體的設(shè)計和適當(dāng)配體的可利用性，受體區(qū)可以是細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的。對于疏水配體，結(jié)合區(qū)可以在膜的任一側(cè)，但對于親水配體，特別是蛋白質(zhì)配體，除非有一個使配體以其得到結(jié)合的形式實現(xiàn)內(nèi)在化的運(yùn)輸系統(tǒng)，否則結(jié)合區(qū)通常都是細(xì)胞膜外的。對于細(xì)胞內(nèi)受體，構(gòu)建體可以編碼信號肽和受體區(qū)序列的跨膜區(qū)5′或3′端，或可能有受體區(qū)序列的脂質(zhì)連接信號序列5′或3′端。當(dāng)受體區(qū)處于信號肽和跨膜區(qū)域之間時，受體區(qū)將是細(xì)胞外的。
構(gòu)建體的編碼受體的部分可因種種原因受到誘變。經(jīng)誘變的蛋白質(zhì)可提供更高的結(jié)合親和性，允許由配體分辨天然出現(xiàn)的受體和經(jīng)誘變受體，為設(shè)計受體-配體對等提供機(jī)會。受體改變可包括已知是在結(jié)合位點(diǎn)上的氨基酸的改變、使用組合技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，其中可經(jīng)改變特定氨基酸的密碼子(有已知改變或隨機(jī)改變)，在適當(dāng)?shù)脑怂拗髦斜磉_(dá)所得到的蛋白質(zhì)，然后篩選所得到的用于結(jié)合的蛋白質(zhì)，而對與結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)之氨基酸或與構(gòu)型改變相關(guān)之其他氨基酸的密碼子進(jìn)行誘變?？膳e例的這種狀態(tài)是將FKBP12的36位Phe改變成Ala，和/或?qū)⑵?7位Asp改變成Gly或Ala，以便在FK506或FK520的9或10位上容納氨基酸取代。具體地說，作為在C9和/或C10上包含修飾的FK506型和FK-520型配體的受體區(qū)，代替一個或多個Tyr26、Phe36、Asp37、Tyr82和Phe99而含有Val、Ala、Gly、Met或其他小氨基酸的突變FKBP12部分是特別有意義。
作為結(jié)合區(qū)可以使用抗體亞單位，如重鏈或輕鏈，特別是其片段，更具體的是全部或部分可變區(qū)，或重鏈與輕鏈的融合體以產(chǎn)生高親和性結(jié)合?？梢灾苽淇股砩峡山邮苤肟乖肿拥目贵w，并根據(jù)結(jié)合親和性篩選個別抗體亞單位?？梢苑蛛x編碼亞單位的cDNA并經(jīng)缺失恒定區(qū)、部分可變區(qū)、誘變可變區(qū)等對其進(jìn)行修飾，以得到對配體有適當(dāng)親和性的結(jié)合蛋白質(zhì)區(qū)域。以這種方式，幾乎任何生理上可接受的半抗原化合物均可以用作配體，或提供配體的表位。如結(jié)合區(qū)是已知的并且有一個有用的結(jié)合配體時，可以利用天然受體來代替抗體單位。
基于體外利用誘變或?qū)幋a蛋白質(zhì)之序列的組合修飾，得以能夠生產(chǎn)可根據(jù)不同配體的結(jié)合親和性進(jìn)行篩選的蛋白質(zhì)文庫。例如，可在編碼結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列中的一個或多個位點(diǎn)上，總體上隨機(jī)設(shè)定一個有1至5個、10個或更多個密碼子的序列，制成表達(dá)構(gòu)建體并將此表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入單細(xì)胞微生物中，以建立文庫。然后可以根據(jù)對一個或理想地多個配體的結(jié)合親和性篩選該文庫。然后即可使用與它們將導(dǎo)入其中的細(xì)胞相匹配的最好的親和性序列作為結(jié)合區(qū)。應(yīng)根據(jù)所使用的宿主細(xì)胞來篩選配體，以確定配體與內(nèi)源性蛋白質(zhì)結(jié)合的水平?？梢詸?quán)衡對經(jīng)過誘變的結(jié)合區(qū)的結(jié)合親和性與對內(nèi)源性蛋白質(zhì)的結(jié)合親和性之結(jié)合區(qū)的比例，以確定結(jié)合特性。然后可使用有最好結(jié)合特性的那些配體作為配體。作為非限制性的例子，可在完成前述工作中使用噬菌體顯示技術(shù)。
D.多聚合正常情況下，轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號是由于配體介導(dǎo)的嵌合蛋白質(zhì)分子的低聚合造成的，即由于配體結(jié)合后的低聚合的結(jié)果，盡管亦可利用其他結(jié)合過程，例如變構(gòu)激活來產(chǎn)生信號。就各區(qū)域的次序和個別區(qū)域的重復(fù)數(shù)目來說，嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建體間是有所不同的。對于在5′-3′方向上轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞外受體區(qū)域來說，構(gòu)建體將編碼包含信號肽、受體區(qū)、跨膜區(qū)和信號起始區(qū)的蛋白質(zhì)，其最后一個區(qū)域?qū)⑹羌?xì)胞內(nèi)的(胞質(zhì)的)。然而，如受體區(qū)是細(xì)胞內(nèi)的，則可利用不同的次序，此時信號肽之后可跟著受體區(qū)或信號起始區(qū)，然后是其余區(qū)域，或者有多個受體區(qū)，信號起始區(qū)可夾在受體區(qū)之間。通常，信號起始區(qū)的活性位點(diǎn)是在序列內(nèi)的，并且不需要有游離的羧基末端。每個區(qū)域都可以被多聚合，特別是受體區(qū)，通常具有不超過大約5次重復(fù)，及常見是不超過大約3次重復(fù)。
為了使受體多聚合，嵌合表面膜蛋白質(zhì)的受體區(qū)配體通常是在其至少應(yīng)有兩個結(jié)合位點(diǎn)的意義上多聚的，同時每個結(jié)合位點(diǎn)均能夠與受體區(qū)結(jié)合?？赏黝}配體是二聚體或更高級的低聚體，通常是不大于四聚的小的合成有機(jī)分子，單個分子一般至少約150D并且小于約5KD，通常是小于約3KD?？衫枚喾N合成配體和受體對。例如，在涉及天然受體的實施方案中，可使用二聚FK506與FKBP受體，可使用二聚合的環(huán)孢菌素A與環(huán)孢菌素受體、二聚合的雌激素與雌激素受體、二聚合的糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體、二聚合的四環(huán)素與四環(huán)素受體、二聚合的維生素D與維生素D受體等。另外亦可使用更高級聚合如三聚合的配體。對于涉及非天然受體的實施方案，例如抗體亞單位、經(jīng)修飾的抗體亞單位或經(jīng)修飾的受體等，可以使用任何各種不同的化合物。這些配體單位的重要特征是它們以高親和性(較好Kd≤10-8M)與受體結(jié)合，并且能夠化學(xué)二聚合。
配體可以有帶不同表位的不同的受體結(jié)合分子(也稱為“ HED”試劑)，因為它們可以介導(dǎo)有相同或不同結(jié)合區(qū)域之嵌合蛋白質(zhì)的異二聚合或異低聚合。配體可包括FK506或FK506型部分，以及CsA或環(huán)孢菌素型部分。兩部分部共價連接到共同的接頭部分上。這樣的配體將適用于介導(dǎo)第一和第二嵌合蛋白質(zhì)的低聚合，其中第一嵌合蛋白質(zhì)含有能夠與FK506型部分結(jié)合的受體區(qū)如FKBP12第二嵌合蛋白質(zhì)則含有能夠與環(huán)孢菌素A型部分結(jié)合的受體區(qū)如親環(huán)素。
VI.細(xì)胞細(xì)胞可以是原核的，但最好是真核的，包括植物、酵母、蠕蟲、昆蟲以及哺乳動物。目前特別優(yōu)選的細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，特別是靈長類動物，更具體是人，但可以涉及其他任何有興趣的動物特別是家養(yǎng)動物，如馬、牛、鼠、羊、狗、貓等。這些種動物中，可包括各種類型的細(xì)胞，例如造血、神經(jīng)、間質(zhì)、皮、粘膜、基質(zhì)、肌肉、脾、網(wǎng)狀內(nèi)皮、表皮、內(nèi)皮、肝、腎、胃腸、肺等組織的細(xì)胞。其中特別有用的是造血細(xì)胞，其包括任何可能與淋巴樣細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞譜系相關(guān)的有核細(xì)胞。其中特別有價值的是T和B細(xì)胞譜系的成員、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞、成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。另外特別適用的是干細(xì)胞和祖細(xì)胞，如造血、神經(jīng)、基質(zhì)、肌肉、肝、肺、胃腸等細(xì)胞。
細(xì)胞可以是自體細(xì)胞、同源細(xì)胞、同種異型細(xì)胞、甚至有些情況下是異源細(xì)胞?？梢愿淖冎饕M織相容性復(fù)合(“MHC”)特征以修飾細(xì)胞，包括失活β2巨球蛋白以阻止生成功能性I類MHC分子、失活I(lǐng)I類分子、為一種或多種MHC分子的表達(dá)準(zhǔn)備條件、經(jīng)提高或抑制與細(xì)胞毒活性相關(guān)之基因的表達(dá)提高或失活胞毒能力等。
在某些情況下，特定克隆或寡克隆細(xì)胞可能是有意義的，這些細(xì)胞有特定的特異性，例如T細(xì)胞和B細(xì)胞即具有特定抗原特異性或保有靶位點(diǎn)特異性。
VII.配體包括天然發(fā)生的和合成的物質(zhì)在內(nèi)的多種多樣的配體均可用于本發(fā)明，以影響嵌合蛋白質(zhì)分子的低聚合。選擇配體的適用的和容易觀察或度量的標(biāo)準(zhǔn)是(A)配體是生理上可接受的(即對于它所用于的細(xì)胞或動物沒有過多的毒性)，(B)有合理的治療劑量范圍，(C)可望(用于整體動物，包括基因治療應(yīng)用時)能夠口服攝入(其在胃腸系統(tǒng)中是穩(wěn)定的，并且可被吸收到血管系統(tǒng)中)，(D)必要時可以穿越細(xì)胞和其他膜，并且(E)以適合所期望之應(yīng)用的親和性結(jié)合到受體區(qū)域上。第一個合乎需要的標(biāo)準(zhǔn)是除了其激活受體的能力之外，所用化合物在生理上是相對惰性的。配體與天然受體結(jié)合越少并目與天然受體結(jié)合之總配體的比例越低，則反應(yīng)越是正常。特具體地說，受體對天然蛋白質(zhì)不應(yīng)該有強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)。對大多數(shù)情況來說，受體將是非肽的和非核酸的。
對大多數(shù)主題化合物要有兩個或多個單位，這些單位可以是通過中心連接基團(tuán)連接在一起的相同或不同的單位。“單位”是能夠結(jié)合受體區(qū)的各個部分(如FK506、FK520、環(huán)孢菌素A、類固醇等)。至少在二聚體或較高級同聚物中，各單位通常通過相同的反應(yīng)性部分連接到連接基團(tuán)上。
如上文指出的，對于小的非蛋白質(zhì)有機(jī)分子有多種不同的天然存在的受體，這些小的有機(jī)分子都符合上述標(biāo)準(zhǔn)，并且可在不同的位點(diǎn)上二聚合以提供本發(fā)明的配體。只要保留有所需特異性的結(jié)合能力，即允許對這些化合物進(jìn)行實質(zhì)性修飾。許多化合物是大環(huán)的，例如大環(huán)內(nèi)酯。適宜的結(jié)合親和性將反映在Kd值低于10-4，較好低于10-6，更好低于約10-7，但結(jié)合親和性也可能低于10-9或10-10，并且在某些情況下是最合乎要求的。
普遍優(yōu)選的配體包括低聚物，通常是能夠與FKBP蛋白質(zhì)和/或親環(huán)素蛋白質(zhì)結(jié)合之化合物的二聚體。這樣的配體包括保留其與天然或誘變之結(jié)合區(qū)的結(jié)合能力的，環(huán)孢菌素A、FK506、FK520及雷帕霉素和其衍生物的同和異多聚體(通常是2-4個，更常見為2-3個單位)。這些化合物的許多衍生物部是已經(jīng)知道的，包括可用于本發(fā)明實踐中的合成的高親和性FKBP配體(例如參見Holt et al，J.Am.Chem.Soc.1993，115，9925-9935)。連接FK506和其類似物的有意義位點(diǎn)包括卷入從17至24位的環(huán)狀碳原子的位置，以及與這些環(huán)原子結(jié)合的取代基位置，如21(烯丙基)、22、37、38、39和40位或32位(環(huán)己基)，而除21位外同一位置對于FK520是有意義的。對于環(huán)孢菌素，有意義的位點(diǎn)包括MeBmt，位置3和位置8。
對配體修飾中特別有意義的是改變其結(jié)合特性，特別是就配體的天然存在的受體來說。同時，應(yīng)改變結(jié)合蛋白質(zhì)以適應(yīng)配體的改變。例如，可以用具有更大空間需要的基團(tuán)取代羥基，或者用有更大空間要求的基團(tuán)取代羰基或使羰基功能化，例如形成N取代的西夫堿或亞胺來修飾10位上的羰基，以加大該位置的空間體積，而對FK506的9和10位上基團(tuán)進(jìn)行修飾(參見Van Duyne et al(1991)Science252，839)，以便增強(qiáng)它們的空間要求。可以在這些位點(diǎn)上方便地引入的各種功能性基團(tuán)是形成醚的烷基基團(tuán)、酰氨基團(tuán)、N-烷化胺、2-羥乙基亞胺也可形成1，3-噁唑啉等。一般說來，取代基大約有1-6個，通常1-4個，更多是1-3個碳原子，且有1-3個，通常1-2個雜原子，這些雜原子一般是氧、硫、氮等?？墒褂镁哂谢窘Y(jié)構(gòu)的不同衍生物，產(chǎn)生對結(jié)合有不同構(gòu)型要求的不同配體。經(jīng)誘變受體，可以得到實質(zhì)上有相同序列的不同受體，所述受體對結(jié)構(gòu)上沒有明顯不同的經(jīng)修飾的配體有不同親和性。
可以使用的其他配體是類固醇。類固醇可以是低聚的，以致在沒有丟失其與含有一個或多個類固醇受體區(qū)之嵌合蛋白質(zhì)的結(jié)合能力的情況下，顯著地降低了它們的天然生物學(xué)活性。作為非限制性實施例，可以使用糖皮質(zhì)激素和雌激素。也可以使用多種藥物，已知這些藥物能夠以高親和力結(jié)合特定受體。在受體的結(jié)合區(qū)是已知的時尤其是這樣，因此允許在本發(fā)明的嵌合蛋白質(zhì)中只使用結(jié)合區(qū)，而不是整個天然受體蛋白質(zhì)。為此目的，可使用酶和酶抑制劑。
A.接頭連接中可包括多種不同的官能團(tuán)，例如酰胺基團(tuán)，包括碳酸衍生物、醚、酯、有機(jī)和無機(jī)酯、氨基等。為了提供連接，可經(jīng)氧化、羥化、取代、還原等修飾特定單體，以提供偶聯(lián)位點(diǎn)?？梢愿鶕?jù)不同單體、選擇不同的位點(diǎn)作為偶聯(lián)位點(diǎn)。
可用任何常規(guī)方法合成多聚配體，其中連接基團(tuán)是在并不干擾配體與受體在結(jié)合位點(diǎn)上的結(jié)合的位點(diǎn)。在生理學(xué)活性的活性位點(diǎn)和配體與受體區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)不同的情況下，一般可望在活性位點(diǎn)連接以失活配體?？梢岳枚喾N連接基團(tuán)，通常在兩分子之間的鏈中有1-30個、更好有大約1-20個原子(除氫以外)，其中連接基團(tuán)主要由碳、氫、氮、氧、硫和磷組成。連接基因可以包括各種官能團(tuán)，如酰胺和酯(有機(jī)和無機(jī)的)、胺、醚、硫醚、二硫化物、季銨鹽、肼等。鏈可包括脂族、無環(huán)、芳族或雜環(huán)基團(tuán)。可根據(jù)合成容易的和多聚配體的穩(wěn)定性來選擇鏈。因此，如果希望保留長期活性，可使用相對惰性的鏈，以使多聚配體鍵合不被裂解。另外，亦可只希望在血流中有短的半壽期，那么即可利用易于被裂解的各種基團(tuán)，例如酯和酰胺，特別是肽，其中循環(huán)的和/或細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶能夠裂解連接基團(tuán)。
可利用各種基團(tuán)作為配體間的連接基團(tuán)，例如通常有2至20個碳原子的亞烷基，通常有4至18個碳原子的氮雜亞烷基(其中氮通常是在兩個碳原子之間)、通常有6至2 4個碳原子的N-亞烷基氮雜亞烷基(見上文)、通常有6至18個碳原子的亞芳基、通常有8至24個碳原子的芳二亞烷基(ardialkylene)、通常有8至36個碳原子的雙-羧酰氨基亞烷基等。說明性的這類基團(tuán)包括亞癸基、亞十八烷基、3-氮雜亞戊基、5-氮雜亞癸基、N-亞丁基、5-氮雜亞壬基、亞苯基、亞二甲苯基、對二亞丙基苯、雙-苯甲?；?，8-二氨基辛烷等?？墒褂孟挛膶嵤├忻枋龅牟牧虾头椒?，用攜帶相應(yīng)受體區(qū)的本發(fā)明嵌合蛋白質(zhì)估計上述含接頭部分的多價或其他(詳見下述)配體分子。
B.配體特征對于細(xì)胞內(nèi)結(jié)合區(qū)，應(yīng)選擇能夠以生物活性形式跨膜轉(zhuǎn)移的配體，即該配體是可透過膜的。多種配體都是疏水的或者是可以經(jīng)用親脂基團(tuán)進(jìn)行適當(dāng)修飾而制成的。具體地說，可經(jīng)提供約有12至24個碳原子脂族側(cè)鏈來利用連接橋提高配體的親脂性。另外，亦可提供一個或多個將提高跨膜運(yùn)輸能力的，而又希望沒有核內(nèi)體形成的基團(tuán)。
在某些例子中，不必使用多聚配體。例如，在兩個不同的結(jié)合位點(diǎn)供受體二聚時，可以使用分子。在其他例子中，配體的結(jié)合可導(dǎo)致受體區(qū)的構(gòu)型改變，例如使受體低聚合而導(dǎo)致活化。誘導(dǎo)信號的其他一些機(jī)制也是可以發(fā)揮效力的，例如結(jié)合具有構(gòu)象改變而導(dǎo)致胞質(zhì)區(qū)域激活的單一受體。
如本文別處所討論的，能夠發(fā)動如靶基因轉(zhuǎn)錄的任何任選的其他細(xì)胞過程的配體應(yīng)優(yōu)選被選擇為不能與工程細(xì)胞中的初級嵌合蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)以啟動細(xì)胞程序死亡。
C.配體拮抗物可以使用單體配體逆轉(zhuǎn)多聚配體的作用，即防止、抑制或破壞低聚體的形成或維持。因此，如果希望迅速終止細(xì)胞激活的效應(yīng)，可以使用單體配體。可以使用同樣方法，在如多聚體的相同位點(diǎn)方便地修飾母配體部分，不同的是用單功能化合物取代多功能化合物。可使用有2到20個(它們可以更長)，通常有2至12碳原子的單胺，如乙胺、己胺、芐胺等代替多胺。另外，在母體化合物沒有過多不期望的生理學(xué)活性(如免疫抑制、有絲分裂、毒性等)的情況(或劑量水平)下，可以使用單價母體化合物。
D.舉例說明性的同可與含補(bǔ)償性突變之突變受體結(jié)合的“隆起塊”異低聚(HED)和同低聚(HOD)的試劑如上文討論的，由于在經(jīng)修飾的HED/HOD試劑上存在與受體之結(jié)合“袋”中的側(cè)鏈殘基進(jìn)行空間碰撞的取代基(“隆起塊”)，所以可以制備這種不能與其野生型受體(如FKBP12)發(fā)生可估計的結(jié)合的經(jīng)修篩的HED/HOD試劑。也可以制得在干擾殘基上包含突變(“補(bǔ)償性突變”)的相應(yīng)受體，并因此而獲得與帶“隆起塊”之配體結(jié)合的能力。使用“形成隆起塊的”配體部分和攜帶補(bǔ)償性突變的受體區(qū)域，會提高我們的試劑的特異性并進(jìn)而提高其效力。形成隆起塊的試劑不會與內(nèi)源性、野生型受體結(jié)合，其另外可以對基于天然配體部分的二聚體起到“緩沖劑”作用。另外，新的受體-配體對的產(chǎn)生同時將會產(chǎn)生將在需要異二聚化時使用的HED試劑。例如，可以使HED試劑誘導(dǎo)syntaxin(一種漿膜融合蛋白質(zhì))與synaptobrevin(一種泡囊膜融合蛋白質(zhì))的異二聚，而實現(xiàn)受調(diào)節(jié)的泡囊融合。這不僅提供了一種研究工具，而且也可作為使用經(jīng)適當(dāng)修飾的分泌細(xì)胞對糖尿病進(jìn)行基因治療的基礎(chǔ)。
作為“形成隆起塊的FK1012s”的一個實例，我們制備了FK506的C10乙酰胺和甲酰胺衍生物。有關(guān)FK1012s A-C和FK506M的合成的其他詳細(xì)內(nèi)容可參見圖16A和我們的報導(dǎo)，Spencer et al，“Controlling Signal Transduction with Synthetic Ligands”，Science262，(1993)1019-1024。我們選擇制備兩類形成隆起塊的FK1012s一類在C10上有隆起，一類在C9上有隆起。已按照圖16B中所示的反應(yīng)順序合成了FK506之C10乙酰胺和甲酰胺的R和S異構(gòu)體。這些帶隆起的衍生物在它們對FKBP12的結(jié)合親和性失去了至少3個數(shù)量級(圖16B)。檢測衍生物抑制FKBP12旋轉(zhuǎn)異構(gòu)酶(rotamase)的活性來確定親和性。
第二類C9帶隆起塊之衍生物的一個實例是已按已知方法(參見例如Fisher et al.J.Org.Chem.56，8(1991)2900-7和Edmunds et al.Tet.Lett.32，48(1 991)819-820)制得的螺-環(huán)氧化物(如圖16C中所示)。令人特別感興趣的C9衍生物系列的特征在于它們的sp3雜化和在C9上的還原的氧化狀態(tài)。已按照圖16C中所示的反應(yīng)合成了幾種這樣的化合物。
應(yīng)理解到的是，異二聚體(或其他異低聚體)須按不同于同二聚體的方法構(gòu)成，否則至少在應(yīng)用中同二聚體污染時可能會對其成功地應(yīng)用造成不利影響。圖16D中圖解顯示了為克服這一問題而發(fā)展的一個說明性的合成戰(zhàn)略。在含過量三乙胺的二氯甲烷中，使單alloc-保護(hù)的1，6-己二胺(Stahl et al，J.Org.Chem.43，11(1978)2285-6)與衍法形式的FK506偶聯(lián)，以44％產(chǎn)率得到alloc-胺-取代的FK506?，F(xiàn)在即可將該中間產(chǎn)物用于與任何活化的FK506(或帶隆起塊的FK506)分子偶聯(lián)。在室溫THF中雙甲酮存在下，用催化性四聯(lián)-三苯基膦鈀去保護(hù)，除去胺保護(hù)基團(tuán)。立即用活化的FK506衍生物處理，然后脫甲硅基而產(chǎn)生二聚產(chǎn)物。已使用該技術(shù)合成了說明性的HOD和HED試劑。
E.說明性的環(huán)孢菌素試劑環(huán)孢菌素A(CsA)是以高親和力(6nM)與其細(xì)胞內(nèi)受體親環(huán)素——一種13kDa單體蛋白質(zhì)-結(jié)合的環(huán)十一肽。所得到的復(fù)合物如FKBP12-FK506復(fù)合物，與蛋白質(zhì)磷酸酶calcineurin結(jié)合并使之失活，進(jìn)而導(dǎo)致藥物的免疫抑制性質(zhì)。作為本發(fā)明的另一個說明性實例，我們以6個步驟通過其MeBmtl測鏈二聚合了CsA，并以35％的總產(chǎn)率得到(CsA)2(圖17，按Eberle et al，J.Org.Chem.57，9(1992)2689-91中報導(dǎo)的方法進(jìn)行步驟1-4)。同F(xiàn)K1012s一樣，選擇二聚位點(diǎn)以使所得的二聚體與兩個親環(huán)素分子結(jié)合而又不能在結(jié)合親環(huán)素后與calcineurin結(jié)合。我們已證明(CsA)2以1∶2的化學(xué)計算量用親環(huán)素A結(jié)合。因此，(CsA)2同F(xiàn)K1012s一樣，并不抑制信號傳輸途徑并因而沒有免疫抑制作用和毒性。
VIII.靶基因A.轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域靶基因構(gòu)建體在5′區(qū)域具有反應(yīng)性元件，如上文所討論的，其可能是通過產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始信號，對配體介導(dǎo)的嵌合受體蛋白質(zhì)的低聚合作用發(fā)生反應(yīng)。因此，必須選擇至少一個由胞質(zhì)區(qū)域直接或間接激活的或者可通過兩個區(qū)域的聯(lián)系而激活的轉(zhuǎn)錄起始系統(tǒng)，例如轉(zhuǎn)錄因子。還必須選擇至少一個對所得到的轉(zhuǎn)錄起始系統(tǒng)起反應(yīng)的啟動子區(qū)域。需要選擇啟動子區(qū)域或在其轉(zhuǎn)錄控制下的基因。換句話說，可以基于作用區(qū)域通過給定的啟動子或反應(yīng)性元件在起始轉(zhuǎn)錄中所起的作用，來選擇嵌合蛋白質(zhì)的作用區(qū)(由“第一”系列構(gòu)建體編碼)(如參見上文V(A)部分“胞質(zhì)區(qū)域”)。
在知道反應(yīng)性元件的情況下，即可使其包括在靶基因構(gòu)建體中，以便為整合到基因組中(以游離基因形式或經(jīng)染色體摻入)提供表達(dá)盒。只要知道在天然配體結(jié)合到含有胞質(zhì)區(qū)的蛋白質(zhì)上之后由胞質(zhì)區(qū)轉(zhuǎn)錄激活的基因，便不必去分離反應(yīng)性元件的特定序列。然后可以使用同源重組將有意基因插入啟動子區(qū)的下游以使之處于內(nèi)源性啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。如特異的反應(yīng)性元件序列是已知的，可以將其與不同的、可以在轉(zhuǎn)錄速度上有高或低的活性以及結(jié)合特定的轉(zhuǎn)錄因子等其他表現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相連接。
因此，表達(dá)構(gòu)建體將在其轉(zhuǎn)錄方向的5′端有允許誘導(dǎo)有用靶基因，通常是治療性基因轉(zhuǎn)錄起始的反應(yīng)性元件和啟動子序列。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)不是那么重要，其可通過插入用于降低mRNA穩(wěn)定性的AU序列，用以提高短半壽期mRNA的半壽期或制得短半壽期的mRNA，并因此而限制蛋白質(zhì)作用的時間?？梢岳萌魏翁峁┍匾霓D(zhuǎn)錄終止，以及在需要時提供翻譯終止的任何區(qū)域。
反應(yīng)性元件可以是單一序列或者可以是低聚合的，通常具有不超過約5次重復(fù)，更多是有大約3次重復(fù)。
也可以使用同源重組除去或失活內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄控制序列(包括對低聚合過程有反應(yīng)的啟動子和/或反應(yīng)性元件)，和/或在所需內(nèi)源性基因上游插入這樣的反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄控制序列。
B.產(chǎn)物可以利用多種基因作為靶基因，包括編碼有意義蛋白質(zhì)的基因或有意義的反義序列或有意義的核酶(ribozyme)。靶基因可以是提供所需表型的任何有用序列。靶基因可以表達(dá)表面膜蛋白質(zhì)、分泌的蛋白質(zhì)、胞質(zhì)蛋白質(zhì)，或者是可表達(dá)不同類型產(chǎn)物的多個靶基因。靶基因可以是反義序列，該序列可通過抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)而調(diào)節(jié)特定途徑，或者通過抑制某途徑中抑制物的翻譯而開通該特定途徑。靶基因可編碼核酶，該核酶可以通過在RNA水平上干擾相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的表達(dá)，或干擾特定途徑之抑制物的表達(dá)來調(diào)節(jié)特定途徑。被單一地或聯(lián)合地表達(dá)的蛋白質(zhì)可以牽涉到尋靶(homing)、細(xì)胞毒性、增殖、免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、凝血或血凝塊溶解、體液調(diào)節(jié)等過程。所表達(dá)的蛋白質(zhì)可以是天然存在的蛋白質(zhì)，天然蛋白質(zhì)的突變體、獨(dú)特序列或其組合形式。
基因可以是由細(xì)胞分泌的任何基因，從而可隨意制得期望得到的或宿主必需的被編碼的產(chǎn)物。多種被分泌的產(chǎn)物包括激素，如胰島素、人生長激素、胰高血糖素、垂體釋放因子、ACTH、促黑激素、松弛素等；生長因子，如EGF、IGF-l、TGF-α、-β、PDGF、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、FGF、促紅細(xì)胞生成素、巨核細(xì)胞刺激和生長因子等；白細(xì)胞介素，如JL-1至-13；TNF-α和-β等；以及酶，如組織血纖維蛋白溶酶原激活物、補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)成員、perforins、超氧化物歧化酶、凝血因子、抗凝血酶-III、因子VIIIc、因子VIIIvW、α-抗胰蛋白酶、蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、內(nèi)啡呔、dynorphin、骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)、CFTR等。
基因可以是任何天然的或經(jīng)導(dǎo)入適當(dāng)信號肽及跨膜序列而制得之表面膜蛋白質(zhì)的基因。各種各樣的蛋白質(zhì)可以包括尋靶受體，如L-選擇素(Mel-14)、血液相關(guān)蛋白質(zhì)，特別是有kringle結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，如因子VIIIc、因子VIIIvW，造血細(xì)胞標(biāo)志物，如CD3、CD4、CD8、B細(xì)胞受體、TCR亞單位α、β、γ、6、CD10、CD19、CD28、CD33、CD38、CD41等；受體，如白細(xì)胞介素受體IL-2R、IL-4R等；離子如H+、Ca+2、K+、Na+、Cl-等流入或流出的通道蛋白質(zhì)；CFTR、酪氨酸激活基序、ζ激活蛋白質(zhì)等。
為了向泡囊運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)以便發(fā)生胞吐，可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾。加進(jìn)來自某蛋白質(zhì)的被引向泡囊的序列，在這里修飾該序列使之接近一個或另一個末端，或位于與蛋白質(zhì)來源相似的位置，以將被修飾的蛋白被導(dǎo)向泡囊中高爾基氏器進(jìn)行包裝。這一過程與存在胞吐作用的嵌合蛋白質(zhì)相結(jié)合，即可將蛋白質(zhì)迅速地輸向細(xì)胞外介質(zhì)，并達(dá)到相對高的定位濃度。
另外，具體根據(jù)宿主細(xì)胞的性質(zhì)，一些細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)可能是有意義的，例如代謝途徑中的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、類固醇受體、轉(zhuǎn)錄因子等。上文指出的某些蛋白質(zhì)也可以作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)存在。
下面是不同基因的少數(shù)實例。在T細(xì)胞中，可能希望導(dǎo)入編碼一條或兩條T細(xì)胞受體鏈的基因。對于B細(xì)胞，可以提供用于分泌作用的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈。對于皮膚細(xì)胞，例如角質(zhì)形成細(xì)胞，特別是干細(xì)胞角質(zhì)形成細(xì)胞，可以通過分泌α-、β或γ-干擾素、抗趨藥性因子、對細(xì)菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)特異的蛋白酶等而提供防止感染保護(hù)作用。
除了提供有治療價值之基因的表達(dá)外，有許多情況下可希望將細(xì)胞導(dǎo)向特定部位。這些部位可包括解剖部位，如淋巴結(jié)、粘膜組織、皮膚、滑囊、肺或其他內(nèi)部器官等，或者是例如凝血、損傷部位、外科處理部位、炎癥、感染等功能性部位。經(jīng)提供在宿主靶部位對天然存在之表位的結(jié)合，以提供可將宿主細(xì)胞引向特定部位之表面膜蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而可使分泌的產(chǎn)物達(dá)到局部化的濃度。有用蛋白質(zhì)包括尋靶受體，如L-選擇素(Selectin)，GMP140、CLAM-1等；或地址素，如ELAM-1、PNAd、LNAd等；血塊結(jié)合蛋白質(zhì)，或?qū)吽幰蜃拥木植炕荻确磻?yīng)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。在許多情況下可希望將細(xì)胞導(dǎo)向特定部位，并在該部位釋放出治療產(chǎn)物，這將是有很大價值的。
在許多情況下可能希望能夠殺死經(jīng)修飾的細(xì)胞，例如希望終止對細(xì)胞的處理，細(xì)胞已變得不合乎需要，例如變?yōu)橹铝鲂约?xì)胞，或者細(xì)胞應(yīng)完成的使命已經(jīng)完成，它們的繼續(xù)存在已無必要。本發(fā)明的經(jīng)修飾細(xì)胞能夠表達(dá)初級嵌合蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)含有如Fas抗原或TNF受體的胞質(zhì)區(qū)的區(qū)域(Watanable-Fukunaga et al.，Nature(1992)356，314-317)。將細(xì)胞暴露于能使初級嵌合體低聚合化的配體之后，通過細(xì)胞程序死亡可容易地消除本發(fā)明經(jīng)修飾的細(xì)胞。使用常規(guī)材料和方法將編碼初級嵌合體的構(gòu)建體設(shè)計成可組成型表達(dá)，從而使經(jīng)修飾的細(xì)胞在其表面上有或在其胞質(zhì)中存在這樣的蛋白質(zhì)。此外，也可以提供受控制的表達(dá)，此時相同或不同的低聚合配體均可發(fā)動表達(dá)初級嵌合體和開始自然死亡過程。通過在胞質(zhì)中提供Fas抗原或TNF受體的胞質(zhì)部分-其中所說的胞質(zhì)部分連接到與有意靶基因表達(dá)相關(guān)之結(jié)合區(qū)域不同的結(jié)合區(qū)域上，即可在受控制的條件下殺死被修飾的細(xì)胞。
C.闡述性舉例作為舉例說明，可按下述方法處理心臟病人或易患中風(fēng)的病人。將按本文所述方法修飾的細(xì)胞施予病人并保留相當(dāng)長的時間。舉例的細(xì)胞包括漿細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞或其他造血細(xì)胞。應(yīng)修飾細(xì)胞使之表達(dá)與血凝塊結(jié)合的蛋白質(zhì)，例如有kringle區(qū)域結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，或粘附性相互作用的蛋白質(zhì)如CD41，并表達(dá)凝塊溶解蛋白質(zhì)，如組織血纖維蛋白溶酶原激活物、鏈激酶等。以這種方式，在配體介導(dǎo)的低聚合后，細(xì)胞在血塊部位積聚并提供高定位濃度的血栓溶解蛋白質(zhì)。
另一個例子是再灌注損傷?？梢岳糜邢薨雺燮诘募?xì)胞，例如巨噬細(xì)胞或多形核白細(xì)胞(“嗜中性細(xì)胞”)。細(xì)胞具有嗜中性細(xì)胞尋靶受體以將細(xì)胞引向再灌注損傷的部位。細(xì)胞也可表達(dá)超氧化物歧化酶，以破壞單氧并抑制自由基對組織的侵害。
第三個例子是自體免疫性疾病。可利用長半壽期的細(xì)胞，例如T細(xì)胞。構(gòu)建體將提供尋找自身免疫損傷部位的尋靶受體、并對引起損傷的細(xì)胞進(jìn)行胞毒性攻擊。然后治療即針對引起損傷的細(xì)胞發(fā)揮作用。另外，可以提供分泌可溶性受體或其他肽或蛋白質(zhì)的條件，其中分泌產(chǎn)物將抑制對引起損傷之細(xì)胞的活化或誘導(dǎo)無反應(yīng)性。另一種可替代的手段是分泌可用于減小退化作用的抗炎產(chǎn)物。
第四個例子包括通過包裹用內(nèi)啡肽治療慢性疼痛。用其中以嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)控制人內(nèi)啡肽轉(zhuǎn)錄的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞的原株。DNA構(gòu)建體由TATAAA位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的HNF-1*轉(zhuǎn)錄因子GTTAAGTTAAC的3個結(jié)合位點(diǎn)拷貝組成。內(nèi)啡肽cDNA將被插入到起始位點(diǎn)的下游，多腺苷酸和終止序列的上游。任選地，內(nèi)啡肽cDNA裝備有“PEST”序列以使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，或者在mRNA的3′非翻譯區(qū)中有AUUA序列以使其被快速降低。
也用有兩個轉(zhuǎn)錄單位的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，其中之一將編碼截短的HNF-1*cDNA，以正好編碼從氨基酸1到250的DNA結(jié)合序列，后者偶聯(lián)到處于在成纖維細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)起始和終止區(qū)之轉(zhuǎn)錄和翻譯控制下的三聚FKBP結(jié)合區(qū)域上。構(gòu)建體應(yīng)包括一個附加的轉(zhuǎn)錄單位，后者是由偶聯(lián)到三聚FKBP′結(jié)合區(qū)上的指導(dǎo)衍生于HNF-4之轉(zhuǎn)錄激活區(qū)產(chǎn)生的同一調(diào)節(jié)區(qū)域驅(qū)動的(該最好部分意欲改變FKBP以nM濃度結(jié)合到經(jīng)修飾的FK506上。此修飾抑制了與內(nèi)源性FKBP的結(jié)合)。
可包裹這些總體上修飾的細(xì)胞以抑制免疫識別，并放在病人的皮下或其他方便的體內(nèi)部位。當(dāng)病人需要疼痛藥物治療時，給病人使用二聚配體FK506-FK506′，給予大約1μg至1mg應(yīng)是足夠的。以這種方式可以在無須注射或沒有成癮危險的情況下提供止痛效果。
第五個例子是治療骨質(zhì)疏松?？梢钥寺U(kuò)增淋巴細(xì)胞或培養(yǎng)生長來自待治療病人的皮膚成纖維細(xì)胞。按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，其中用骨形態(tài)形成因子cDNA基因取代內(nèi)啡肽基因。對于淋巴細(xì)胞，可以使用抗原特異性克隆，以允許用抗sIg之獨(dú)特型抗體破壞之。另外，給予sIg的抗原將會擴(kuò)充細(xì)胞群體，以增加可被釋放之蛋白質(zhì)的量。可注入淋巴細(xì)胞克隆并給予產(chǎn)生骨形態(tài)形成因子所需的配體。監(jiān)測對配體的反應(yīng)，并可根據(jù)監(jiān)測的結(jié)果調(diào)整所產(chǎn)生的骨形態(tài)形成因子的量，以便將劑量調(diào)到所需要的水平。
另一種情況是修飾抗原特異性T細(xì)胞，此時可以為激活細(xì)胞而激活蛋白質(zhì)的表達(dá)。其中T細(xì)胞受體可能是直接針對腫瘤細(xì)胞、病原體、細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫等的。通過提供細(xì)胞的激活，例如象IL-2這樣的白介素即可在對配體反應(yīng)中用于擴(kuò)充被修飾的T細(xì)胞。被修飾之T細(xì)胞的其他應(yīng)用可包括表達(dá)將T細(xì)胞導(dǎo)向特定部位的尋靶受體，由此可望實現(xiàn)細(xì)胞毒性、靶細(xì)胞例如上皮細(xì)胞表面膜蛋白質(zhì)的向上調(diào)節(jié)，或其他所需的生物學(xué)過程。
另外可能要求向靶部位釋放高劑量的胞毒性因子。例如，在通過尋靶受體識別腫瘤抗原后，可以激發(fā)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)釋放出毒性濃度的TNF或其他相似產(chǎn)物。
另一種可替代的應(yīng)用是輸出被胞吐的激素或因子。在提高了胞吐作用的情況下，將會輸出更大量的激素或因子；此外，如果有一個基于胞質(zhì)中激素或因子的量的反饋機(jī)制，則將增加激素或因子的產(chǎn)生?；蛘?，可以提供誘導(dǎo)的激素或因子的表達(dá)，以致能夠相伴隨地誘導(dǎo)表達(dá)和輸出。
也可以供給在保留的體液如血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、腦脊液等中的蛋白質(zhì)。經(jīng)修飾可以具有延長了在宿主中之半壽期的細(xì)胞，例如造血細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、肌細(xì)胞等，特別是干細(xì)胞，蛋白質(zhì)即可更長時間地保留在體液中。可以用提供分泌或胞吐作用的構(gòu)建體來修飾細(xì)胞。適于實現(xiàn)分泌的構(gòu)建體應(yīng)具有作為轉(zhuǎn)位區(qū)的信號肽，并且在使用其他嵌合蛋白質(zhì)的情況下則具有結(jié)合區(qū)和作用區(qū)。作用區(qū)可得自于相同或不同的蛋白質(zhì)。例如，就組織血纖維蛋白溶酶原激活物來說，其可以有凝塊結(jié)合區(qū)為一個作用區(qū)，并有血纖維蛋白溶酶原活性位點(diǎn)為另一個不同的作用區(qū)。另外，也可以利用結(jié)合蛋白質(zhì)，例如LFA-1作為一個作用區(qū)并用選擇素作為第二個作用區(qū)，從而提高了對自動尋標(biāo)的阻斷。通過修飾蛋白質(zhì)例如整聯(lián)蛋白、T細(xì)胞受體、sIg等的亞單位，可以提供能夠聚集并與某分子結(jié)合的可溶形式的表面膜蛋白質(zhì)。其他機(jī)會是補(bǔ)體蛋白質(zhì)、參與凝血的血小板膜蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面上的自體抗原，以及感染劑表面上的病原體分子。
IX.構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)本文所述的構(gòu)建體可以作為一個或多個DNA分子或其構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中，這些構(gòu)建體中通常至少有一個標(biāo)志物并可能有兩個或多個標(biāo)志物，借以選擇含有構(gòu)建體的宿主細(xì)胞?？梢杂贸Ｒ?guī)方法制備構(gòu)建體，包括分離基因和調(diào)節(jié)區(qū)，適當(dāng)情況下經(jīng)連接后克隆到適當(dāng)?shù)目寺∷拗髦?，并?jīng)限制性酶切或序列測定分析或其他常規(guī)手段分析之。具體地說，可以利用PCR，分離包含全部或部分功能性單位的個別片段，其中可以使用“引物修補(bǔ)”、并在必要時利用連接、體外誘變等手段引入一個或多個突變。在完成構(gòu)建并證明所得構(gòu)建體具有適當(dāng)?shù)男蛄泻?，即可用任何常?guī)方法將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中?？梢詫?gòu)建體整合并包裝到非復(fù)制的、有缺陷的病毒如腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)或單純性皰疹病毒(HSV)或其他病毒，包括反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組中，以感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。如果需要的話，構(gòu)建體可以包括轉(zhuǎn)染的病毒序列。或者，也可以借助融合、電穿孔、biolistics、轉(zhuǎn)染、脂染等技術(shù)導(dǎo)入構(gòu)建體。在導(dǎo)入構(gòu)建體之前，通常要培養(yǎng)宿主細(xì)胞并在培養(yǎng)物中擴(kuò)充之，然后經(jīng)適當(dāng)處理以導(dǎo)入構(gòu)建體并整合該構(gòu)建體。擴(kuò)展細(xì)胞并借助存在于構(gòu)建體中的標(biāo)志物篩選之?？杀怀晒Φ厥褂玫母鞣N標(biāo)志包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。
在某些情況下，可以有同源重組的靶位點(diǎn)，其中可望在特定位點(diǎn)整合構(gòu)建體。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的同源重組的材料和方法，“擊倒”(knock-out)內(nèi)源基因并用構(gòu)建體編碼基因取代之(在同一位點(diǎn)或其他位點(diǎn))。另外，可以修飾對信號起始區(qū)起反應(yīng)之內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，而不是提供基因。在這樣的實施方案中，可經(jīng)給予配體來控制如EPO、tPA、SOD等內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。對于同源重組，可以使用Ω或O-載體(例如參見Thomas and Capecchi，Cell(1987)51，503-512；Mansour，et al.，Nature(1988)336，348-352；Joyner，et al.，Nature(1989)338，153-156)。
構(gòu)建體可以作為編碼所有基因的單一DNA分子，或有一個或多個基因的不同DNA分子被導(dǎo)入?？梢酝瑫r或相繼地導(dǎo)入各有相同或不同標(biāo)志物的構(gòu)建體。在一實例中，一個構(gòu)建體含有處于特異性反應(yīng)元件控制下的治療基因(如NFAT)，另一個則編碼含有融合到配體受體區(qū)(如在MZF3E中的)上之信號發(fā)生區(qū)的受體融合蛋白質(zhì)。也可以導(dǎo)入編碼尋靶受體或增加治療產(chǎn)物之釋放效率的其他產(chǎn)物的第三個DNA分子。
可用于制備構(gòu)建體DNA貯備物并完成轉(zhuǎn)染的含有細(xì)菌或酵母復(fù)制原點(diǎn)、可選擇和/或可擴(kuò)增標(biāo)志、在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)所需之啟動子/增強(qiáng)子元件等有用元件的載體是本領(lǐng)域中已知的，并且可以市場上購得。
X.細(xì)胞和配體的施用使已用DNA構(gòu)建體修飾的細(xì)胞在選擇條件下在培養(yǎng)基中生長，然后可擴(kuò)充根據(jù)其含有構(gòu)建體而選擇的細(xì)胞，并使用例如聚合酶鏈反應(yīng)檢測宿主細(xì)胞中構(gòu)建體的存在而進(jìn)一步分析之。一旦鑒定了被修飾的宿主細(xì)胞之后，即可按計劃使用之，如培養(yǎng)這些細(xì)胞或?qū)胨拗魃矬w中。
然后可根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)，以多種不同的方法將細(xì)胞導(dǎo)入宿主生物體，如哺乳動物體中。通常以至少約104個細(xì)胞，一般不超過約1010個，較好不超過約108個細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)將造血細(xì)胞注射到血管系統(tǒng)內(nèi)。所使用的細(xì)胞數(shù)目將取決于多種環(huán)境條件、導(dǎo)入的目的、細(xì)胞的半壽期、待使用的程序例如給予的次數(shù)、細(xì)胞增殖的能力、治療劑的穩(wěn)定性、對治療劑的生理需要等因素。另外，皮膚細(xì)胞可以作為移植物使用，其細(xì)胞數(shù)目取決于待施用于燒傷或其他損傷上的細(xì)胞層的大小。一般說來，成肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目至少約104個且不超過大約108個，并且可作為分散體施用，一般是注射到感興趣的部位或其附近。細(xì)胞一般都是存在于生理上可接受的培養(yǎng)基中。
在許多情況下可希望在體內(nèi)修飾細(xì)胞而不是在體外修飾細(xì)胞。為此目的，已開發(fā)了多種不同的體內(nèi)修飾靶組織和細(xì)胞的技術(shù)。已開發(fā)了許多病毒載體，如可以將病毒轉(zhuǎn)染和隨機(jī)整合到宿主中的腺病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒(例如參見Dubensky et al.(1 984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，7529-7533；Kaneda et al.，(1989)Science 243，375-378；Hiebertet al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，3594-3598；Hatzoglu et al.(1990)J.Biol.Chem.265，17285-17293和Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，8377-8381)。載體可經(jīng)血管內(nèi)或肌肉內(nèi)注射、吸入或其他胃腸道外方式使用。
按照體內(nèi)遺傳修飾，修飾的方法取決于組織的性質(zhì)、所需的細(xì)胞修飾的效力、修飾特定細(xì)胞的機(jī)會、組織對被導(dǎo)入這DNA組合物的可接近性等。應(yīng)用攜帶靶轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的被減毒或修飾的反轉(zhuǎn)錄病毒后，必要時可使用本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建體之一來活化病毒，從而可以產(chǎn)生病毒并轉(zhuǎn)染相鄰的細(xì)胞。
DNA導(dǎo)入不一定在每種情況下部導(dǎo)致整合。在某些情況下短暫保留被導(dǎo)入的DNA即可滿足需要。以這種方式可使被導(dǎo)入的DNA具有短期效應(yīng)，這種情況下可將細(xì)胞導(dǎo)入宿主體內(nèi)并經(jīng)過預(yù)定時間后，例如當(dāng)細(xì)胞已能夠定位到特定部位后開通其活性機(jī)制。
然后可根據(jù)需要使用激活胞質(zhì)區(qū)的配體?？筛鶕?jù)配體的結(jié)合親和性、所需的反應(yīng)、施用方式、細(xì)胞半壽期、所存在的細(xì)胞數(shù)目的不同，使用多種不同的方法。配體可以以胃腸道外或口服途徑使用?？筛鶕?jù)上述因素確定給藥次數(shù)。配體可以作為藥丸、粉末、或分散體給口服攝入，或口頰內(nèi)、舌下含服；血管內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下注射；吸入等途徑使用?？墒褂帽绢I(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和材料來配制適于各種途徑給藥的配體(及單體化合物)。給藥的精確劑量和特定方法將取決于上述因素，并可由臨床醫(yī)生或人或動物保健提供者來確定。在大多數(shù)情況下，給藥方式將根據(jù)經(jīng)驗確定。
在欲逆轉(zhuǎn)由配體激活的過程時，可以給予單體化合物或其它能與配體競爭的信號結(jié)合位點(diǎn)化合物。因此，在有不利反應(yīng)或期望終止治療效果的情況下，可以以任何方便的方式，特別是經(jīng)血管內(nèi)(如果希望快速逆轉(zhuǎn)的話)途徑使用單體結(jié)合化合物。此外，也可以在存在失活區(qū)(或轉(zhuǎn)錄沉默子)的情況下提供DNA結(jié)合區(qū)。在另一種方法中，通過本文別處所述的Fas或TNF受體發(fā)出信號使細(xì)胞程序死亡即可消除細(xì)胞。
可以按照治療劑量監(jiān)測程序來確定用于各種應(yīng)用之配體的特定劑量，其中可望在延長的時間里，例如大約兩周以上維持特定的表達(dá)水平；或者在重復(fù)治療的情況下，以長的間隔期例如兩周或更長時間的間隔期，在短時間里給予單個或重復(fù)劑量的配體?？梢栽陬A(yù)定范圍內(nèi)給出配體的劑量并監(jiān)測反應(yīng)，以便得出時間-表達(dá)水平關(guān)系曲線，同時觀察治療反應(yīng)?？筛鶕?jù)在此期間觀察到的表達(dá)水平和治療反應(yīng)，按照反應(yīng)大小在下次提供更大或更小的劑量?？梢苑磸?fù)重復(fù)這一過程直到得到一個治療范圍內(nèi)的有效劑量。當(dāng)緩慢投用配體時，一旦確定了配體的維持劑量，即可以以延長的間隔期進(jìn)行檢測，從而確保該細(xì)胞系統(tǒng)是可以提供適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)和表達(dá)產(chǎn)物水平的。
值得注意的是，該系統(tǒng)受制于許多可變因素，如細(xì)胞對配體的反應(yīng)、表達(dá)效率以及必要時的分泌水平、表達(dá)產(chǎn)物的活性，病人的隨時間和環(huán)境而改變的特殊需要，以及因細(xì)胞丟失而丟失細(xì)胞活性的速度或個別細(xì)胞的表達(dá)活性等。因此，既使有可以對大的群體使用的一般性細(xì)胞，也期望對每個個別病人監(jiān)測其適當(dāng)?shù)膫€體劑量。
本方法學(xué)和組合物可用于治療多種病理狀況或病征。例如可用B和T細(xì)胞治療腫瘤、感染性疾病、代謝缺陷、心血管病、遺傳性凝血缺陷、自身免疫性疾病、關(guān)節(jié)退化性疾病，例如關(guān)節(jié)炎、肺部疾病、腎病、內(nèi)分泌異常等?？墒褂脿窟B結(jié)構(gòu)的各種細(xì)胞例如成纖維細(xì)胞和成肌細(xì)胞治療遺傳缺陷，如結(jié)締組織缺陷、關(guān)節(jié)炎、肝病等。在必須制得大量蛋白質(zhì)以補(bǔ)充缺陷或向肝炎或門脈循環(huán)中釋放治療產(chǎn)物的情況下，則可以使用肝細(xì)胞。
給出下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
實施例細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和評估實施例1經(jīng)交聯(lián)T細(xì)胞受體的CD3鏈誘導(dǎo)已分離的IL-2增強(qiáng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子將(1)用SspI和HindIII切割的pPL/SEAP(Berger，et al.，Gene(1988)66，1)；(2)用Nde I切割，用Klenow修成平頭，然后用PvuI切割的pSV2/Neo(Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.(1982)1，232)和(3)用PvuI與HindIII切割的各種含啟動子質(zhì)粒(即NFAT-CD8、B-CD8、cx121acZ-Oct-1、AP1-LUCIF3H，或cx15IL2)(如下所述)的三片段連接，制成含有處在人IL-2啟動子(-325至+47；MCB(86)6，3042)控制下之胎盤分泌的堿性磷酸酶基因的質(zhì)粒pSXNeo/IL2(IL2-SX)(圖1)，及相關(guān)質(zhì)粒變異體(即NFAT-SX，NF B-SX、OAP/Oct1-SX和AP-1-SX)-其中報導(dǎo)基因處于與含有各種啟動子元件(即分別是NFAT、NKB、OAP/Oct-1和AP1)的合成寡聚體結(jié)合的最小IL-2啟動子(-325至-294和-72至+47)的轉(zhuǎn)錄控制之下。NFAT-CD8含有NFAT結(jié)合位點(diǎn)(-286至-257；Gene and Dev.(1990)4，1823)的3個拷貝，且cx121acZ-Oct含有來自人IL-2增強(qiáng)子的OAP/Oct-1/(ARRE-1)結(jié)合位點(diǎn)(MCB，(1988)3，1715)的4個拷貝；B-CD8含有來自小鼠輕鏈之NF B結(jié)合位點(diǎn)(EMBO，(1990)9，4425)的3個拷貝，且AP1-LUCIF 3H含有來自金屬硫蛋白啟動子之AP-1位點(diǎn)(5′-TGACTCAGCGC-3′)的5個拷貝。
在各次轉(zhuǎn)染中，將5μg編碼嵌合受體TAC/TAC/Z(TTZ)(PNAS88，8905-8909)的表達(dá)載體pCDL-SR(MCB8，466-72)(Tac-IL2受體鏈)連同各種以分泌堿性磷酸酶為基礎(chǔ)的報導(dǎo)質(zhì)粒(見圖1中pSXNzo/IL2的基因圖)共轉(zhuǎn)染到TAg Jurkat細(xì)胞(用SV40大T抗原穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞系的衍生物[Northrup，et al.，J.Bi ol.Chem.，1993])中。各報導(dǎo)質(zhì)粒均含有用于最小IL-2啟動子內(nèi)不同IL-2增強(qiáng)子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子之結(jié)合位點(diǎn)的多聚合寡核苷酸，或者是報導(dǎo)基因的完整IL-2增強(qiáng)子/啟動子上游。24小時后，將細(xì)胞的等分樣品(約105個)放在含有對數(shù)稀釋度之結(jié)合的抗TAC(CD25)mAb(33B3.1；AMAC，Westbrook，ME)的微量滴定板小井中。作為陽性對照并控制轉(zhuǎn)染效率，向各次轉(zhuǎn)染的等分樣品中加入肌霉素(ionomycin)(1μm)和PMA(25ng/ml)。繼續(xù)保溫14小時后，檢測上清液中的堿性磷酸酶活性，以及相對于陽性對照組樣品所表達(dá)的這些活性。加入1ng/ml FK506，所有活性均由于NFAT而降到本底水平，證明失活作用是以用FK506阻斷的同樣途徑發(fā)生的。所得到的各數(shù)據(jù)點(diǎn)都是兩份樣品的平均值，并且?guī)状螌嶒灳玫较嗨频慕Y(jié)果(見圖5)。數(shù)據(jù)表明，用已知的細(xì)胞外受體，得到報導(dǎo)基因和不同增強(qiáng)子的適當(dāng)反應(yīng)。當(dāng)使用抗TcR復(fù)合物(即OKT3)MAb時得到了相似的結(jié)果。
實施例2免疫抑制劑藥物FK506和環(huán)孢菌素A(CsA)或二聚衍生化合物FK1012A(8)、FK1012B(5)、CsA二聚體(PB-1-218)的抑制活性向105個TAg-Jurkat細(xì)胞中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。另外，加入各種滴定度的不同藥物。5小時后在溫和去污劑(即Triton X-100)中溶解細(xì)胞并使提取物與β-半乳糖苷酶底物，MUG(甲基半乳糖苷基繖形酮)一起保溫1小時。加入甘氨酸/EDTA停止緩沖液并檢測提取物的熒光值。所得到的每個數(shù)據(jù)點(diǎn)都是兩份樣品的平均值，并且?guī)状螌嶒灦嫉玫较嗨频慕Y(jié)果。令人驚奇的是，F(xiàn)K1012B在最高濃度(即5μg/ml)似乎可稍微放大促細(xì)胞分裂素活性；但對照實驗則顯示單獨(dú)FK1012B沒有刺激作用(見圖6)。
實施例3二聚FK506衍生物FK1012A對嵌合FKBP12/CD3(1FK3)受體的活性5μg含有嵌合受體(1FK3)的真核表達(dá)載體pBJ5(基于在16S拼接位點(diǎn)和poly A位點(diǎn)間插入了多接頭的pCDL-SR)與4μgNFAT可誘導(dǎo)地分泌堿性磷酸酶的報導(dǎo)質(zhì)粒NFAT-SX進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在平行的轉(zhuǎn)染中，使用5μg pBJ5代替1FK3/pBJ5作為對照。24小時后，將含有約105個細(xì)胞的各轉(zhuǎn)染實驗的等分樣品與如上指出的對數(shù)稀釋度的藥物FK1012A一起保溫。作為陽性對照并為了控制轉(zhuǎn)染效率，向各轉(zhuǎn)染的等分樣品中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。繼續(xù)保溫14小時后，檢測上清液的堿性磷酸酶活性和相對于陽性對照樣品的被表達(dá)的這些活性。加入2ng/ml FK506使所有刺激作用降至本底水平，證明活化是以與用FK506阻斷一樣的途徑進(jìn)行的。因此，F(xiàn)K506或環(huán)孢菌素將作為使用這些化合物的有效解毒劑。所得到的各數(shù)據(jù)點(diǎn)均為兩份樣品的平均值，并且?guī)状螌嶒灦嫉玫搅讼嗨频慕Y(jié)果(見圖7)。
實施例4A二聚FK506衍生物FK1012B對肉豆蔻?；逗螩D3/FKBP12(MZF3E)受體的活性我們成功地證明了許多進(jìn)行配體設(shè)計與合成的辦法，包括用稱為“FK1012”的基于FK506的HOD試劑得到的陽性結(jié)果。我們已發(fā)現(xiàn)FK1012達(dá)到2∶1結(jié)合化學(xué)計算值的高親和性(Kd(1)＝0.1nM；Kd(2)＝0.8nM)，并且不抑制神經(jīng)鈣蛋白(calcineurin)介導(dǎo)的TCR信號發(fā)生。此配體既非“免疫抑制性”的也無毒性(在細(xì)胞培養(yǎng)物中高達(dá)0.1mM)。同樣，我們已制備了基于環(huán)孢菌素A的同二聚試劑“(CsA)2”，其可以1∶2的化學(xué)計算量與CsA受體親環(huán)素結(jié)合，但不與神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合。因此，象FK1012一樣，(CsA)2并不抑制信號傳輸途徑，并且既不是免疫抑制性的同樣也無毒性。
我們的配體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)聯(lián)系的這樣及其他實例均導(dǎo)致了對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的控制。在一個實例中，這一目的是通過產(chǎn)生由足以進(jìn)行翻譯后肉豆蔻?；腟rc的小片段(M)、ζ的胞質(zhì)尾部(Z；也使用B細(xì)胞受體的成分)、三個連續(xù)的FKBP12(F3)和flu表位tag(E)組成的細(xì)胞內(nèi)受體而實現(xiàn)的。在人(Jurkat)T細(xì)胞中表達(dá)構(gòu)建體MZF3E(圖18)后，我們進(jìn)一步證實所編碼的嵌合蛋白質(zhì)經(jīng)受了FK1012介導(dǎo)的低聚合。根據(jù)在對FK1012反應(yīng)中(EC30＝50nM)堿性磷酸酶分泌作用(SEAP)所證實的，伴隨的ζ鏈的聚集導(dǎo)致通過內(nèi)源性TCR信號傳輸途徑發(fā)生信號(圖15)。構(gòu)建SEAP報導(dǎo)基因的啟動子以由被激活之T細(xì)胞的核因子(NFAT)轉(zhuǎn)錄激活，使其在TCR信號發(fā)生后組裝在核中?？赏ㄟ^稱為FK506-M的配體的無毒性單位譯本誘導(dǎo)的去聚集過程來終止FK1012誘導(dǎo)的信號傳輸。
具體地說，5μg真核表達(dá)載體，即含有肉豆蔻?；逗鲜荏w的pBJ5與4μg NFAT-SX共轉(zhuǎn)染。MZE、MZF1E、MZF2E和MZF3E分別含有處在肉豆蔻?；疌D3胞質(zhì)區(qū)下游的0、1、2、或3個FKBP12的拷貝。(見圖2)。作為對照，在平行的轉(zhuǎn)染實驗中使用5μgpBJ5。24小時后，將約含105個細(xì)胞的各轉(zhuǎn)染樣品的等分部分與如所指出的藥物，F(xiàn)K1012B的對數(shù)稀釋液一起保溫。作為陽性對照并為了控制轉(zhuǎn)染效率，向各轉(zhuǎn)染的等分樣品中加入肌霉素(1μm)和PMA(25ng/ml)。繼續(xù)保溫12小時后，檢測上清液的堿性磷酸酶活性和相對于陽性對照樣品被表達(dá)的這些活性。加入1ng/mlFK506使所有刺激作用降到接近本底水平，證明激活是以如用FK506阻斷同樣的途徑進(jìn)行的。這一結(jié)果進(jìn)一步證實本發(fā)明細(xì)胞激活作用的可逆性。所得到的各數(shù)據(jù)點(diǎn)均為兩份樣品的平均值并且所進(jìn)行的幾次實驗都得到了相似的結(jié)果(見圖8)。肉豆蔻?；难苌镆源蠹s放大一個數(shù)量級對較低濃度的配體起反應(yīng)，并且激活NFAT依賴性轉(zhuǎn)錄達(dá)到可比較的水平，但應(yīng)注意到的是配體是不同的(比較圖7和8)。
體內(nèi)FK1012誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)二聚合。我們接下來要進(jìn)一步證實MZF3E受體的細(xì)胞內(nèi)聚集確定是由FK1012誘導(dǎo)的。因此使MZF3E構(gòu)建體的流感血細(xì)胞凝集素表位-tag(flu)與不同的表位-tag(flag-M2)交換。在Jurkat T細(xì)胞中共表達(dá)密切相關(guān)的嵌合體MZF3Eflu和MZF3Eflag。用FK1012A處理細(xì)胞后使用偶聯(lián)在瓊脂糖小球上的抗F lag抗體進(jìn)行免疫沉淀實驗。在FK1012A(1μM)存在下，蛋白質(zhì)嵌合體MZF3Eflag與MZF3Eflu相互作用，并與MZF3Eflag共免疫沉淀。不存在FK1012A時則觀察不到MZF3Eflu的共免疫沉淀。用FKBP單體構(gòu)建體MZF 1 Eflu和MZF 1 Eflag進(jìn)行的相關(guān)實驗并沒有出現(xiàn)信號，表明它們也在FK1012A作用下發(fā)生了二聚合。這一結(jié)果反映了用內(nèi)源性T細(xì)胞受體和我們的人工受體MZF3E觀察到的聚集要求。
FK1012誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)-酪氨酸磷酸化作用在抗原刺激后TCR、CD3和ζ鏈的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域與胞質(zhì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶相互作用。Src家庭的特殊成員(lck和/或fyn)使這些細(xì)胞內(nèi)區(qū)域內(nèi)活化基序(酪氨酸活化基序，TAM)的一個或多個酪氨酸殘基磷酸化。酪氨酸激酶ZAP-70被補(bǔ)充(通過其兩個SH2區(qū)域)到酪氨酸磷酸化的T細(xì)胞受體上，被活化，并很可能參與磷酸化酶C的進(jìn)一步的下游激活作用。如在E分別免疫沉淀內(nèi)源性T細(xì)胞受體ζ鏈和MZF3E構(gòu)建體后經(jīng)體外激酶檢測法所測得的，向用MZF3E穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞中加入抗CD 3 MAb或FK1012A，導(dǎo)致了對ζ鏈之激酶活性的恢復(fù)。用抗CD3MAb或FK1012處理細(xì)胞后，使用單克隆α-磷酸酪氨酸抗體檢測酪氨酸磷酸化作用。在刺激后的不同時間分析整個細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。用抗CD3MAb或FK1012刺激后觀察酪氨酸磷酸化之蛋白質(zhì)的類似圖形。該圖形由可能是ZAP-70的70 kDa之主帶和120kDa、62kDa、55kDa及42kDa的小帶組成。
實施例4(B)用親免素-Fas抗原嵌合體調(diào)節(jié)程序化的細(xì)胞死亡Fas抗原是細(xì)胞表面受體中神經(jīng)生長因子(NGF)/腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員。Fas抗原與抗其細(xì)胞外區(qū)的抗體交聯(lián)可激活一個知之很少的信號發(fā)生途徑，由此導(dǎo)致程序化的細(xì)胞死亡或細(xì)胞自然死亡。Fas抗原和其相關(guān)自然死亡信號發(fā)生途徑存在于包括可能所有腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞中。該途徑導(dǎo)致迅速而獨(dú)特的細(xì)胞死亡(2小時)，特征在于胞質(zhì)濃縮、沒有炎性反應(yīng)及核小體DNA斷裂，而這些特征部是壞死性細(xì)胞死亡中見不到的。
我們還發(fā)展了一個次等的、導(dǎo)致細(xì)胞自然死亡的可誘導(dǎo)的信號發(fā)生系統(tǒng)。同MZF3E途徑一樣，該途徑是通過激活一個人工受體而產(chǎn)生的，所說的人工受體則是構(gòu)成上表達(dá)之“應(yīng)答者”基因的產(chǎn)物。但此新的途徑不同于第一個途徑之處在于我們的HOD試劑誘導(dǎo)內(nèi)源途徑的產(chǎn)物而不是被轉(zhuǎn)染的、可誘導(dǎo)的(如報導(dǎo))基因的產(chǎn)物的合成。
增加對Fas途徑的控制為生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)進(jìn)步提供了重要的機(jī)會。用處于細(xì)胞特異性啟動子控制下的“死亡”應(yīng)答基因設(shè)計轉(zhuǎn)基因動物。然后可以給動物施用HOD試劑，以化學(xué)消除成年動物體內(nèi)的靶細(xì)胞。以這種方法，可以評價特定腦細(xì)胞在記憶或認(rèn)識中的作用，或免疫細(xì)胞在誘發(fā)或維持自體免疫性疾病中的作用。也可以使用由M.Blaese及其同事建立的人基因治療技術(shù)(Culver，et al.，Science256，5063(1992)1550-2)將死亡應(yīng)答基因?qū)肽[瘤中，然后經(jīng)用HOD試劑處理病人而相繼激活這些基因(類似于最近報導(dǎo)的治療腦腫瘤的“gancyclovir”基因治療臨床試驗)。最后，我們設(shè)想在基因治療的實踐中合用死亡應(yīng)答基因和治療基因。這將為基因治療提供一種“失效保護(hù)”組分。如果什么東西要跑掉(一個共同討論的問題是導(dǎo)致腫瘤的整合誘導(dǎo)的腫瘤抑制基因的丟失)，基因治療病人就可服用將殺死所有被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的“失效保護(hù)”藥片。因此我們?yōu)榇四康脑O(shè)計了低聚合化試劑的正交系統(tǒng)。因此，我們提供了一套配體和嵌合應(yīng)答蛋白以用于調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的程序化死亡，另一套用于調(diào)節(jié)治療基因的轉(zhuǎn)錄。用于調(diào)節(jié)治療或所需基因轉(zhuǎn)錄的配體被設(shè)計為(或選擇為)不能交叉反應(yīng)和啟動細(xì)胞程序死亡。
已構(gòu)建了由三個與Fas抗原的胞質(zhì)信號傳輸區(qū)相融合之FKBP12區(qū)組成的嵌合cDNA范例(圖19)。當(dāng)在人Jurkat和小鼠D10T細(xì)胞中表達(dá)時，可由FK1012試劑誘導(dǎo)該構(gòu)建體二聚合，并發(fā)起將導(dǎo)致FK1012依賴性自然死亡過程的信號級聯(lián)。如根據(jù)報導(dǎo)基因活性丟失所確定的，F(xiàn)K1012A介導(dǎo)的被MFF3E短暫轉(zhuǎn)染之細(xì)胞死亡的LD50值為15nM(見圖19；有關(guān)檢測法的討論參見圖20)。這些數(shù)據(jù)與在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中進(jìn)行的細(xì)胞死亡檢測結(jié)果相符。因為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體代表了一個細(xì)胞的同源群體，所以它們已被用于確定死亡是由于自然死亡而不是壞死(膜起泡、核小體DNA斷裂)。然而，短暫轉(zhuǎn)染程序更加方便，并因此被用作如下描述的初始試驗系統(tǒng)。
實施例4(C)用親環(huán)素-Fas抗原嵌合體調(diào)節(jié)程序化的細(xì)胞死亡我們還制備了一系列親環(huán)素C-Fas抗原構(gòu)建體并在短暫表達(dá)試驗中檢驗了它們的誘導(dǎo)(CsA)2依賴性自然死亡的能力(圖20A)。
此外，已經(jīng)用被該系列中最活躍的構(gòu)建體MC3FE(M＝Src的肉豆蔻酰化區(qū)域，C＝親環(huán)素區(qū)域，F(xiàn)＝Fas的胞質(zhì)尾部，E＝flu表位tag)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人Jurkat T細(xì)胞證明了(CsA)2依賴性自然死亡。在1、2、3或4個連續(xù)的親環(huán)素區(qū)域之前或之后融合了Fas的胞質(zhì)尾部。也制備了兩個缺少Fas區(qū)的對照構(gòu)建體。在這種情況下，我們觀察到只有當(dāng)放在二聚區(qū)之后時信號發(fā)生區(qū)才有功能活性(當(dāng)放在二聚區(qū)之前或之后時ζ鏈構(gòu)成信號)。如由Western印跡分析所證實的，3個信號發(fā)生構(gòu)建體的表達(dá)水平和其活性有著量上的不同(圖20B)。已如此明確證明的最佳系統(tǒng)是MC3FE。MC3FE進(jìn)行的(CsA)2介導(dǎo)之細(xì)胞死亡的LD50約為200nM。這些數(shù)據(jù)證明了親環(huán)素-環(huán)孢菌素相互作用對于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聯(lián)系的實用性，并舉例說明了不與FKBP12-FK1012系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)的正交試劑系統(tǒng)。此外，在此情況下，數(shù)據(jù)還顯示由Fas胞質(zhì)尾部發(fā)起信號傳送只需要二聚合而不需要聚集。
肉豆蔻?；饔眯盘柕腘末端甘氨酸突變?yōu)楸彼釋⒆柚谷舛罐Ⅴ；?，并因此而阻止膜定位。我們也已觀察到突變的構(gòu)建體(△MFF3E)具有如FK1012依賴性自然死亡的誘導(dǎo)物的等同能力，此表明膜定位對于Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡并不是必須的。
實施例5鼠信號傳送嵌合蛋白質(zhì)的構(gòu)建使用圖4中所述的引物制得各個不同的片段。有關(guān)引物編號應(yīng)參見圖4。
使用含鼠II類MHC受體(Cell，32，745)之I-E鏈的約1.2kbcDNA片段作為信號肽的來源，用供應(yīng)商(Promega)描述的PCR方法由P#6048和P#6049制得70bp SacII-XhoI片段。使用含有連接到CD3之跨膜和胞質(zhì)區(qū)(PNAS，88，8905)上的Tac(IL2受體鏈)的質(zhì)粒制得第二個片段。使用P#6050和P#6051，以PCR方法制得CD3之跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)的32Dbp XhoI-EcoRI片段。連接這兩個片段并插入SacII-EcoRI消化的pBluescript(Stratagene)中以得到質(zhì)粒SPZ/KS。
為了得到FK506的結(jié)合區(qū)，使用質(zhì)粒rhFKBP(由S.Schreiber提供，Neture(1990)346，674)與P#6052和P#6053制得含有人FKBP12的340bp XhoT-SalI片段。將該片段插入用XhoI和SalI消化的pBluescript中以提供質(zhì)粒FK1 2/KS，并以其作為FKBP12結(jié)合區(qū)的來源。用XhoI消化SPZ/KS，磷酸化(細(xì)胞小腸堿性磷酸酶CIP)以防止自身退火，并與10倍摩爾過量的來自FK12/KS的含XhoI-SalI FKBP 12片段結(jié)合。分離在正確方向上含有單體、二聚和三聚FKBP12的克隆?？寺?FK1/KS、1FK2/KS和1FK3/KS在轉(zhuǎn)錄方向上由來自鼠MHCII類基因I-E的信號肽、分別是人FKBP12的單體、二聚體或三聚體的部分，以及CD3的跨膜和胞質(zhì)部分組成。最后，使用限制性酶從pBluescript切下SacII-EcoRI片段并連接到已用SacII和EcoRI消化的p3J5的多接頭中，以分別得到質(zhì)粒1FK1/pBJ5、1FK2/pBJ5和1FK3/pBJ5(見圖3和4)。
實施例6A.細(xì)胞內(nèi)信號傳送嵌合體的構(gòu)建從Pellman等人(Nature 314，374)處得到來自c-src的肉豆蔻酰化序列并連接到CD3的互補(bǔ)序列上，以提供互補(bǔ)于跨膜區(qū)之序列3′的引物，即P#8908 。該引物具有與肉豆蔻?；蛄械?′末端相鄰的SacII位點(diǎn)，以及與其3′末端相鄰的XhoI序列。另一引物P#8462具有與CD3之3′末端序列互補(bǔ)的序列SalI識別位點(diǎn)3′，終止密碼子及EcoRI識別位點(diǎn)。使用PCR制得由肉豆蔻?；蛄泻驮?′-3′方向融合的CD3序列組成的450bp SaclI-EcoRI片段。將該片段連接到SacII/EcoRI消化的pBJ5(XhoI)(SalI)中并克隆之，得到質(zhì)粒MZ/pBJ5。最后，用SalI消化MZ/pBJ5，磷酸化，并與10倍摩爾過量的來自FK1 2/KS的含XhoI-SalI FKBP12片段合并并連接之?？寺『?，分離含有在5′-3′方向上由肉豆蔻酰化序列、CD3和FKBP12多聚體組成之所需構(gòu)建體的質(zhì)粒，并驗證其具有正確結(jié)構(gòu)(參見圖2和4)。
B.細(xì)胞內(nèi)信號傳送嵌合體表達(dá)盒的構(gòu)建用限制性酶XhoI和SalI消化構(gòu)建體MZ/pBJ5(MZE/pBJ5)，除去TCRζ片段并將所得載體與10倍過量的FKBP12的單體、二聚體、三聚體或更高級聚合體連接，以制得MF1E、MF2E、MF3E或MFnE/pBJ5。然后可將經(jīng)過消化以含有相容性側(cè)翼限制性位點(diǎn)(即XhoI和SalI)的活性區(qū)克隆到MFnE/pBJ5的唯一XhoI或SalI限制位點(diǎn)中。
實施例7核嵌合體的構(gòu)建A.GAL4 DNA結(jié)合區(qū)-FKBP區(qū)域一表位tag。使用含有Kozak序列之SacII位點(diǎn)上游和翻譯起始位點(diǎn)的5′引物(#37)，和含有SalI位點(diǎn)的3′引物(#38)，以PCR方法擴(kuò)增GAL 4 DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸1-147)。分離P(CR產(chǎn)物，用SacII和SalI消化，在SacII和SalI位點(diǎn)處連接到pBluescrjpt II KS (+)中，得到構(gòu)建體pBS-GAL4 。經(jīng)序列分析證實該構(gòu)建體。分離pBS-GAL 4中的SacII/SalI片段并在SacII和XhoI位點(diǎn)處連接到IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5構(gòu)建體(合有肉豆蔻酰化序列，見實施例6)中，得到構(gòu)建體GF1E、GF2E和GF3E。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的5′端SacII |----Gal4(1-147)--->>
—— M K L L S S I5′CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG——KozakPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端<<----Gal4(1-147----)|R Q L T V S5′ GACAGTTGACTGTATCGGTCGACTGTCG3′ CTGTCAACTGACATAGCCAGCTGACAGC——SalIB.HNF1二聚合/DNA結(jié)合區(qū)-FKBP區(qū)域-tag。
使用含有Kozak序列之SacII位點(diǎn)上游和翻譯起始位點(diǎn)的5′引物(#39)，和含有SalI位點(diǎn)的3′引物(#40)，以PCR方法擴(kuò)增HNFla二聚/DNA結(jié)合區(qū)(氨基酸1-282)。分離PCR產(chǎn)物，用SaclI和SalI消化并在SacII和SalI位點(diǎn)處連接到pBluescriptIIKS(+)中，產(chǎn)生構(gòu)建體pBS-HNF。經(jīng)序列分析證實該構(gòu)建體。分離pBS-HNF中的SacII/SalI片段并在SacIl和XhoI位點(diǎn)處連接到IFK1/pBJ5和IFK3/pBJ5構(gòu)建體中，產(chǎn)生構(gòu)建體HF1E、HF2E和HF3E。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的5′端SacII |--FNF1(1-281)-->>
—— M V S K L S5′CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC——KozakPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端<<——HNF1(1-282)——|A F R H K L5′CCTTCCGGCACAAGTTGGTCGACTGTCG3′GGAAGGCCGTGTTCAACCAGCTGACAGC——SalIC.FKBP區(qū)-VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)-表位tag。以下述三個步驟制得這些構(gòu)建體(i)由IFK3/pBJ5產(chǎn)生其中的肉豆蔻?；蛄斜恢苯咏釉赬hoI位點(diǎn)上游之起始位點(diǎn)所取代的構(gòu)建體，得到構(gòu)建體SF3E；(ii)將核定位序列插入XhoI位點(diǎn)，產(chǎn)生構(gòu)建體NF3E；(iii)將VP16激活區(qū)克隆到NF3E的SalI位點(diǎn)中，產(chǎn)生構(gòu)建體NF3EV1E。
(i)將編碼Kozak序列和側(cè)接有SacII和XhoI位點(diǎn)之起始位點(diǎn)的互補(bǔ)寡核苷酸(#45和#46)一起退火，經(jīng)磷酸化處理后連接到MF3E的SacII和XhoI位點(diǎn)中，產(chǎn)生構(gòu)建體SF3E。種屬起始位點(diǎn)的插入Kozak_____M L E5′GGCCACCAIGC3′ CGCCGGTGGTACGAGCT—— ——SacIIXhoI突出部分突出部分(ii)將編碼側(cè)接有5′SalI位點(diǎn)和3′XhoI位點(diǎn)之SV40T抗原核定位序列的互補(bǔ)寡核苷酸(#47和#48)一起退火，經(jīng)磷酸化處理后連接到SF1E的XhoI位點(diǎn)中，產(chǎn)生構(gòu)建體NF1E。經(jīng)DNA序列分析證實該構(gòu)建體。分離一個含有突變或缺陷形式之核定位序列的，其中128位蘇氨酸取代賴氨酸的構(gòu)建體。該構(gòu)建體被定名為NF1E-M。從pBS-FKBP12中分離作為XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并將該片段連接到用XhoI切成線形的NF1E中，得到FKBP12區(qū)的多聚體。如此產(chǎn)生了構(gòu)建體NF2F和NF3E。
將NLS插入種屬起始位點(diǎn)T(ACN)126 132L D P K K K R K V L E5′ TCGACCCTAAGAAGAAGAGAAAGGTAC3′ GGGATTCTTCTTCTCTTTCCATGAGCT—— ——SalI XhoI因128位上的蘇氨酸而產(chǎn)生有缺陷的NLS。
(iii)使用含有SalI位點(diǎn)的5′引物(#43)和含有XhoI位點(diǎn)的3′引物(#44)以PCR法擴(kuò)增VP16轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(氨基酸413-490)。分離PCR產(chǎn)物，用SalI和XhoI消化并在XhoI和SalI位點(diǎn)上連接到MF3E中，得到構(gòu)建體MV1E。經(jīng)DNA序列測定證實該構(gòu)建體。作為XhoI/SalI片段從MV1E中分離單一VP16序列，并將該片段連接到用XhoI切成線形的MV1E中而產(chǎn)生多聚的VP16區(qū)。以同樣方法產(chǎn)生構(gòu)建體MV2E、MV3E和MV4E。從MV1E或MV2E中分離作為XhoI/SalI片段的編碼一種或多個多VP16區(qū)域的DNA片段并連接到用SalI切成線形的NF1E中，產(chǎn)生構(gòu)建體NF1V1E和NF1V3E。從pBS-FKBP12中分離作為XhoI/SalI片段的FKBP12序列，并將此片段連接到用XhoI切成線性的NF1V1E中，得到FKBP12區(qū)的多聚體。從而導(dǎo)致構(gòu)建體NF2V1E和NF3V1E的產(chǎn)物。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的5′端SalI|--VP16(413-490)--->>
_______ A P P T D V5′ CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTCPCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3′端<<--VP16(413-490)----|D E Y G G5′GACGAGTACGGTGGGCTCGAGTGTCG3′CTGCTCATGCCACCCGAGCTCACAGC——Xhol
寡核苷酸#3738mer/0.2um/OFF 5′CGACACCGCGGCCACCATGAAGCTACTGTCTTCTATCG#3828mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACCGATACAGTCAACTGTC#3934mer/0.2um/OFF5′CGACACCGCGGCCACCATGGTTTCTAAGCTGAGC#40 28mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACCAACTTGTGCCGGAAGG#43 29mer/0.2um/OFF 5′CGACAGTCGACGCCCCCCCGACCGATGTC#44 26mer/0.2um/OFF 5′CGACACTCGAGCCCACCGTACTCGTC#45 26mer/0.2um/OFF 5′GGCCACCATGC#46 18mer/0.2um/OFF5TCGAGCATGGTGGCCGC#47 27mer/0.2um/OFF 5TCGACCCTAAGA-(C/A)-GAAGAGAAAGGTAC#48 27mer/0.2um/OFF 5TCGAGTACCTTTCTCTTC-(G/T)-TCTTAGGG實施例8轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的證明使用所指出的構(gòu)建體(各5μg構(gòu)建體)以電穿孔法(960μF，250v)轉(zhuǎn)染Jurkat TAg細(xì)胞。24小時后，將細(xì)胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中并分成若干等份。取每份轉(zhuǎn)染物的一半與二聚FK506衍生物(實施例14)，以1μM的終濃度保溫。12小時后，洗細(xì)胞并經(jīng)反復(fù)凍融制備細(xì)胞提取物。用標(biāo)準(zhǔn)方法(Molecular CloningALaboratory Manual.Sambrook at al.eds.(1989)CSH Laboratory，pp.16-59 ff.)檢測氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)活性。所得數(shù)據(jù)證明37℃保溫18小時后在70μl提取物(總提取物體積為120μl)中如所希望的(樣品2中有或沒有配體；樣品5和6中存在配體)存在CAT活性。該項檢測中所使用的樣品是
1.G5E4TCAT(GAL4-CAT報導(dǎo)質(zhì)粒)2.G5E4TCAT，GAL4-VP163.GSE4TCAT，NFSV1E4.G5E4TCAT，GF2E5.G5E4TCAT，GFF2E，NF3V1E6.G5E4TCAT，GF3E，NF3V1E化學(xué)合成實施例如本文中所指出的，目前作為低聚劑的特別適用的化合物具有下列結(jié)構(gòu)接頭-[rbm1，rbm2，…rbmn]。
其中“接頭”是如本文所述的與“n”(從2到約5的整數(shù)，通常是2或3)可以相同或不同的受體結(jié)合部分(“rbm”)共價連接的接頭部分。如本文其他段落中所指出的，受體結(jié)合部分是已知受體的配體(或其類似物)，如在V(C)部中所列舉的配體，并包括能夠與FKBP結(jié)合的FK506、FK520、雷帕霉素和其類似物；以及能夠與各自的受體結(jié)合的環(huán)孢菌素、四環(huán)素、其他抗生素和大環(huán)內(nèi)酯及類固醇。
接頭是能夠共價結(jié)合(“-”)到兩個或多個受體結(jié)合部分上的雙或多功能分子。典型地，接頭可含有最高達(dá)約40個原子，除了碳和氫外還包括氮、氧和硫。VI(A)部分和各實施例中公開了一些舉例說明的接頭部分，并且其中包括C1-C30烷基、亞烷基或芳烷基基團(tuán)，它們可以被取代或不被取代，可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀，例如烷基取代基是飽和直鏈、環(huán)狀或支鏈烴部分，優(yōu)選為1至約12個碳原子，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、環(huán)丁基、環(huán)丙基亞甲基、戊基、己基、庚基、辛基等等，并任選地可被一個或多個取代基所取代，所述取代基為例如低級烷氧基、羧薹、氨基(取代或親取代的)、苯基、芳基、巰基、鹵素(氟、氯、溴或碘)、疊氮基或氰基。
可以使用市場上可購得的材料和/或本領(lǐng)域已知的方法制備這些化合物。可按下文所述方法制得這些化合物的工程化受體。特別有用的化合物是以小于10-6，較好小于約10-7并且甚至更好小于10-8M的Kd值與受體結(jié)合的化合物。
令人感興趣的低聚合劑中的一個亞類是其中一個或多個受體結(jié)合部分為FK506、FK-506型化合物或其衍生物的低聚合劑，其中受體結(jié)合部分通過C21(使用FK506編號)上的烯丙基基團(tuán)(如圖9A中所示的化合物5或13)，或通過環(huán)己基環(huán)(C29-C34)，如通過C32羥基(如圖9B中所示的化合物8、16、17)共價連接到接頭部分上。可按本文中(包括下述實施例中)所述的方法制備該類化合物。
另一亞類有用的低聚合試劑是其中至少一個受體結(jié)合部分是FK520或其衍生物的低聚合試劑，其中FK520或其衍生物的分子共價連接到如圖10所示FK1040A或FK1040B中的接頭部分上?？砂磮D10所示的方案1、圖11A和11B所示的方案2或圖12與圖13所示的方案3制備這類化合物。
再一個有用低聚合試劑的亞類是其中至少一個受體結(jié)合部分為環(huán)孢菌素A或其衍生物的低聚合試劑。
應(yīng)理解到的是，本發(fā)明的這些或其他低聚合試劑可以是同低聚合試劑(其中的rbm都是相同的)或?qū)У途酆显噭?其中的rbm是不同的)。可按本文給出的相以方法，包括圖13所示的方案3及本文中所討論過的方法制備異低聚合試劑。
下列合成實施例只是舉例說明性的。
A.通用方法。所有反應(yīng)均在正氮或氬氣壓力下在烘箱干燥的玻、璃器皿中進(jìn)行。對空氣和濕氣敏感的化合物通過注射器或經(jīng)過橡膠隔片套管導(dǎo)入。
B.物理數(shù)據(jù)。在Bruker AM-500(500MHz)和AM-400(400MHz)分光儀上記錄質(zhì)子磁共振譜(1H NMR)。使用溶劑共振作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(氯仿，7.27ppm)報告來自四甲基硅烷的化學(xué)位移(ppm)。數(shù)據(jù)報告如下化學(xué)位移，多重性(s＝單峰，d＝雙重峰；t＝三重峰，q＝四重峰，br＝加寬峰，m＝多重峰)，偶聯(lián)常數(shù)(Hz)，積分，得到低和高分辨率質(zhì)譜。
C.層析。使用E.Merck硅膠60F玻璃板(0.25mm)經(jīng)薄層層析(TLC)監(jiān)測反應(yīng)。用長波紫外光光照，暴露于碘蒸氣，和/或浸沒于鉬酸鈰銨水溶液中然后加熱以顯現(xiàn)各組分。層析的溶劑為HPLC級。在E.Merck硅膠160(230-400目)上使用所指出的溶劑系統(tǒng)的加壓流(快速層析)進(jìn)行液相層析。
D.溶劑和試劑。所有試劑和溶劑都是分析級的，并除了下述特殊要求者外均直接使用。從二苯甲酮羰游基鈉中蒸餾四氫呋喃(THF)、苯、甲苯和二乙醚。從氫化鈣中蒸餾三乙胺和乙腈。從五氧化二磷中蒸餾二氯甲烷。在減壓下從氫化鈣中蒸餾二甲基甲酰胺(DMF)并過4_分子篩儲存。FK506衍生物的制備實施例9FK506-TBS2(1至2)的硼氫化作用/氧化作用按照Evans(Evans，et al.，JACS(1992)114，6679；引文同上(1992)6679-6685)所述方法進(jìn)行硼氫化反應(yīng)(編號參見Harding，et al.，Nature(1989)341，758)。10ml燒瓶內(nèi)裝入24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(33.8mg，0.033mmol)和[Rh(nbd)(diphos-4)]BF4(3.1mg，0.004mmol，13mol％)。將此有機(jī)混合物溶解在甲苯(2.0ml)中，減壓下經(jīng)4小時除去溶劑。用氮?dú)庑⌒那逑礋浚瑢⒔埸S色油溶于THF(3.0ml，10mM終濃度)并用冰水浴冷卻到0℃。通過注射器加入兒茶酚硼烷(98μl，0.098mmol，在THF中的1.0M溶液，3.0當(dāng)量)并將所得溶液于0℃攪拌45分鐘。反應(yīng)物于0℃與0.2ml THF/EtOH(1∶1)，然后是0.2ml pH7.0緩沖液(Fisher；0.05M磷酸鹽)，再后用0.2ml 30％ H2O2驟冷。將溶液于室溫下攪拌至少12小時。減壓下除去溶劑，將剩余的油溶于甲苯(10ml)中并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗，分離各相并用苯(2×10ml)反萃取水相。
合并有機(jī)相并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗一次。用MgSO4干燥苯相，濃縮，并經(jīng)快速層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)后得到澄清的無色油狀初級醇(12.8mg，0.012mmol，37％)。
制備混合的碳酸酯(2至3)。用Ghosh的方法制備混合的碳酸酯(Ghosh，et al.，Tetrahedron Lett.(1992)33，2781-2784)。在10ml燒瓶內(nèi)裝入初級醇(29.2mg，0.0278mmol)和苯(4ml)。在減壓下經(jīng)60分鐘除去溶劑。將油溶解在乙腈(2.0ml，14mM終濃度)中并于20℃攪拌下加入三乙胺(77μl，0.56mmol)。以一份加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(36mg，0.14mmol)并于20℃將溶液攪拌46小時。用二氯甲烷稀釋反應(yīng)混合物并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗。分離各相并用二氯甲烷(2×10ml)反萃取水層。合并有機(jī)相并干燥(MgSO4)之，濃縮并進(jìn)行快速層析(3∶1至2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)。分離得到澄清無色的油狀所需的混合碳酸酯(16.8mg，0.014mmol，51％)。
FK506的二聚合(3至4)。在一干的1ml錐形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)內(nèi)裝入混合的碳酸酯(7.3mg，0.0061mmol)和乙腈(250μl，25mM終濃度)。加入三乙胺(10μl，0.075mmol)，再加入對位亞二甲苯二胺(8.3μl，0.0027mmol，加在DMF中的0.32M溶液)。反應(yīng)物于20℃攪拌22小時并加入二氯甲烷(10ml)稀釋使之聚冷。用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗該溶液。分離各相并用二氯甲烷(2×10ml)反萃取水層。合并有機(jī)相并干燥(MgSO4)之、濃縮并進(jìn)行快速層析(3∶1至2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到所需的被保護(hù)的二聚體，其為澄清的無包油狀物(4.3mg，1.9μmol，70％)。
FK506二聚體的去保護(hù)(4至5)。將被保護(hù)二聚體(3.3mg，1.4μmol)放在配有旋轉(zhuǎn)葉輪的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，3mM終濃度)并在攪拌下在20℃向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher)。將此溶液室溫攪拌18小時。然后在15ml試管中在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間分配去保護(hù)的FK506衍生物。旋轉(zhuǎn)試管去充分混合各相，分離后用吸管除去有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，并干燥(MgSO4)合并的有機(jī)相，濃縮并進(jìn)行快速層析(1∶1∶1己烷∶THF∶乙醚至1∶1THF∶乙醚)得到所需的澄清的無色油狀二聚體產(chǎn)物(1.7mg，0.93μmol，65％)。
依照上述步驟，可以使用其他單胺和二胺，如芐胺(14)、辛二胺、癸二胺等。
實施例10用L-Selectride還原FK506(FK506至6)Danishefsky及其同事已證明用L-Selectride處理FK506可得到有硼酸酯接合C24和C22羥基基團(tuán)的22-二氫-FK506(Colemanand Danishefsky，Heterocycles(1989)28，157-161；Fisher，et al.，J.Org.Chem.(1991)56，2900-2907)。
混合碳酸酯的制備(6至7)。10ml燒瓶裝入22-二氫-FK506-硼酸仲丁酯(125.3mg，0.144mmol)和乙腈(3.0ml，50mM終濃度)，并在室溫攪拌下加入三乙胺(200μl，1.44mmol，10當(dāng)量)至澄清溶液。一次加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(184.0mg，0.719mmol)，并將此澄清溶液在室溫攪拌44小時。用乙酸乙酯(20ml)稀釋溶液，再用飽和碳酸氫鈉溶液(10ml)洗滌并分離各相。然后用乙酸乙酯(2×0ml)反萃取水相，合并有機(jī)相，干燥(MgSO4)，并對所得到油進(jìn)行快速層析(1∶1至1∶2己烷∶乙酸乙酯)，得到作為澄清的無色油的所需混合碳酸酯(89.0mg，0.088mmol，61％)。
FK506混合碳酸酯的二聚合(7至8)。在一干燥的1ml錐形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)中裝入混合的碳酸酯(15.0mg，0.0148mmol)和二氯甲烷(500μl，30mM終濃度)。室溫攪拌溶液同時加入三乙胺(9μl，0.067mmol，10當(dāng)量)再加入對亞二甲苯二胺(0.8mg，0.0059mmol)。反應(yīng)在20℃下攪拌進(jìn)行16小時并經(jīng)用二氯甲烷(5ml)稀釋進(jìn)行驟冷。用飽和碳酸氫鈉水溶液(5ml)洗該溶液。分離各相并用二氯甲烷(2×5ml)反萃取水相。合并有機(jī)相并干燥(MgSO4)，濃縮并進(jìn)行快速層析(1∶1至1∶2己烷∶乙酸乙酯)，得到作為澄清無色油的所需二聚體(7.4mg，3.8μmol，65％)。
按照上述步驟，可以用其他單胺、二胺或三胺代替亞二甲苯二胺，例如可使用芐胺(15)、辛二胺、癸二胺(16)、雙-對位二芐胺、N-甲基二亞乙基胺、三-氨基乙胺(17)、三-氨基丙胺、1，3，5-三氨基甲基環(huán)己烷等。
實施例11FK506的氧化裂解和還原(1至9)按照Kelly(VanRheenen，et al.，Tetrahedron Lett.(1976)17，1973-1976)的方法進(jìn)行鋨酸化。按照Danishefsky(Zell，etal.，J.Org.Chem.(1986)51，5032-5036)的方法裂解。按照Krishnamurthy(J.Org.Chem.，(1981)46，4628-4691)的方法進(jìn)行醛還原。10ml燒瓶內(nèi)裝入24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(84.4mg，0.082mmol)、4-甲基嗎啉N-氧化物(48mg，0.41mmol，5當(dāng)量)和THF(2.0ml，41mM終濃度)。通過注射器加入四氧化鋨(45μl，0.008mmol，0.1當(dāng)量)。將澄清的無色溶液室溫攪拌5小時。用50％甲醇水溶液(1.0ml)稀釋反應(yīng)混合物并一次加過碘酸鈉(175mg，0.82mmol，10當(dāng)量)。將所得混濁混合物室混攪拌40分鐘，用乙醚(10ml)稀釋，并用飽和碳酸氫鈉水溶液(5ml)洗滌。分離各相并用乙醚(2×5ml)反萃取水層。干燥(MgSO4)合并的有機(jī)層并用固體亞硫酸鈉(50mg)處理。然后過濾有機(jī)層，濃縮并對油狀物進(jìn)行快速層析(3∶1至2∶1己烷∶乙酸乙酯)處理，得到澄清的無色油，即為不穩(wěn)定的醛中間體(53.6mg)。將此醛直接溶解在THF(4.0ml)中并在氮環(huán)境下冷卻到-78℃，并用三[(3-乙基-3-戊基)氧基]氫化鋁鋰(0.60ml，0.082mmol，0.14M的THF溶液，1.0當(dāng)量)處理之。將澄清的溶液于-78℃攪拌10分鐘，再用乙醚(4ml)稀釋并加入飽和氯化銨水溶液(0.3ml)使之驟冷。將混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒓尤牍腆w硫酸鈉以于燥之。然后過濾混合物并濃縮。對所得到的油進(jìn)行快速層析(2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到作為澄清的無色油的所需要的醇(39.5mg，0.038mmol，47％)。
混合碳酸酯的制備(9至10)。按Ghosh等人(TetrahedronLett.(1992)33，2781-2784)所述方法制備混合的碳酸酯。10ml燒瓶內(nèi)裝入伯醇(38.2mg，0.0369mmol)和乙腈(2.0ml，10mM終濃度)，并在室溫攪拌下加入2，6-二甲基吡啶(43μl.0.37mmol，10當(dāng)量)。以一份量加入N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(48mg，0.18mmol)并將所得溶液室溫攪拌24小時。用乙醚(10ml)稀釋反應(yīng)混合物并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗。分離各相并用乙醚(2×10ml)反應(yīng)萃取水層。合并有機(jī)相并干燥(MgSO4)、濃縮之，對其進(jìn)行快速層析(2∶1至1∶1己烷∶乙酸乙酯)。分離得到作為澄清的無色油的混合碳酸酯(32.6mg，0.028mmol，75％)。
氨基甲酸芐酯的制備(10至11)。在一干燥的、1ml錐形玻璃瓶(Kontes Scientific Glassware)內(nèi)裝入混合的碳酸酯10(8.7mg，0.0074mmol)和乙腈(500μl，15mM終濃度)。于室溫下攪拌的同時加入三乙胺(10μl，0.074mmol，10當(dāng)量)，然后再加入芐胺(1.6μl，0.015mmol，2當(dāng)量)。室溫下將反應(yīng)混合物攪拌4小時。用干燥氮?dú)饬鞒ト軇┎⒅苯訉λ玫降挠瓦M(jìn)行快速層析，(3∶1至2∶1己烷∶乙酸乙酯)，得到澄清的無色油狀的所需被保護(hù)的單體(6.2mg，5.3μmol，72％)。
將被保護(hù)的單體(6.2mg，5.3μmol)放在配有旋轉(zhuǎn)葉輪的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.5ml，11mM終濃度)并在室溫攪拌下加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher；終濃度3.0N)。室溫下將溶液攪拌18小時。然后使去保護(hù)的FK506衍生物在15ml試管中分配于二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。旋轉(zhuǎn)試管徹底混合各相，分離后用吸管吸去有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相并干燥(MgSO4)合并的有機(jī)相，然后濃縮并進(jìn)行快速層析(己烷∶乙酸乙酯1∶1至0∶1)，得到所需的澄清的無色油狀去保護(hù)的氨基甲酸芐酯(3.9mg，4.1μmol，78％)。
用二胺如亞二甲苯基二胺(12)、六亞甲基二胺、亞辛基二胺癸二胺(13)或其他二胺代替芐胺，制備本發(fā)明的二聚化合物。
實施例12混合的FK506(12)碳酸酯的制備。在10ml燒瓶中裝入24，32-雙[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK506(339.5mg，0.329mmol)、4-甲基嗎啉N-氧化物(193mg，1.64mmol，5當(dāng)量)、水(0.20ml)和THF(8.0ml，終濃度41mN)。通過注射器加入四氧化鋨(0.183ml，0.032mmol，0.1當(dāng)量，在水中制成的0.18M溶液)。室溫下將澄清的無色溶液攪拌4.5小時。用50％含水甲醇(4.0ml)稀釋該反應(yīng)物并一次加入高碘酸鈉(700mg，3.29mmol，10當(dāng)量)。室溫下將混濁的混合物攪拌25分鐘，用乙醚(20ml)稀釋，并用飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)洗。分離各相并用乙醚(2×10ml)反萃取水層。用MgSO4和固體亞硫酸鈉(50mg)干燥合并的有機(jī)相。然后過濾和濃縮有機(jī)相，將所得到的醛直接溶解在THF(8.0ml)中并在氮?dú)猸h(huán)境下冷卻到-78℃，再用三[(3-乙基-3-戊基)氧基]氫化鋁鋰(2.35ml，0.329mmol，在THF中的0.14M溶液，1.0當(dāng)量)處理。-78℃下將澄清的溶液攪拌60分鐘(以TLC法密切監(jiān)測)后經(jīng)用乙醚(5ml)在-78℃稀釋進(jìn)行驟冷并加入飽和氯化銨水溶液(0.3ml)。使混合物溫?zé)嶂潦覝夭⒓尤肓蛩徕c以干燥該溶液。將混合物攪拌20分鐘，過濾、濃縮，并將所得到的油直接溶解于乙腈(10ml)中。向所得到的在CH3CN中的伯醇溶液中加入2，6-二甲基吡啶(0.380ml，3.3mmol，10當(dāng)量)和N，N′-二琥珀酰亞氨基碳酸酯(420mg，1.65mmol，5當(dāng)量)。室溫下將異質(zhì)混合物攪拌19小時，同時用乙醚(30ml)稀釋并用飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)洗。用乙醚(2×10ml)反萃取水相。合并有機(jī)相并干燥(MgSO4)、濃縮，并進(jìn)行快速層析(己烷/乙酸乙酯3∶1至2∶1至1∶1)。分離得到呈澄清、無色油狀的所需的混合的碳酸酯12(217mg，0.184mmol，4步驟總產(chǎn)率56％)。
實施例1324，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-A的制備。(對位亞二甲苯基二胺橋接)于燥的、1ml錐形玻璃瓶內(nèi)裝入混合的碳酸酯(23.9mg，0.0203mmol)和乙腈(500μl，41mM終濃度)。加入三乙胺(28μl，0.20mmol，10當(dāng)量)后再加入對位亞二甲苯基二胺(46μl，0.0101mmol，在DMF中的0.22M溶液)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時，用干燥氮?dú)獬ト軇λ玫挠椭苯舆M(jìn)行快速層析(己烷/乙酸乙酯，3∶1至2∶1至1∶1)，分離后得到呈澄清的、無色油狀的所需被保護(hù)的二聚體(11.9mg，5.3μmol，52％)。
實施例14FK1012-A(對位亞二甲苯基二胺橋接)(13)的制備將被保護(hù)的二聚體(11.0mg，4.9μmol)放在1.5ml配有旋轉(zhuǎn)葉輪的聚丙烯管中。加入乙腈(0.50ml，10mM終濃度)，于20℃攪拌下加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher終濃度3.0N)。于室溫下將溶液攪拌16小時。然后在15ml試管內(nèi)使去保護(hù)的FK506衍生物分配在二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。旋轉(zhuǎn)試管使各相充分混合，并在分離后用吸管吸除有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，干燥(MgSO4)合并的有機(jī)相，濃縮并對其進(jìn)行快速層析(己烷/THF/乙醚1∶1∶1至THF/乙醚1∶1)制得作為澄清的無色油的FK1012-A(5.5mg，3.0μmol，63％)。
實施例1524，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-B(癸二胺橋接)的制備在一干燥的1ml錐形玻璃瓶中裝入混合的碳酸酯(53.3mg，0.0453mmol)和乙腈(2.0ml，11mM終濃度)。加入三乙胺(16μl，0.11mmol，5當(dāng)量)，再加入癸二胺(61μl，0.0226mmol，在DMF中的0.37M溶液)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌12小時，用氮?dú)饬鞒ト軇?，并對所得到的油直接進(jìn)行快速層析(己烷/乙酸乙酯3∶1至2∶1至1∶1)，分離后得到所需的作為澄清的無色油的被保護(hù)的二聚體(18.0mg，7.8μmol，35％)。
實施例16FK1012-B(癸二胺-1，10橋接)(14)的制備。
將被保護(hù)的二聚體(18.0mg，7.8μmol)放在配有攪拌flea的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，16mM終濃度)，并在室溫下攪拌同時向溶液中加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher，終濃度3.6N)。將溶液于23℃攪拌17小時。然后使產(chǎn)物FK1012-B分配于15ml試管中的二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。充分旋轉(zhuǎn)試管以混合各相。分離后用吸管吸掉有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，干燥(MgSO4)合并的有機(jī)相，濃縮并進(jìn)行快速層析(100％乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇20∶1)，得到作為澄清的無色油的FK1012-B(5.3mg，2.9μmol，37％)。
實施例1724，24′，32，32′-四[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-FK1012-C(雙-對位氨基甲基苯甲酰基癸二胺橋接)的制備。
在一干燥的25ml滴形燒瓶內(nèi)裝入二胺連接物(15.1mg，0.0344mmol)和1.0ml DMF。在一分立的燒瓶中，將混合的碳酸酯和三乙胺(0.100ml，0.700mmol，20當(dāng)量)溶解于2.0ml二氯甲烷，然后緩慢(4×0.50ml)加到攪拌的雙-對位氨基甲基苯甲?；锒?1，10的溶液中。用二氯甲烷(2×0.50ml)洗含有混合的碳酸酯12的燒瓶內(nèi)，以確?；旌现妓狨?2的完全轉(zhuǎn)移。于23℃將反應(yīng)混合物攪拌16小時，用于燥氮?dú)饬鞒ト軇τ嗔舻挠椭苯舆M(jìn)行快速層析(己烷/乙酸乙酯1∶1至1∶2)，以得到作為澄清的無色油的，所需被保護(hù)的二聚體(29.6mg，11.5μmol，34％)。
實施例18FK1012-C(15)的制備將被保護(hù)的二聚體(29.6mg，11.5μmol)(17)放在配有攪拌flea的1.5ml聚丙烯管中。加入乙腈(0.45ml，23mM終濃度)，并于室溫下攪拌溶液同時加入HF(55μl，48％水溶液；Fisher，3.6N終濃度)。于室溫下攪拌溶液17小時。然后在15ml試管中使所需的對稱二聚體分配于二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉水溶液之間。大幅度旋轉(zhuǎn)試管以混合各相，分離后用吸管吸去有機(jī)相。用二氯甲烷(4×2ml)反萃取水相，并干燥(MgSO4)合并的水相，濃縮并進(jìn)行快速層析(100％乙酸乙酯至15∶1乙酸乙酯/甲醇)，得到為澄清的無色油的FK1012-C(11.5mg，5.5μmol，47％)。CsA衍生物的制備實施例19MeBmt(OAc)--OH1CsA(2)。
將MeBmt(OAc)--OAc1-CsA(1)(161mg，124mmol)(參見Eberle and Nuninger，J.Org.Chem.(1992)57，2689)溶解在甲醇(10ml)中。將KOH(196mg)溶于水(8ml)。將297μlKOH溶液(.130mmol，1.05當(dāng)量)加到(1)在甲醇的溶液內(nèi)。在惰性氣體環(huán)境和室溫下將此新的溶液攪拌4小時，同時用乙酸(2ml)使反應(yīng)驟冷。使用5cm×25cm，12μ，100A，C18柱以反相HPLC法純化反應(yīng)混合物，其中于70℃用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的70％乙腈/水洗脫得到112mg(72％)所需的單乙酸酯(2)。
MeBmt(OAc)--OCOIm1CsA(3)。MeBmt(OAc)--OH1-CsA(2)(57mg，45.5μmol)和羰基二咪唑(15mg，2當(dāng)量，91μmol)移入50ml園底燒瓶中，并溶解在無水THF(6ml)中。加入二異丙基乙胺(32μl，4當(dāng)量，182μmol)后于室溫下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑。使用乙酸乙酯作為洗脫劑，在硅膠上經(jīng)快速層析純化殘留物，得到45mg(73％)所需的氨基甲酸酯(3)。
三-(2-氨基乙基)胺CsA三聚體三乙酸酯(6)。將MeBmt(OAc)--OCOIm1-CsA(3)(7.5mg，5.54μmol，3.1當(dāng)量)溶解于THF(100μl)。加入二異丙基乙胺(62μl，5當(dāng)量，8.93μmol含有100μl胺在4ml THF中的溶液)，然后再加入三(2-氨基乙基)胺(26μl，1.79μmol，1當(dāng)量含有101mg三胺在10mlTHF中的溶液)。在N2環(huán)境下將該溶液攪拌5天。蒸發(fā)反應(yīng)混合物，然后使用在氯仿中的0-5％甲醇，在硅膠上經(jīng)快速層析純化之，得到4.1mg所需的產(chǎn)物(6)。
實施例20癸二胺CsA二聚體(8)。使固體鈉金屬(200mg，過量)與無水甲醇(10ml)于0℃下反應(yīng)。將癸二胺CsA二聚體二乙酸酯(5)(4.0mg)溶解在MeOH(5ml)中。向(5)的溶液中加入2.5ml NaOMe溶液。于惰性環(huán)境下室溫攪拌2.5小時后，用乙酸(2ml)快速冷卻溶液，并使用5mm×25mm，12μ，100A，C18柱在70℃用反相HPLC法純化產(chǎn)物，層析中用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的70-95％乙腈/H2O經(jīng)20分鐘洗脫得到2.5mg(60％)所需的二醇。
用0.45當(dāng)量的1，10-二癸胺代替三(2-氨基乙基)胺制備癸二胺CsA二聚體二乙酸酯(5)。
實施例21對位亞二甲苯基二胺CsA二聚體(4)。
用0.45當(dāng)量的對位亞二甲苯基二胺代替三(2-氨基乙基)胺制備對位亞二甲苯基二胺CsA二聚體(4)。
按照文獻(xiàn)中描述的下列方法，經(jīng)在1(MeBmt1)位點(diǎn)以外的位點(diǎn)上連接而制備親環(huán)素的其他衍生物。
使生產(chǎn)菌攝入D-氨基類似物制得在特定位點(diǎn)上摻入的8位D-異構(gòu)體類似物[參見Patchett，et al.，J.Antibiotics(1992)45，43(β-MeSO)D-Ala8-CsA)；Traber，et al.，文獻(xiàn)同上(1989)42，591]。經(jīng)在Sac3的特定碳上使CsA多聚-鋰氧化/烷基化，以制備3位類似物，參見Wenger，Transplant Proceeding(1986)18，213，supp.5(涉及親環(huán)素橋接和活性特征，特別是D-MePhe3-CsA)；Seebach，美國專利No.4,703,033，1987年10月27日公布(涉及衍生物的制備)。
按照上述方法，可使CsA的其他天然存在的變異體多聚化，以代替環(huán)孢菌素A用于本發(fā)明。實施例21A. CsA二聚體的選擇合成MeBmt(OH)-η-OCOIm1-CsA將MeBmt(OH)-η-OH1-CsA(38mg，31μmol，1218.6g/mol)和羰基二咪唑(20mg，4當(dāng)量，124μmol，162.15g/mol)移入10ml圓底燒瓶中，并溶解在無水THF(2ml)中。加入二異丙基乙胺(22μl，4當(dāng)量，125μmol，129.25g/mol)后于室溫下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上除去溶劑。使用于乙酸乙酯中的0-20％丙酮作為洗脫劑，在硅膠上經(jīng)快速層析純化殘留物，得到32mg(產(chǎn)量為78％)白色固體。
(CsA)2亞二甲苯基二胺CsA二聚體將MeBmt(OH)-η-OCOIm1-CsA(12.5mg，9.52μmol，1312.7g/mol)溶于DCM(200μl)中，在此溶液中加入22μl(0.5當(dāng)量，4.75μmol)于DMSO(0.5ml)中的亞二甲苯基二胺(14.7mg，136.2g/mol)溶液，在緩慢濃縮的氮?dú)猸h(huán)境下室溫攪拌反應(yīng)混合物72小時。反應(yīng)物經(jīng)乙腈(2ml)稀釋，玻璃纖維過濾，反相HPLC(Beckman C18，10μ，100A，1cm×25cm，5ml/min，50至90％ACN/H2O(+0.1％TFA)，30分鐘，70℃)純化可得到6.1mg(產(chǎn)率為49％)白色固體。 實施例21B. FK506-CsA二聚體的合成MeBmt(OAc)-η-CH2COOEt-CsA
將MeBmt(OAc)-η-Br1-CsA(26mg，～80％純度，15.7μmol，1323.57g/mol)溶于THF(500μl)中，用注射器將此溶液在15小時內(nèi)加入乙基氫丙二酸(過量的)的鎂enolate之THF溶液，后者是通過將jPrMgCl(2.15ml，2.34M，乙醚中)加入于THF(4.7ml)中的乙基氫丙二酸(Lancaster，2.5mmol，332mg，132.12g/mol)的0℃溶液后再加溫至室溫而制備的。用1N HCl(50ml)使反應(yīng)混合物驟冷并用乙酸乙酯(2×50ml)抽提之，用Na2SO4于燥有機(jī)層，過濾并蒸發(fā)之。
將粗產(chǎn)物溶于DMF(1ml)中，加入Et4NOAc·4H2O(150mg，過量)，在90℃下加熱此混合物2小時。將反應(yīng)混合物冷至室溫，用H2O(50ml)稀釋并用醚(2×50ml)抽提。用Na2SO4干燥合并的有機(jī)相，過濾并蒸發(fā)之。經(jīng)用75-100％乙酸乙酯/己烷洗脫，在硅膠上通過快速層析純化殘留物，可得到11.4mg(55％)白色固體。 MeBmt(OH)-η-CH2COOH1-CsA將MeBmt(OAc)-η-CH2COOEt1-CsA(11.0mg，8.27μmol，1330.76g/mol)溶于MeOH(2ml)中，并加入NaOMe(于MeOH中，1.30M，10ml)溶液中。在氮?dú)猸h(huán)境下室溫攪拌反應(yīng)混合物5小時，攪拌過程中加入H2O(2ml)，再將混合物攪拌2小時。反應(yīng)物經(jīng)用冰醋酸(1ml)驟冷，玻璃纖維過濾，反相HPLC(Rainin C18 dynamax，5u，300A，21.4mm×250mm，20ml/min，50至90％ACN/H2O(+0.1％TFA)，30分鐘，70℃)純化，可得到5.5mg(產(chǎn)率為53％)白色固體。 雙-TBS-N-(6-(Boc-氨基)己基)FK506氨基甲酸酯將雙-TBS-FK506琥珀酰亞氨基碳酸酯(也是(tbs)4-FK1012的前體)(5.8mg，1177.62g/mol，4.93μmol)溶于DCM中，在此溶液中加入N-Boc-1，6-二氨基己烷(7.25mg，過量)。在室溫下攪拌10分鐘后蒸發(fā)反應(yīng)混合物，經(jīng)用10至40％乙酸乙酯/己烷洗脫，通過快速層析純化可得到5.9mg(產(chǎn)率為94％)產(chǎn)物。
N-(6-氨基己基)FK506氨基甲酸酯將雙-TBS-N-(6-(Boc-氨基)己基)FK506氨基甲酸酯(5.9mg，1278.88g/mol，4.61μmol)轉(zhuǎn)移到盛有ACN(700μl)的聚丙烯管中，再加入HF水溶液(49％，100μl)。室溫下6小時后反應(yīng)完全，緩慢加入飽和的NaHCO3溶液使反應(yīng)物驟冷，用飽和NaHCO3(4ml)，H2O(4ml)稀釋混合物，并用DCM(3×10ml)抽提之。用MgSO4干燥合并的有機(jī)相，過濾并蒸發(fā)之可得到3.6mg(產(chǎn)率為82％)粗產(chǎn)物。 將MeBmt(OH)-η-CH2COOH1-CsA(2.86mg，2.27μmol，1260.66g/mol)和N-(6-氨基己基)FK506氨基甲酸酯(粗品，2.16mg，2.28μmol，949.21g/mol)溶于DCM(900μl)中，在此溶液中加入127μl(3.0當(dāng)量，6.8μmol)于DCM(500μl)中的BOP(11.9mg，442.5g/mol)溶液，再加入45μl(2.25當(dāng)量，5.1μmol)于DCM(1.0ml)中的二異丙基乙胺溶液(20μl，d＝0.742129.25g/mol)，最后加入DMF(40μl)，在氮?dú)饬飨拢覝鼐徛舭l(fā)反應(yīng)混合物達(dá)12小時，用乙腈(1ml)稀釋反應(yīng)混合物，并經(jīng)玻璃纖維過濾，反相HPLC(Beckman C18，1cm×25cm，5ml/min，50至90％ACN/H2O，25分鐘，50℃)純化，可得到2.4mg(產(chǎn)率為48％)白色固體。 實施例22(A)基于結(jié)構(gòu)所作的設(shè)計和FK1012“隆起塊”化合物及其有補(bǔ)償性突變的FKBP12的合成可以是或者已通過合成得到的FK506的C9和C10位上的取代基，與不同組的FKBP12側(cè)鏈殘基相抵觸。因此，這些配體的一類突變受體應(yīng)包含不同的修飾，其中一個造成C10取代基的補(bǔ)償性空穴，一個則造成C9取代基的補(bǔ)償性空穴。對碳10進(jìn)行選擇性修飾使之具有從碳上突出的N-乙?；騈-甲?；鶊F(tuán)(與FK506中的羥基基團(tuán)相對)。這些衍生物的橋接性質(zhì)清楚地表明，C10隆起塊有效消除與固有FKBP12的結(jié)合。圖21圖解顯示了含有附加之C9隆起塊之FK506型部分的合成。使這樣的配體與本發(fā)明的接頭部分相組合即可構(gòu)成制備嵌合蛋白質(zhì)的HED和HOD(及拮抗劑)試劑，其中所說的嵌合蛋白質(zhì)含有攜帶補(bǔ)償突變的相應(yīng)結(jié)合區(qū)。圖21中圖解說明了包含C9和C10′位上的修飾基團(tuán)的HED試劑。
因此本發(fā)明包括一類含有FK-506型部分的FK-506型化合物，所說的部分在C9和C10之一或兩者上含有選自-OR、-R、-(CO)OR、-NH(CO)H或-NH(CO)R，其中R是被取代或未被取代的，可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基或芳基烷基的功能性基團(tuán)，包括被取代或未被取代的過氧化物，以及碳酸酯?！癋K506型部分”包括FK506、FK520和至少保留FK506環(huán)結(jié)構(gòu)的(被取代或未被取代的)C2至C15部分，并能夠較好以低于約10-6M的Kd值與天然或被修飾的FKBP結(jié)合的其合成的或天然產(chǎn)生的變異體、類似物及衍生物(包括雷帕霉素)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有一個或多個共價結(jié)合到本發(fā)明之接頭部分上的這類FK-506型化合物的同或異二聚體及更高級低聚合體。這些FK-506型化合物的單體也是有用的，而不管是否共價結(jié)合到接頭部分上，也不管是否經(jīng)過修飾進(jìn)而沒有消除它們對相應(yīng)FKBP的結(jié)合親和力?？梢允褂眠@些單體化合物作為低聚合拮抗劑，即作為基于象FK-506型化合物之低聚合試劑的拮抗劑。根據(jù)本發(fā)明包含它們的化合物和低聚體較好以至少0.1％，更好至少以大約1％，最好以至少大約10％的親和力，如大到FK506對FKBP12的親和力(參見Holt et al.，下文)，與天然的或優(yōu)選突變的FKBP結(jié)合。
可用基于結(jié)構(gòu)的，位點(diǎn)特異性的或隨機(jī)的誘變方法制得本發(fā)明的這些和其他配體的受體區(qū)域。我們研究了一個FKBP12部分的家族，其含有Val、Ala、Gly、Met或其他小氨基酸代替Tyr26、Phe36、Asp37、Tyr82和Phe99中的一個或多個氨基酸，以作為包括C9和/或C10位修飾的FK506型和FK-520型配體的受體區(qū)域。我們尤其期望使用與FK506型和FK520型配體結(jié)合的FKBP，F(xiàn)KBP中具有小的置換，如Gly或Ala置換Asp37，而配體在C10位有取代基(如-NHCOR，其中R是烷基，優(yōu)選為低級烷基如甲基或-NHCHO)，還期望使用在C9位含有置換(如Oxazalines或亞胺類)的FK506型和FK520型配體結(jié)合的FKBP，F(xiàn)KBP中含有小的置換，如Gly或Ala置換Phe36，Phe99和Tyr26 。
可使用大引物誘變法(參見Sakar and Sommer，Bio Techniques84(1990)404-407)進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變。用序列酶(Sequenase)試劑盒進(jìn)行cDNA序列測定?？稍诎诖竽c桿菌菌株XKA90中的質(zhì)粒pHN1+中進(jìn)行突變體FKBP12的表達(dá)，因為許多FKBP12突變體均已在該系統(tǒng)中獲得了有效地表達(dá)?？砂匆衙枋鲞^的方法(例如參見Aldape et al.，J.Biol.Chem.267，23(1992)16029-32和Park et al.，J.Biol.Chem.267，5(1992)3316-3324)，通過DE52陰離子交換樹對脂進(jìn)行分級分離，然后在Sepharose柱上進(jìn)行分子篩分離以方便地純化突變體蛋白質(zhì)。可按兩種方法之一很容易地確定結(jié)合常數(shù)。如果突變的FKP保留有足夠的異構(gòu)酶(rotamase)活性，可利用標(biāo)準(zhǔn)異構(gòu)酶檢測法(如參見Galat et al.，Biochemistry 31(1992)2427-2434)。否則可使用我們以前用于檢測FKBP和親環(huán)素的LH20樹脂和放射標(biāo)記的3H2-二氫FK506及3H2-二氫CsA，對突變的FKBP12進(jìn)行結(jié)合試驗(Bierer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，4(1993)555-60)。
(B)使用酵母二雜種系統(tǒng)選擇隆起塊-FK506的FKBP12中的補(bǔ)償突變得到包括FKBP12的受體蛋白質(zhì)或區(qū)域之變異體的一種方法是酵母“二雜種”或“相互作用陷阱”系統(tǒng)。已使用二雜種系統(tǒng)確定彼此相互作用的蛋白質(zhì)。由融合到轉(zhuǎn)錄激活區(qū)上靶蛋白質(zhì)組成的“鉺”融合蛋白質(zhì)與融合到DNA結(jié)合區(qū)上的潛在的“鉤”的cDNA庫共表達(dá)。根據(jù)受體基因產(chǎn)物(其合成需要連接DNA結(jié)合和激活區(qū))的出現(xiàn)來確定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)(鉺-鉤)相互作用。本文提到的酵母二雜種系統(tǒng)最初是由Elledge和其同事共同建立的(Durfee et al.，Genes&Development 74(1993)555-69和Harper et al.，Cell 75，4(1993)805-816)。
因為二雜種系統(tǒng)不能提供對涉及小分子有機(jī)配體的受體-配體相互作用的深入了解，所以我們已發(fā)展了一種新的、FK1012可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)(見下文所述)。使用該系統(tǒng)可以擴(kuò)展二雜種系統(tǒng)，從而能夠深入研究小分子(例如本發(fā)明的FK506或FK1012或FK506型分子)。首先產(chǎn)生具有區(qū)域定位于FK506的C9和C10周圍位點(diǎn)處之突變的FKBP(“鉤”)的cDNA庫。對于“鉺”來說可采取兩種不同的策略。第一個是利用FK506與FKBP12結(jié)合的能力并造成一個與calcineurin結(jié)合的復(fù)合表面。因此序列特異性轉(zhuǎn)錄激活物由下列部分組成DNA結(jié)合區(qū)-突變FKBP12-隆起塊FK506-calcineurinA-激活區(qū)(其中“-”是指非共價結(jié)合相互作用)。第二個策略利用FK1012同時與二種FKBP結(jié)合的能力?？墒褂肍K1012的HED變體篩選下列集合體DNA結(jié)合區(qū)-突變FKBP12-隆起塊FK506-正常FK506-野生型FKBP12-激活區(qū)。
1.作為“鉺”的calcineurin-Gal4激活區(qū)融合體已構(gòu)建了含有Gal4激活區(qū)和calcineurin A亞單位融合構(gòu)建體的pSE1107的衍生物。已使用二雜種系統(tǒng)制出calcineurin的FKBP-FK506結(jié)合位點(diǎn)圖譜，研究證實了其以所提出的方式作為“鉺”的能力。
2.作為“鉺”的hFKBP12-Gal4激活區(qū)融合體作為包括完整開放讀碼的EcoRI-HindIII片段，切下hFKBP12cDNA，修成平頭并與已修成平頭的pSE1107的XhoI位點(diǎn)連接，以產(chǎn)生全長度hFKBP-Ga14激活區(qū)蛋白質(zhì)融合體。
3.突變體hFKBP12cDNA庫可用EcoRI和HindIII消化hFKBP12，修成平頭并克隆到已用NcoI切割并修成平頭的pAS1(Durfeeet al，文獻(xiàn)同上)中。進(jìn)一步用NdeI消化該質(zhì)粒以除去pAS1之多聚接頭序列中NdeI位點(diǎn)和hFKBP12之5′末端間的NdeI片段，并再連接之，從而產(chǎn)生hFKBP12-Gal4DNA結(jié)合區(qū)蛋白質(zhì)融合體。用引物#11206和#11210再次擴(kuò)增hFKBP。引物表11206 NdeI5NdFK 5′-GGAATTC CAT ATG GGC GTG CAG G-3′H M G V QD11207 SmoI35mFK375′-CTGTC CCG GGA NNN NNN NNN TTT CTT TCC ATC TTC AAG C-R S X X X K K G D E L11208 SmaI35mFK275′-CTGTC CCG GGA GGA ATC AAA TTT CTT TCC ATC TTC AAG CAR S S D F K K G D E L MNNN NNN NNN GTG CAC CAC GCA GG-3′X X X H V V C11209 BomHI3BmFK985′-CGC GGA TCC TCA TTC CAG TTT TAG AAG CTC CAC ATC NNNEND E L K L L E V D XNNN NNN AGT GGC ATG TGG-3′X X T A H P11210 BamHI3BmFK 5′-CGC GGA TCC TCA TTC CAG TTT TAG AAG C-3′5ND E L K L L引物表用于構(gòu)建區(qū)域定位的hFKBP 12cDNA文庫的引物，用以篩選補(bǔ)償性突變。
然后使用下面列出的在限定的位置上含有hFKBP之隨機(jī)化突變序列的引物，以聚合酶鏈反應(yīng)法制備突變體hFKBP 12cDNA片段，并將其插入Ga l4DNA結(jié)合區(qū)-hFKBP(NdeI/BamHI)構(gòu)建體中。
4.酵母菌株釀酒酵母Y153攜帶兩個被整合到基因組中并由Gal4啟動子(Durfea，文獻(xiàn)同上)驅(qū)動的可選擇標(biāo)志基因(his3/β-半乳糖苷酶)。
使用Calcineurin-Gal4激活區(qū)域作為“鉺”。FKBP12-FK506復(fù)合物以高親和力與calcineurin-一種2B型磷酸酶蛋白質(zhì)相結(jié)合。因為我們使用C9或C10有隆起的配體作為二雜種系統(tǒng)中的橋，所以只有含補(bǔ)償突變的cDNA庫中的FKBP才產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活劑。為方便起見，可以制備各含有8,000個突變FKBP12的至少三個不同的文庫(使用引物表中的引物11207-11209)。經(jīng)檢查FKBP12-FK506結(jié)構(gòu)來選擇隨機(jī)化的位點(diǎn)，此提示突變的殘基群可允許令人討厭的C9或C10取代基結(jié)合于有隆起基團(tuán)的FK506上。然后使用C9和C10帶隆起基團(tuán)的FK506分別篩選各文庫。可根據(jù)宿主酵母在his滴落(drop-out)培養(yǎng)基上生長的能力及β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)確定帶隆起基因之FK506與補(bǔ)償性hFKBP12突變體的相互作用。因為這一選擇取決于帶隆起基因之FK506的存在，可使用添加或未添加帶隆起之基團(tuán)FK506配體的復(fù)制板，經(jīng)扣除篩選(substractive screening)排除假陽性。
使用hFKBP12-Gal4激活區(qū)作為“鉺”。使用calcineurin A-Gal4激活區(qū)篩選hFKBP12突變cDNA庫是-種鑒定FKBP12上補(bǔ)償突變的簡單方法。但是，使帶隆起基團(tuán)的FK506與hFKBP12結(jié)合的突變可破壞突變FKBP12-帶隆起FK506復(fù)合物與calcineurin間的相互關(guān)系。如果用calcineurin作為鉺的初始篩選有錯誤，則可以使用野生型hFKBP12-Gal4激活區(qū)代替之?？梢院铣砂ü逃蠪K506-帶隆起部分的FK506(圖16)組成的FK1012HED試劑并用作“鉤”。FK1012的FK506部分可以結(jié)合FKBP12-Gal4激活區(qū)。FKBP12的帶隆起FK506部分與FKBP12補(bǔ)償?shù)难a(bǔ)償突變體間的相互作用，可使宿主酵母生長在his滴落培養(yǎng)基上生長并表達(dá)β-半乳糖苷酶。以這種方式，單獨(dú)基于hFKBP12突變體與帶隆起基團(tuán)的FK506反應(yīng)的能力進(jìn)行選擇。可使用同樣的扣除篩選策略排除假陽性。
除了較早討論的體外結(jié)合試驗外，還可以使用體內(nèi)試驗確定帶隆起之FK506與補(bǔ)償性hFKBP12突變體的結(jié)合親和力。在酵母二雜種系統(tǒng)中，可根據(jù)“鉺”和“捕獲物”間相互作用的程度來確定β-gal活性。因此，可根據(jù)在不同的HED(天然FK506-帶隆起的FK506)濃度下由宿主酵母產(chǎn)生的相應(yīng)β-半乳糖苷酶活性來估計帶隆起之FK506和補(bǔ)償性FKBP12突變體間的親和力。
使用同樣的策略，可以以低親和力補(bǔ)償性FKBP12突變體作為模板產(chǎn)生涉及其他隆起塊接觸殘基的附加隨機(jī)化突變體FKBP12cDNA文庫，并進(jìn)行相似的篩選。
對高親和力補(bǔ)償性FKBP突變的噬菌體展開篩選法(displayscreening)。有些隆起塊FK506的高親和力hFKBP12突變體可在蛋白質(zhì)的不連續(xù)區(qū)域含有幾個結(jié)合的點(diǎn)突變。含有適當(dāng)結(jié)合之突變的文庫，對于酵母二雜種系統(tǒng)的能力來說可能是太大了(例如＞108個突變)。使用噬菌體作為顯露整個功能性蛋白質(zhì)的載體，將會大大提高篩選大數(shù)目突變的能力(如參見Bass et al，ProteinsStructure，F(xiàn)unction&Genetics 84(1990)309-14；McCafferty et al.Nature 348，6301(1990)552-4和Hoogenboom，Nuci.Acids Res.19，15(1991)4133-7)。如果不能用酵母二雜種系統(tǒng)鑒定所需的高親和力補(bǔ)償性突變體，則可以用噬菌體載體在hFKBP12上造成大數(shù)目的組合突變?？梢杂脦∑鹬瓼K506-Sepharose作為親和性基質(zhì)(其可按我們按原來合成基于FK506的親和基質(zhì)的相似方法合成，參見Fretz et al，J.Am.Chem.Soc.113，4(1991)1409-1411)，篩選突變的hFKBP12融合噬菌體。重復(fù)進(jìn)行結(jié)合和噬菌體擴(kuò)增循環(huán)即可鑒定高親和力補(bǔ)償性突變體。
(C)“帶隆起的(CsA)2s”的合成MeVal(11)CsA的修飾如上文詳述的，我們已證明在細(xì)胞死亡信號發(fā)生途徑相關(guān)的解決方案中，使用親環(huán)素作為二聚合區(qū)和(CsA)2作為HOD試劑的可行性。然而，為了使(CsA)2試劑的細(xì)胞活性最佳化，應(yīng)依據(jù)如就FK1012所描述的相似策略。因此，在應(yīng)用中應(yīng)優(yōu)選經(jīng)過修飾的(產(chǎn)生隆起基團(tuán)的)基于CsA的低聚合試劑，此時特別希望該試劑將能夠從內(nèi)源性親環(huán)素中區(qū)別出它的靶，即人工蛋白質(zhì)構(gòu)建體。
本發(fā)明的一類被修飾的CsA衍生物是CsA類似物，其中(a)NMeVal 11被NMePhe(其可以是被取代或未被取代的)或NMeThr(其可以是未被取代或在蘇氨酸β羥基基團(tuán)上被取代的)取代，或(b)NMeVal 11的前S甲基基團(tuán)被至少有2個碳原子，較好有3個或更多個碳原子的大基團(tuán)取代，所說的取代基可以是直鏈、分支鏈的和/或含有環(huán)部分的，并可以是烷基(乙基，或更好是丙基、丁基包括叔丁基等)、芳基或芳基烷基。這些化合物包括在MeVal 11的位置上包含NMeLeu、NMeIle、NMePhe或特別是非天然的NMe[βMePhe]的CsA類似物。“(b)”CsA化合物是有結(jié)構(gòu)式2的化合物，其中R代表如上所述的功能性基團(tuán)。
本發(fā)明包括其中含有一個或多個這樣的CsA類似物的同和異二聚體及更高級低聚體。優(yōu)選本發(fā)明的包含它們的化合物和寡聚體以至少0.1％，較好至少約1％，更好至少約10％的親和力，如大至CsA對親環(huán)素的親和力與天然的，或較好是突變的親環(huán)素蛋白質(zhì)的結(jié)合。
可以使用兩步驟策略從CsA開始制備經(jīng)修飾的[MeVal11]CsA衍生物。第一步中，從大環(huán)上去掉殘基MeVal11。第二步中，在(在先的)MeVal11位點(diǎn)上引入選擇的氨基酸并使線性肽環(huán)化。與總體合成相比較，該策略的優(yōu)點(diǎn)是易于通向幾種經(jīng)修飾的[MeVal11]CsA衍生物。合成流程如下 為了區(qū)分酰胺鍵，已在MeBmt1的氨基和羥基基團(tuán)間實現(xiàn)了N，O移換，從而得到TsoCsA(Ruegger et al，Helv.Chim.Acta 59，4(1976)1075-92)(參見上列流程)。反應(yīng)在甲磺酸存在下于THF中進(jìn)行(Oliyai et al，Pharm.Res.95(1992)617-22)。以一罐法在吡啶和乙酐存在下用乙?；鶊F(tuán)保護(hù)游離胺。N-乙?；Ｗo(hù)的lsoCsA的總產(chǎn)率為90％。然后于N-甲基酰胺鍵存在下，例如使用DIBAL-H選擇性地還原酯MeBmt1-MeVal11鍵。將所得到的二醇轉(zhuǎn)化成有另一個酸誘導(dǎo)的N，O移換的相應(yīng)的二酯。如此將制得通過用含水堿水解新形成的酯除去的N-乙?；鶊F(tuán)和MeVal11殘基。
在保護(hù)游離氨基基團(tuán)之后，例如用PyBrop偶聯(lián)劑引入新的氨基酸殘基。在DMAP存在下用BOP使線性肽去保護(hù)并環(huán)化(A1berg andSchreiber，Science262，5131(1993)248-250)以完成2的合成。用估測FK506和FK1012的同樣方法估測帶隆起的CsA與親環(huán)素的結(jié)合親和力。一旦鑒定了有補(bǔ)償性突變的親環(huán)素，即可按照以前描述過的方法合成帶隆起基因的(CsA)2HED和HOD試劑。其中特別有用的是可形成二聚體的帶隆起的CsA化合物，其本身可按1∶2化學(xué)計算量與親環(huán)素蛋白質(zhì)結(jié)合?？梢栽O(shè)計至少含有一個這樣的CsA或被修飾的CsA部分的同二聚體和更高級同低聚體、異二聚體和更高級異低聚體，并使用為FK1012A和(CsA)2而建立的方法估計之，同時按研究FK1012的相以方法使接頭元件最佳化。
現(xiàn)在有可能通過在配體上容納額外的大基團(tuán)制備結(jié)合我們的11位CsA變異體(2)突變的親環(huán)素?？梢酝ㄟ^在FK1012研究中所述的基于結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)特異性和隨機(jī)誘變/篩選方法鑒定帶有這些補(bǔ)償性突變的親環(huán)素。
上述結(jié)果表明，本方法和組合物在生產(chǎn)野生型變種細(xì)胞中的廣泛通用性。利用本發(fā)明的構(gòu)建體，可將細(xì)胞用于治療目的，其中細(xì)胞可在使用前保持無活性狀態(tài)，并在給予一種安全的藥物后使之被激活。因為細(xì)胞在宿主體內(nèi)有野生品種的生活史，所以有機(jī)會處理慢性和急性病癥以提供短期或長期保護(hù)作用。另外，可以提供將被導(dǎo)向特定部位，如解剖部位或功能部位的細(xì)胞，并借以在該部位提供治療效果。
可提供將導(dǎo)致分泌各種品種蛋白質(zhì)的細(xì)胞，其可用于糾正缺陷或抑制不希望的后果，如激活溶胞性細(xì)胞、失活有害因子、殺死受限制的細(xì)胞群體等。由于細(xì)胞在限定的期間內(nèi)存在于宿主中，所以給予足可導(dǎo)致細(xì)胞在宿主中的迅速反應(yīng)之劑量的藥物即很容易將細(xì)胞激活?？梢蕴峁┦蛊渲斜槐磉_(dá)的嵌合受體存在于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞，故可避免由于細(xì)胞表面上的外來蛋白質(zhì)引起的免疫反應(yīng)。此外，細(xì)胞內(nèi)嵌合受體蛋白質(zhì)在為配體結(jié)合后的有效信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了條件，這顯然比在細(xì)胞外受體區(qū)上的受體結(jié)合更為有效。
使用與嵌合膜結(jié)合受體結(jié)合的相對簡單的分子，導(dǎo)致有用產(chǎn)物的表達(dá)或抑制該產(chǎn)物的表達(dá)，從而可提供細(xì)胞治療效果。可以以多種途徑使用可安全給藥的化合物，并可保證出現(xiàn)很特異的反應(yīng)，以致不會攪亂體內(nèi)平衡。
本說明書中列出的所有出版物和專利申請都摻入本文作參考文獻(xiàn)，如同個別出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e地和各自地指出其列為本文參考文獻(xiàn)一樣。
雖然為了清楚了解本發(fā)明的目的在一定程度上詳細(xì)舉例描述了本發(fā)明，但對本發(fā)明技術(shù)教導(dǎo)的某些沒有超出待批權(quán)利要求書之精神實質(zhì)或范圍的改變和改動，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.編碼嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體，所說的嵌合蛋白質(zhì)包括(a)至少一個能夠與所選配體結(jié)合的受體區(qū)域；和(b)異源蛋白質(zhì)區(qū)域，在細(xì)胞暴露于配體之后，它能啟動含有所說嵌合蛋白質(zhì)的細(xì)胞的程序化死亡；所說配體能夠結(jié)合兩個或更多個嵌合蛋白質(zhì)分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中嵌合蛋白質(zhì)進(jìn)一步包括能夠?qū)⑶逗系鞍踪|(zhì)導(dǎo)向預(yù)期之細(xì)胞對應(yīng)部分的細(xì)胞內(nèi)靶向區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體，其中細(xì)胞內(nèi)靶向區(qū)域包括分泌性前導(dǎo)序列、跨膜序列區(qū)域、膜結(jié)合區(qū)域或者指導(dǎo)蛋白質(zhì)與泡囊或與核聯(lián)系的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中嵌合蛋白質(zhì)與所選配體結(jié)合的Kd值小于或等于大約10-6M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中所選配體的分子量小于約5kDa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA構(gòu)建體，其中異源蛋白質(zhì)區(qū)域含有人Fas或人TNFα受體的胞質(zhì)區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的DNA構(gòu)建體，其中嵌合蛋白質(zhì)能結(jié)合于FK506型配體，環(huán)孢菌素A型配體，四環(huán)素或類固醇配體。
8.DNA載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的DNA構(gòu)建體和允許將DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中并選擇含有該構(gòu)建體之轉(zhuǎn)染體的可選擇標(biāo)志。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的DNA載體，其中載體是病毒載體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的病毒載體，其為腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。
11.由根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的DNA構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)。
12.含有并能夠表達(dá)至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項之DNA構(gòu)建體的細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞，將之與所選配體接觸后可變?yōu)槌绦蚧劳觥?br> 14.根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)胞，其為哺乳動物細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)胞，其進(jìn)一步含有(a)編碼嵌合蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體，其中嵌合蛋白質(zhì)包括(i)至少一個能夠與第二個所選配體結(jié)合的受體區(qū)域和(ii)另一個蛋白區(qū)域，它對于所述受體區(qū)域來說是異源的，但當(dāng)在與一個或多個其他相似區(qū)域低聚合后能夠激發(fā)處于對所說的低聚合起反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件之轉(zhuǎn)錄控制下的靶基因轉(zhuǎn)錄的活化；和(b)處于對所說的低聚合有反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄控制元件之表達(dá)控制下的靶基因；將此細(xì)胞暴露于所說第二個所選配體后可表達(dá)靶基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)胞，其含有編碼下列蛋白質(zhì)的系列DNA構(gòu)建體；(a)含有DNA結(jié)合區(qū)和至少一個能夠與第一個所選配體部分結(jié)合的受體區(qū)的第一種另外的嵌合蛋白質(zhì)；和(b)含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和至少一個能夠與第二種選擇的配體(其可以相同或不同于第一種選擇的配體部分)結(jié)合之受體區(qū)域的第二種另外的嵌合蛋白質(zhì)；和以及編碼靶基因的第二個DNA構(gòu)建體，所說的靶基因處于異源轉(zhuǎn)錄控制序列的轉(zhuǎn)錄控制之下，而所說的轉(zhuǎn)錄控制序列與DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合并對轉(zhuǎn)錄激活區(qū)有反應(yīng)；所說的細(xì)胞在接觸到含有選擇之配體部分的物質(zhì)后即表達(dá)靶基因。
17.使用能啟動根據(jù)權(quán)利要求13的基因工程細(xì)胞程序化死亡的配體以制備消除所說細(xì)胞群體的藥用組合物的用途，所說的配體具有下列結(jié)構(gòu)式接頭-{rbm1，rbm2，…rbmn}其中n是2至大約5的整數(shù)，rbm(1)-rbm(n)是可以相同或不同的并能夠與嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的受體結(jié)合部分，所說的rbm部分被共價結(jié)合到接頭部分上，后者則是能夠與兩個或多個rbm部分共價連接(“-”)的雙或多功能分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細(xì)胞群體的藥用組合物，其中配體具有小于約5kDa的分子量。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細(xì)胞群體的藥用組合物，其中配體含有FK506型部分、環(huán)孢菌素型部分、類固醇或四環(huán)素。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細(xì)胞群體的藥用組合物，其中配體以大于約10-5M的Kd值結(jié)合于天然存在的受體上。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細(xì)胞群體的藥用組合物，其中配體包含F(xiàn)K506、FK520、雷帕霉素或其在C9、C10或兩者上被修飾之衍生物的分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的用途，即使用配體以制備可消除基因工程細(xì)胞群體的藥用組合物，其中配體含有接頭部分，該部分包括C2-C20亞烷基、C4-C18氮雜亞烷基、C6-C24N-亞烷基氮雜亞烷基、C6-C18亞芳基、C8-C24芳二亞烷基(ardialkylene)或C8-C36雙-羧酰氨基亞烷基部分。
23.消除根據(jù)權(quán)利要求13的基因工程細(xì)胞群體的方法，包括將細(xì)胞暴露于有效量的能與嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合的配體中以導(dǎo)致發(fā)動細(xì)胞死亡。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中細(xì)胞生長于培養(yǎng)基中，并經(jīng)向培養(yǎng)基中加入配體而使細(xì)胞與配體接觸。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中細(xì)胞存在于宿主生物體內(nèi)，并經(jīng)給宿主生物體施用配體而使細(xì)胞與配體接觸。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中宿主生物體是哺乳動物，并且配體經(jīng)口服、口內(nèi)、舌下、透皮、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)及吸入途徑，在其適當(dāng)載體中給藥。
27.產(chǎn)生能被有選擇地殺死之細(xì)胞的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的DNA構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求2 7的方法，進(jìn)一步包括選擇含有引入DNA構(gòu)建體的那些細(xì)胞。
29.包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-7中任何一項的DNA構(gòu)建體的試劑盒。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的試劑盒，其還包含由DNA構(gòu)建體編碼的一種或多種嵌合蛋白質(zhì)與之結(jié)合的配體。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的試劑盒，其還包含作為配體-嵌合蛋白質(zhì)結(jié)合之拮抗劑的單體配體試劑。
32.含有根據(jù)權(quán)利要求12-16中任一項的細(xì)胞的宿主生物體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的宿主生物體，其是植物或動物生物體。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的動物，其為蠕蟲、昆蟲或哺乳動物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的哺乳動物，其為小鼠或其他嚙齒動物或人。
全文摘要
我們開發(fā)了一種調(diào)節(jié)(可誘導(dǎo)的)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)二聚或低聚合的通用方法，并公開了使用此方法以可調(diào)節(jié)地啟動基因工程細(xì)胞中細(xì)胞特異性的細(xì)胞程序死亡(程序化的細(xì)胞死亡)的方法和材料。
文檔編號C12N15/00GK1130401SQ9419325
公開日1996年9月4日 申請日期1994年7月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月16日
發(fā)明者G·R·克拉特里, S·L·施賴伯, D·M·施潘塞, T·J·萬列斯, P·貝肖 申請人:萊蘭斯坦福初級大學(xué)評議會, 哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會