專利名稱：在細胞中激發(fā)細胞編程性死亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在細胞特別是腫瘤細胞中激發(fā)細胞編程性死亡的方法。
細胞編程性死亡是程序性細胞死亡，其受精確控制，細胞編程性死亡可以被誘導(dǎo)或抑制。
已知細胞編程性死亡可被各種所謂的死亡受體誘導(dǎo)，死亡受體是含有死亡結(jié)構(gòu)域(DD)如CD95,TNF-RI,DR3,DR4或DR5的受體，這些受體在與其配體結(jié)合后誘導(dǎo)細胞編程性死亡信號途徑。例如，CD95受體與CD95配體結(jié)合后，CD95受體與銜接蛋白質(zhì)FADD/MORT1相互作用從而誘導(dǎo)蛋白酶FLICE/Caspase-8在DISC“死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物”處的募集和活化。FADD和FLICE均含死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)。經(jīng)這些細胞編程性死亡信號途徑誘導(dǎo)的細胞編程性死亡可來自外部，例如給予細胞毒素(細胞毒性物質(zhì))，輻射，病毒，除去生長因子或機械性細胞損傷。但是，細胞編程性死亡誘導(dǎo)的這些可能性可伴有若干缺點。例如，給予細胞毒素如細胞抑制性制劑，或?qū)Π┘毎妮椛?，?dǎo)致抗性的產(chǎn)生以及對正常細胞的損害，在這些正常細胞中實際上不應(yīng)誘導(dǎo)細胞編程性死亡。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于誘導(dǎo)細胞編程性死亡的方法，例如對抗惡性生長，并同時減少上述副反應(yīng)。
本發(fā)明的目的由權(quán)利要求書中定義的內(nèi)容實現(xiàn)。
本發(fā)明基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，即在動物、特別是哺乳動物、更特別是人中，存在一種適合誘導(dǎo)細胞編程性死亡的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)的大小約為16kD，并且已被鑒定為DNA結(jié)合蛋白(Nehls等，核酸研究，26,1160-1166(1998))。
本發(fā)明人認識到適合誘導(dǎo)細胞編程性死亡的蛋白質(zhì)(以下稱為C1D)存在于每個細胞中，也存在腫瘤細胞中，在細胞中其以生物體預(yù)定的量表達。當C1D基因產(chǎn)物過表達時，在過表達的細胞中誘導(dǎo)細胞編程性死亡。但是，特別是在腫瘤細胞中，由過表達獲得的細胞編程性死亡是所需的，這一過表達可殺死腫瘤細胞。另外，其可促進由常用腫瘤療法如化療或輻射實現(xiàn)的細胞編程性死亡。細胞編程性死亡也可在已對常用療法產(chǎn)生抗性的腫瘤細胞中實現(xiàn)。本發(fā)明人現(xiàn)發(fā)現(xiàn)細胞編程性死亡可通過過表達C1D基因、即增加細胞C1D基因產(chǎn)物的濃度而誘導(dǎo)。這可通過例如用表達C1D基因的表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細胞或通過刺激內(nèi)源性C1D基因的過表達而實現(xiàn)。
C1D基因產(chǎn)物包括

圖1或圖2的序列或與其有一或多個氨基酸不同的氨基酸序列。術(shù)語“與其有一或多個氨基酸不同的氨基酸序列”包括編碼C1D(相關(guān))蛋白的任何氨基酸序列，其DNA序列與圖1或圖2的DNA雜交。術(shù)語“雜交”見下列解釋。
DNA特別是cDNA形式的編碼C1D的核酸特別適合進行本發(fā)明的方法。DNA是優(yōu)選的，其包含(a)圖1或圖2的DNA或與其有一或幾個堿基對不同的DNA，后一DNA與圖1或圖2的DNA雜交，或(b)經(jīng)簡并的遺傳密碼與(a)的DNA相關(guān)的DNA。
圖1和圖2的C1D cDNA的序列數(shù)據(jù)可由基因文庫獲得，登錄號為小鼠cDNA:X95591；人cDNA:X95592。
術(shù)語“有一或幾個堿基對不同的DNA”包含編碼C1D(相關(guān))蛋白的任何DNA序列，其與圖1或圖2的DNA雜交。該DNA可由于一或幾個堿基對的添加、缺失、取代和/或顛換或本領(lǐng)域已知的其他修飾，例如可變剪接而與圖1或圖2的DNA不同。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“DNA”也可包含這一DNA的片段，術(shù)語“片段”應(yīng)包含原始核酸分子的區(qū)段，由此片段編碼的蛋白質(zhì)仍包含C1D的誘導(dǎo)細胞編程性死亡的性質(zhì)。這還包含等位基因變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉在核酸序列中產(chǎn)生上述修飾的方法，這種方法在分子生物學(xué)的標準著作中有描述，如Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1989)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還可確定由以此方式修飾的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)是否仍具有誘導(dǎo)細胞編程性死亡的生物學(xué)活性，例如通過檢測細胞編程性死亡典型的細胞死亡而確定，這種死亡的特征可為例如形態(tài)學(xué)，多中心染色質(zhì)凝聚，典型的膜改變和內(nèi)源性DNA降解。
術(shù)語“與…雜交的DNA”是指在正常條件下、特別是DNA的熔點之下20℃與圖1或圖2的DNA雜交的DNA。由此，術(shù)語“雜交”是指常規(guī)雜交條件，優(yōu)選的是使用5×SSPE,1％SDS,1×Denhardt溶液作為溶液的雜交條件，雜交溫度為35-70℃，優(yōu)選65℃。雜交后，首先在35-70℃的溫度優(yōu)選在65℃用2×SSC,1％SDS洗滌，然后用0.2×SSC洗滌(SSPE,SSC和Denhardt溶液的定義參見Sambrook等，文獻同上)。例如Sambrook等，文獻同上，描述的嚴格雜交條件是特別優(yōu)選的。
為產(chǎn)生適合進行本發(fā)明方法的C1D基因產(chǎn)物，編碼C1D的DNA被插入載體或表達載體，例如pBluescript,pQE8,pUC或pBR322衍生物。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子與允許其在真核宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)元件在載體中有功能地連接。這種載體除調(diào)節(jié)元件外還含有例如啟動子，典型地復(fù)制起點和允許轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型選擇的特異基因。用于在真核細胞中表達的調(diào)節(jié)元件包括CMV,SV40,RVS40啟動子，以及CMV或SV40增強子。合適的啟動子的另外的例子為金屬硫蛋白Ⅰ和多角體啟動子。
在優(yōu)選用于基因治療目的的實施方案中，包括C1D DNA的載體是一種病毒，例如腺病毒，痘苗病毒或腺伴隨細小病毒(AAV)。反轉(zhuǎn)錄病毒是特別優(yōu)選的，合適的反轉(zhuǎn)錄病毒的例子是MoMuLV,HaMuSV,MuMTV,RSV或GaLV。為基因治療的目的，本發(fā)明的核酸分子也可以膠體分散體的形式轉(zhuǎn)運至靶細胞，它們包括例如脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物(Lipoplexes)(Mannino等，生物技術(shù)6(1988),682)。
本領(lǐng)域已知的一般方法可用于構(gòu)建表達載體，特別是基因治療載體，其含有上述核酸分子和合適的控制序列。這些方法包括，例如體外重組技術(shù)，合成方法和體內(nèi)重組方法，例如由Sambrook等，文獻同上，所述。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何將本發(fā)明的DNA插入表達載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟悉這一DNA可與編碼另一種蛋白質(zhì)或肽的DNA聯(lián)合插入，從而本發(fā)明的DNA可以融合蛋白的形式表達，例如融合蛋白的另一部分是GFP(Aequorea Victoria的綠色熒光蛋白)。
為表達C1D基因，將上述表達載體導(dǎo)入宿主細胞，宿主細胞包括動物細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，可以是培養(yǎng)物和活生物體。優(yōu)選的是動物細胞L,3T3,FM3A,CHO,COS,Vero和HeLa。用上述載體轉(zhuǎn)化這些宿主細胞、檢測所發(fā)生的轉(zhuǎn)化以及表達本發(fā)明的核酸分子的方法是本領(lǐng)域公知的。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知培養(yǎng)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的細胞的條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知分離和純化由本發(fā)明的DNA表達的蛋白質(zhì)或融合蛋白的方法。
為進行本發(fā)明的方法，在一優(yōu)選的實施方案中，將C1D DNA導(dǎo)入一表達載體，特別是基因治療載體，以及細胞優(yōu)選腫瘤細胞中。在細胞中發(fā)生C1D蛋白的表達，其除了細胞固有的蛋白外，導(dǎo)致細胞編程性死亡的誘導(dǎo)。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的條件下將載體導(dǎo)入細胞。關(guān)于體內(nèi)基因治療，參照“K.W.Culver,基因治療，醫(yī)生手冊，Mary Ann Libert,Inc.，紐約，1994”和“P.L.Chang,Sonatic GeneTherapy,CRC出版社，倫敦，1995”。
在另一優(yōu)選的實施方案中，例如采用對內(nèi)源性C1D啟動子的外源性刺激以刺激細胞固有的C1D基因使之增加表達。一個基因的5′相鄰序列被稱作啟動子，其是RNA聚合酶Ⅱ的起點，其與轉(zhuǎn)錄因子合作實現(xiàn)基因的表達。在許多基因以及C1D中，這一過程可被外源因子誘導(dǎo)或刺激。實現(xiàn)基因的特異表達的因子非常多并且包括物理因子(如光、熱、冷)，低分子量無機物質(zhì)(如鹽、金屬離子)，低分子量有機物質(zhì)(肽、核酸模塊、生源性胺、類固醇)和聚合分子物質(zhì)(血清、生長因子、免疫刺激劑)。C1D基因特異的刺激劑通過將存在于例如BAC(細菌人工染色體)克隆上的5’相鄰序列與報道基因例如CAT或EGFP組合并檢測報道基因的表達和/或其被外源因子的刺激而識別，任選地采用高通量方法。
因此，本申請首次提供了不經(jīng)通常信號途徑而通過某一基因的過表達激發(fā)細胞編程性死亡的可能性。這對于許多疾病有特殊的重要性，特別是腫瘤疾病。腫瘤細胞對C1D過表達的應(yīng)答的敏感性比正常細胞的應(yīng)答要高這一事實被證明是特別有利的。因此，對正常細胞沒有副作用，而腫瘤細胞則安全死亡。
圖2顯示來自小鼠的C1D的DNA和氨基酸序列。
圖3示出在Ehrlich腹水腫瘤細胞中C1D過表達激發(fā)的細胞編程性死亡過程的時間過程(熒光顯微鏡術(shù)；激發(fā)480nm，發(fā)射520nm)。
圖4示出在Ehrlich腹水腫瘤細胞中C1D過表達激發(fā)的細胞編程性死亡過程過程中發(fā)生的形態(tài)學(xué)特征的例子(相差圖)。
本發(fā)明參照以下實施例解釋。
實施例1通過表達C1D基因誘導(dǎo)細胞編程性死亡-pcDNA3-C1D表達構(gòu)建體克隆在Bluescript載體(KS+,Stratagene公司)中編碼人或鼠C1D的cDNA經(jīng)PCR擴增，其中使用如下引物對于人cDNA正向引物5′-GGGGTACCATGGCAGGTGAAGAAATTAATGAAGACTAT反向引物5′-GGGTCGACTTAACTTTTACTTTTTCCTTTATTGGCAAC(實現(xiàn)圖1中堿基118-540的核苷酸序列的擴增)對于小鼠cDNA正向引物5′-GGGGTACCATGGCAGGTGAAGAAATGAATGAAGATTAT反向引物5′-GGGTCGACGTGTTTGCTTTTCCCTTTATTAGCCACTTT(實現(xiàn)圖2中堿基78-500的核苷酸序列的擴增)通過這些引物在ATG起始密碼子之前導(dǎo)入一Kpn限制位點，在終止密碼子之前導(dǎo)入一SalⅠ限制位點(從而終止密碼子被缺失)。用Clontech公司的PCR試劑盒(K1906-1)根據(jù)廠商指導(dǎo)在50微升體積中用如下試劑盒成分進行PCR反應(yīng)
水 38.8微升10×緩沖液 5微升乙酸鎂 2.2微升正向引物 1微升(1μM)反向引物 1微升(10μM)C1D模板 5微升(500ng)50×dNTP 1微升試劑盒聚合酶 1微升循環(huán)程序1)起始變性 94℃,1分鐘2)變性 94℃,30秒3)退火延伸 68℃,3分鐘4)最終延伸 68℃,3分鐘5)冷卻 4℃步驟2)/3)進行35次。
用KpnⅠ/SalⅠ限制消化擴增混合物后，先將片段再克隆進Bluescript載體(KpnⅠ/SalⅠ預(yù)處理的)中，在用KpnⅠ/NotⅠ從Bluescript載體中切下片段后，所述序列可克隆進相應(yīng)預(yù)處理的pcDNA3載體中(Invitrogen公司)。
-pcDNA 3-C1D-EGFP表達構(gòu)建體在pBluescript水平實現(xiàn)具有連續(xù)讀框的C1D和GFP(AequoreaVictoria的綠色熒光蛋白)的融合，為此，用SalⅠ/HindⅢ消化將上述pBluescript-(KpnⅠ)-C1D-(SalⅠ)質(zhì)粒開環(huán)。
用PCR擴增編碼EGFP的序列(Clontech公司；EGFP是指“增強的綠色熒光蛋白”，其是由Clontech公司生產(chǎn)的一種突變蛋白，具有改善的激發(fā)/發(fā)射性質(zhì))，在這一PCR中，使用下述引物正向引物5′-GGGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC反向引物5′-CCAAGCTTTGGAATTCTAGAGTCGCGGCCGCTTTA以將一SalⅠ位點插入5′末端，將一HindⅢ位點插入3′末端(此處在終止密碼子之后)。如上所述類似地進行PCR。
用SalⅠ和HindⅢ消化PCR擴增產(chǎn)物后，可將它們連接進制備的Bluescript-(KpnⅠ)-C1D-(SalⅠ)…(HindⅢ)質(zhì)粒。之后，經(jīng)相應(yīng)的消化從Bluescript載體中切下融合盒(KpnⅠ)-C1D-EGFP-(NotⅠ)，并再克隆進相應(yīng)預(yù)處理的pcDNA3載體(KpnⅠ/NotⅠ)。
-將載體轉(zhuǎn)染進腫瘤細胞通過電穿孔(Potter等，美國科學(xué)院院報81,7161-7165(1984))脂轉(zhuǎn)染(SuperFect轉(zhuǎn)染試劑手冊，Qiagen公司，Hilden,02/97,1997)將上述獲得的表達載體轉(zhuǎn)染進Ehrlich腹水腫瘤中。轉(zhuǎn)染的(活)細胞在顯微鏡(熒光光學(xué)系統(tǒng))下觀察并照相(圖3)。
轉(zhuǎn)染后12小時，20-60％細胞在細胞核中有弱綠熒光(未示出)，這指出融合蛋白最初中等程度表達，未發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)特征。載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染24小時后，在個別細胞中發(fā)生融合蛋白的聚集(圖3左側(cè))，這些聚集在相差圖中也可觀察到(圖4)。在進一步時間過程中，這些聚集變得更強(圖3，從左至右)，相差圖(圖4)相應(yīng)于經(jīng)歷細胞編程性死亡的細胞的典型圖。
在同一時間的圖中不是所有同時轉(zhuǎn)染的細胞均顯示融合蛋白的過量表達率，甚至在48-72小時仍觀察到如圖3左側(cè)的細胞，但其他細胞已到達它們的終點(圖3，右側(cè))。這表明培養(yǎng)的細胞以“錯開的方式”進入細胞編程性死亡過程。通過足夠高的轉(zhuǎn)染率，在最后的分析中，培養(yǎng)的所有細胞，即包括那些未被轉(zhuǎn)染的細胞均被殺死。這一情形取決于初始轉(zhuǎn)染率，通過轉(zhuǎn)染細胞的編程性死亡，對培養(yǎng)的未轉(zhuǎn)染細胞有害的因子被釋放，最終導(dǎo)致這些未轉(zhuǎn)染的細胞也被殺死(這被稱為“旁觀者效應(yīng)”)。
應(yīng)理解的是GFP(Aequorea Victoria的綠色熒光蛋白)僅用于在轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的細胞之間作一區(qū)分，或使過表達可見。GFP表達單獨對細胞形態(tài)學(xué)或細胞存活性無作用。GFP融合蛋白基本上具有與有功能基因產(chǎn)物相同的功能性質(zhì)(以及細胞內(nèi)分布)。附圖中示出的細胞編程性死亡過程因此基于C1D功能。所示出的形態(tài)學(xué)(以及細胞數(shù)的降低)在對照實驗中也出現(xiàn)，該對照實驗是通過僅包括C1D序列的構(gòu)建體(例如上述pcDNA 3-C1D表達構(gòu)建體)進行。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱德國癌癥研究中心(B)街道Im Neuenheimer Feld 280(C)城市海德堡(D)國家德國(E)郵編69120(ⅱ)發(fā)明名稱在細胞中激發(fā)細胞編程性死亡的方法(ⅲ)序列數(shù)目10(ⅳ)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,#1.30版(ⅴ)本申請數(shù)據(jù)未知(ⅵ)在先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朌E 19824811.3(B)申請日1998年6月3日(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1156個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無
(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置118..540(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵成熟肽(B)位置118..540(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CTTTCCGGGA GACTGGAGTC GAAGGCCGTG AGTATTTTCT AAGCCAGTGT TTAGAGAGTA 60TGTGAGGCAA GAGTACCTAT AGAACCCGGA GGAGGGTGAG GAGCAGAGCT GGCCATA 117ATG GCA GGT GAA GAA ATT AAT GAA GAC TAT CCA GTA GAA ATT CAC GAG165Met Ala Gly Glu Glu Ile Asn Glu Asp Tyr Pro Val Glu Ile His Glu1 5 10 15TAT TTG TCA GCG TTT GAG AAT TCC ATT GGT GCT GTG GAT GAG ATG CTG213Tyr Leu Ser Ala Phe Glu Asn Ser Ile Gly Ala Val Asp Glu Met Leu20 25 30AAG ACC ATG ATG TCT GTT TCT AGA AAT GAG TTG TTG CAG AAG TTG GAT261Lys Thr Met Met Ser Val Ser Arg Asn Glu Leu Leu Gln Lys Leu Asp35 40 45CCA CTT GAA CAA GCA AAA GTG GAT TTG GTT TCT GCA TAC ACA TTA AAT309Pro Leu Glu Gln Ala Lys Val Asp Leu Val Ser Ala Tyr Thr Leu Asn50 55 60TCA ATG TTT TGG GTT TAT TTG GCA ACC CAA GGA GTT AAT CCT AAG GAA357Ser Met Phe Trp Val Tyr Leu Ala Thr Gln Gly Val Asn Pro Lys Glu65 70 75 80CAT CCA GTA AAA CAG GAA TTG GAA AGA ATC AGA GTA TAT ATG AAC AGA405His Pro Val Lys Gln Glu Leu Glu Arg Ile Arg Val Tyr Met Asn Arg85 90 95GTC AAG GAA ATA ACA GAC AAG AAA AAG GCT GGC AAG CTG GAC AGA GGT453Val Lys Glu Ile Thr Asp Lys Lys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Arg Gly100 105 110GCA GCT TCA AGA TTT GTA AAA AAT GCC CTC TGG GAA CCA AAA TCG AAA501Ala Ala Ser Arg Phe Val Lys Asn Ala Leu Trp Glu Pro Lys Ser Lys115 120 125AAT GCA TCA AAA GTT GCC AAT AAA GGA AAA AGT AAA AGT TAACTTTTTG 550Asn Ala Ser Lys Val Ala Asn Lys Gly Lys Ser Lys Ser130 135 140GTTTTGATGT ACACATATTC AAAAAGTACA TTAATATGTA ATCACAGTAA TATGTAAAGC 610TAAATACTTC CTCTCCAAAG ATCATTATCT TTATTGATTA GCACTGAGGA TTTTAACATT 670GTGATATATT ATATATTTAT AATTTACCAT CTCTTGATGA GACTCTTATT TCTTTATATA 730GGTCAGTCTT GCAAGTACCA TTTTATAAGC AGCTGTGAAA TTTAAGTGAA ATGTTCTTTG 790TAAACATTTG TACTATTTTA AATGAATAAT GACCTTATGA AGTATGCTAT CTGTAGGCTG 850AAATTATAGG TACATCTGTT TTCACTATAT GATATTAAGA AAGCGTGAAT GACTTAAATG 910TTCATTTTTT TCTGTATAGA TACTTTATCA TGTTTTCATG ATTTTAGGAA TTACTGCTTT 970GTTGATATTC AAAGTGTGAA ACTAAAAGTT TATGGTTGTA CTTTAATTCT TGGCATGTTG 1030CCTCTATGTC CCATTTAAAA TAAAATACAT TCTCATTAAC TTTAGATGGG AAATAAGGTT 1090GTATGTTGAT GGATGAATTT TGGCATGATG ACTGTACTCT CAATAAAGGC TGAAAATGTT 1150GTAAAA 1156(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度141個氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Ala Gly Glu Glu Ile Asn Glu Asp Tyr Pro Val Glu Ile His Glu1 5 10 15Tyr Leu Ser Ala Phe Glu Asn Ser Ile Gly Ala Val Asp Glu Met Leu20 25 30Lys Thr Met Met Ser Val Ser Arg Asn Glu Leu Leu Gln Lys Leu Asp35 40 45Pro Leu Glu Gln Ala Lys Val Asp Leu Val Ser Ala Tyr Thr Leu Asn50 55 60Ser Met Phe Trp Val Tyr Leu Ala Thr Gln Gly Val Asn Pro Lys Glu65 70 75 80His Pro Val Lys Gln Glu Leu Glu Arg Ile Arg Val Tyr Met Asn Arg85 90 95Val Lys Glu Ile Thr Asp Lys Lys Lys Ala Gly Lys Leu Asp Arg Gly100 105 110Ala Ala Ser Arg Phe Val Lys Asn Ala Leu Trp Glu Pro Lys Ser Lys115 120 125Asn Ala Ser Lys Val Ala Asn Lys Gly Lys Ser Lys Ser130 135 140
(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1040個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義否(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置78..500(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵成熟肽(B)位置78..500(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:CAGAAGCCGT GTCATGGCGT CATCATCGTG CGACCTATTT CCCGGAGACA GGCGTCCACG 60GTATTGAGTT GGTCACA ATG GCA GGT GAA GAA ATG AAT GAA GAT TAT CCC 110Met Ala Gly Glu Glu Met Asn Glu Asp Tyr Pro1 5 10GTA GAA ATT CAC GAG TCT TTA ACA GCC CTG GAG AGC TCC CTG GGT GCT158Val Glu Ile His Glu Ser Leu Thr Ala Leu Glu Ser Ser Leu Gly Ala15 20 25GTG GAC GAC ATG CTG AAG ACC ATG ATG GCT GTT TCT AGA AAC GAG TTG206Val Asp Asp Met Leu Lys Thr Met Met Ala Val Ser Arg Asn Glu Leu30 35 40TTG CAG AAG TTG GAC CCA TTG GAA CAA GCA AAG GTG GAT TTA GTT TCT254Leu Gln Lys Leu Asp Pro Leu Glu Gln Ala Lys Val Asp Leu Val Ser45 50 55GCA TAC ACC TTA AAT TCA ATG TTT TGG GTT TAT TTG GCA ACT CAA GGA302Ala Tyr Thr Leu Asn Ser Met Phe Trp Val Tyr Leu Ala Thr Gln Gly60 65 70 75GTT AAT CCC AAA GAG CAT CCA GTG AAG CAG GAA CTG GAA AGA ATC AGA350Val Asn Pro Lys Glu His Pro Val Lys Gln Glu Leu Glu Arg Ile Arg80 85 90GTC TAC ATG AAC AGA GTT AAA GAA ATA ACA GAC AAG AAG AAG GCT GCC 398Val Tyr Met Asn Arg Val Lys Glu Ile Thr Asp Lys Lys Lys Ala Ala95 100 105AAG CTG GAC AGA GGT GCT GCT TCG AGA TTT GTC AAG AAG GCA CTC TGG 446Lys Leu Asp Arg Gly Ala Ala Ser Arg Phe Val Lys Lys Ala Leu Trp110 115 120GAA CCC AAA CGA AAA AGC ACA CCA AAA GTG GCT AAT AAA GGG AAA AGC 494Glu Pro Lys Arg Lys Ser Thr Pro Lys Val Ala Asn Lys Gly Lys Ser125 130 135AAA CAC TAATCTTTTG GTTTTGATGT ACATGTTTTC AAAAAGTACA TCCTTTTTAA 550Lys His140TCAGTTTACA ATGTAGTTAT GTGACCATGT GGTGTTTAAA TGGATTCCTT TTGGAATTCA 610TGTATAAATT TACACATTAC ATTTGTGATA CTGAATCTTT TTTTTGCTGA GAAAGATTAA 670GTTGTCTTTG TTGATTTTCA TATAAAGCAT CATGATGTGT TTAATATTGT AAGATATTCT 730ATAAGCAGTT GTGAAATCCA AATGTTCTCT GTAAACATTT GTAGTGTTTG AAATGAACAA 790TGATATTATG AAGTGTGCTA TCTGTAGACC TCGAGGTGTA AGGACATTTG TTTTCAGTAA 850TGATGAGAAA TACAGTGACT TAAATACCCA CTCTGTTTCT GTTCAGTTAG TTCAACATGT 910TTCGTGATTT TTTTTTTTTT TTGAGTAATT CTGTCTTGAT ATTCAAAGTC AAAATTGAAA 970CCTTAAGGCT GTACTTTAAT TCTTCATGTT CCATTTAAAA TAAAATGTTC TCATTAACTC 1030TGATGGAAAA 1040(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度141個氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Ala Gly Glu Glu Met Asn Glu Asp Tyr Pro Val Glu Ile His Glu1 5 10 15Ser Leu Thr Ala Leu Glu Ser Ser Leu Gly Ala Val Asp Asp Met Leu20 25 30Lys Thr Met Met Ala Val Ser Arg Asn Glu Leu Leu Gln Lys Leu Asp35 40 45Pro Leu Glu Gln Ala Lys Val Asp Leu Val Ser Ala Tyr Thr Leu Asn50 55 60Ser Met Phe Trp Val Tyr Leu Ala Thr Gln Gly Val Asn Pro Lys Glu65 70 75 80His Pro Val Lys Gln Glu Leu Glu Arg Ile Arg Val Tyr Met Asn Arg85 90 95Val Lys Glu Ile Thr Asp Lys Lys Lys Ala Ala Lys Leu Asp Arg Gly100 105 110Ala Ala Ser Arg Phe Val Lys Lys Ala Leu Trp Glu Pro Lys Arg Lys115 120 125Ser Thr Pro Lys Val Ala Asn Lys Gly Lys Ser Lys His130 135 140(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:
GGGGTACCAT GGCAGGTGAA GAAATTAATG AAGACTAT38(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性
(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:
GGGTCGACTT AACTTTTACT TTTTCCTTTA TTGGCAAC38(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
GGGGTACCAT GGCAGGTGAA GAAATGAATG AAGATTAT 38(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”
(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:
GGGTCGACGT GTTTGCTTTT CCCTTTATTA GCCACTTT38(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:
GGGTCGACAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTC 35(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型其他核酸(A)描述/desc=“引物”(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義否
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:
CCAAGCTTTG GAATTCTAGA GTCGCGGCCG CTTTA 3權(quán)利要求
1.通過C1D基因的過表達在細胞中誘導(dǎo)細胞編程性死亡的方法。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中C1D基因產(chǎn)物包含圖1或圖2的氨基酸序列和/或與其有一或幾個氨基酸不同的氨基酸序列，后一氨基酸序列的DNA序列與圖1或圖2的DNA可雜交。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述細胞用一種表達載體轉(zhuǎn)染，所述表達載體包含(a)圖1或圖2的DNA，或與其有一或幾個堿基對不同的DNA，后一DNA與圖1或圖2的DNA可雜交，或者(b)與(a)的DNA經(jīng)簡并遺傳密碼而相關(guān)的DNA。
5.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中細胞中內(nèi)源性包括的C1D基因被刺激。
6.權(quán)利要求5的方法，其中內(nèi)源性C1D基因的啟動子被細胞外因子刺激。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種激發(fā)細胞編程性死亡的方法,該方法中C1D基因在細胞特別是腫瘤細胞中被過表達,這例如通過將相應(yīng)的表達構(gòu)建體導(dǎo)入細胞或通過外源性刺激細胞本身的C1D基因的表達來發(fā)生。
文檔編號C12N15/09GK1320163SQ99808352
公開日2001年10月31日 申請日期1999年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月3日
發(fā)明者卡斯滕·羅特巴特, 赫爾曼·施塔默, 迪特爾·維爾納, 彼得·內(nèi)爾斯 申請人:德國公共權(quán)利基金會癌癥研究中心, 彼得·內(nèi)爾斯