本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻葉綠素含量相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻作為重要的糧食作物之一，解決了世界上大約一半人口的吃飯問(wèn)題。正常的光合作用是保證生產(chǎn)的前提，水稻葉綠素含量相關(guān)突變體是研究光合作用，探究光合利用率以提高產(chǎn)量的理想材料。葉綠體是半自主性細(xì)胞器，擁有自身的基因組，它不僅是光合作用的場(chǎng)所，也是各種代謝活動(dòng)和調(diào)控的中心，與細(xì)胞核以及其他細(xì)胞器存在復(fù)雜的信號(hào)交流。

ppr家族是植物中發(fā)現(xiàn)的最大家族之一，在水稻中有477個(gè)成員，是一種以35個(gè)簡(jiǎn)并氨基酸為重復(fù)單位連續(xù)排列組成的蛋白質(zhì)，這些重復(fù)出現(xiàn)的簡(jiǎn)并氨基酸簡(jiǎn)稱為ppr基序。這個(gè)家族大部分定位在線粒體或者葉綠體中，影響質(zhì)體rna的剪接，編輯，加工以及穩(wěn)定性等。盡管編碼ppr家族在植物中大量存在，但是目前發(fā)現(xiàn)的影響水稻葉綠體基因rna剪接的ppr蛋白卻很有限。在水稻中發(fā)現(xiàn)的定位于葉綠體的ppr蛋白有osppr1、(gothandametal.,2005)、ysa(suetal.,2012)、osv4(gongetal.,2014)、wsl(tanetal.,2014)、asl3(linetal.,2015a)和osptac2(wangetal.,2016)，其中只有wsl被報(bào)道參與到了葉綠體基因的rna剪接過(guò)程，wsl是一個(gè)psl亞家族的蛋白，影響葉綠體基因rpl2的剪接（tanetal.,2014）。我們的wsl4蛋白影響到葉綠體ii類內(nèi)含子基因atpf,ndha,rpl2和rps12的rna剪接過(guò)程，這是第一次報(bào)導(dǎo)核編碼的p亞家族的ppr蛋白在水稻葉綠體中參與多位點(diǎn)的rna剪接。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種水稻葉綠素含量相關(guān)蛋白o(hù)swsl4及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的水稻葉綠素含量相關(guān)蛋白，名稱為oswsl4，來(lái)源于稻屬水稻（oryzasativa）品種rx69的氨基酸序列，是如下a）或b）：

a）如seqidno.1所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；

b）將seqidno.1中的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物葉綠素含量相關(guān)由a）衍生的蛋白質(zhì)。

上述b）中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述b）中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。

上述序列表中的seqidno.1由554個(gè)氨基酸殘基組成。

編碼所述wsl4蛋白的dna分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述dna分子是如下（1）或（2）或（3）的dna分子。

1）如seqidno.2所示的dna分子；

2）在嚴(yán)格條件下與1）限定的dna序列雜交且與植物葉綠素含量相關(guān)的dna分子；

3）與1）或2）限定的dna序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且與植物葉綠素含量相關(guān)的dna分子。

所述嚴(yán)格條件可為在0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1%sds的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。

上述序列表中的seqidno.2由1665個(gè)核苷酸組成。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為抑制目的植物中wsl4蛋白編碼基因的表達(dá)，得到葉綠素含量缺陷的轉(zhuǎn)基因植物。

上述所述葉綠素含量缺陷的轉(zhuǎn)基因植物具體體現(xiàn)在形成白條紋表型的葉片，葉綠素含量異常。

上述所述植物具體為雙子葉或單子葉植物，所述單子葉植物進(jìn)一步具體為水稻。

上述抑制是通過(guò)在所述目的植物中轉(zhuǎn)入干擾載體實(shí)現(xiàn)的。含有所述編碼基因的重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述干擾載體是將特異dna片段1和特異dna片段2均插入雙元表達(dá)載體中，所述dna片段1如seqidno.2自5’末端第1162至1493位核苷酸所示；所述dna片段2和所述dna片段1反向互補(bǔ)。

上述表達(dá)載體具體為pcubi1390-△fad2載體。

擴(kuò)增所述基因全長(zhǎng)或者其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述蛋白在調(diào)節(jié)葉綠素含量方面的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明克隆得到wsl4基因，缺失wsl4基因的植株出現(xiàn)白條紋表型，葉綠素含量降低。轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證了此基因的功能，亞細(xì)胞定位也定位在了葉綠體中，證明wsl4蛋白在早期葉綠素含量過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，可以基于本申請(qǐng)的基因，創(chuàng)制不同性狀的植物品種材料，作為作物育種的素材，同時(shí)也為進(jìn)一步研究葉綠素合成過(guò)程的機(jī)理并加以利用提供了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為pcubi1390-△fad2載體圖譜。

圖2為oswsl4干擾植株的表型。

圖3為干擾植株基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)和葉綠素含量測(cè)量。

圖4為轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株表型和葉綠素含量測(cè)量，其中a，野生型（wt），wsl4突變體，互補(bǔ)植株（wsl4/wsl4）3葉期時(shí)的表型；b，野生型（wt），wsl4突變體，互補(bǔ)植株（wsl4/wsl4）的葉綠素含量測(cè)定，平均值來(lái)自三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。chla，葉綠素a；chlb，葉綠素b；fw，鮮重。

圖5為wsl4蛋白和突變后的蛋白wsl4的亞細(xì)胞定位，其中a，wsl4–gfp和wsl4–gfp在水稻原生質(zhì)體中的瞬時(shí)表達(dá)；b，wsl4和wsl4(gfp)與葉綠體擬核markerpend（cfp）共定位。gfp，wsl4和wsl4的gfp熒光信號(hào)，cfp，葉綠體擬核markerpend的cfp熒光信號(hào)，auto，葉綠素自體熒光，merged，gfp，cfp和auto的熒光合并圖像。bars，5μm。

圖6為wsl4蛋白參與葉綠體ii型內(nèi)含子基因的剪接，左側(cè)是基因名稱，右側(cè)是剪接的（s）和沒(méi)有剪接的（u）轉(zhuǎn)錄本；rna提取于l30/d25條件下的野生型和突變體（白色部分）的l3-3，l3-3代表3葉期的第三葉。。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了更好的闡明本發(fā)明，而不限定本發(fā)明。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、生化試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的水稻（oryzasativassp.japonica）rx69(也稱為野生型水稻，簡(jiǎn)稱wt)公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

農(nóng)桿菌為根癌農(nóng)桿菌eha105(agrobacteriumtumefacienseha105)記載于newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.hood,elizabethe;gelvin,stantonb;melchers,leos;hoekema,andre.transgenicresearch,2(4):p.208-218(1993)。公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

實(shí)施例1、oswsl4基因的獲得

根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)引物ppr-cds-f和ppr-cds-r

ppr-cds-f:atggccgcgcccgcgcccac

ppr-cds-r:tcaatcaagcagtctaatgg

用rnapreppure植物總提取試劑盒（天根生化科技有限公司），提取水稻rx69的10天左右的水稻幼苗總rna,反轉(zhuǎn)得到cdna。以此為模板，用引物ppr-cds-f和ppr-cds-r進(jìn)行擴(kuò)增，得到的pcr產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的基因命名為oswsl4，該基因的編碼區(qū)為seqidno.2所示的核苷酸；該基因編碼的蛋白命名為oswsl4，氨基酸序列為seqidno.1所示序列。

實(shí)施例2、oswsl4的rna干擾載體的構(gòu)建

1、oswsl4基因干擾片段的獲得

（1）以實(shí)例1中cdna為模板，用wsl4-rnai-saci-inf和wsl4-rnai-saci-inr引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到片段1。

wsl4-rnai-saci-inf：ctaggtaccaggcctgagctcgttgaattgcttcatcaa

wsl4-rnai-saci-inr：gacgtaggggcgatagagcttaagcgaaaagatcaatg

（2）以實(shí)例1中cdna為模板，用wsl4-rnai-bamhi-inf和wsl4-rnai-bamhi-inr引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到片段2。

wsl4-rnai-bamhi-inf：tcttagaattcccggggatccgttgaattgcttcatcaa

wsl4-rnai-bamhi-inr：cgttacgtagtcgacggatcctaagcgaaaagatcaat

2、oswsl4基因rna干擾載體（重組載體pcubi1390-△fad2-oswsl4）的構(gòu)建

(1)用限制性內(nèi)切酶saci酶切表達(dá)載體pcubi1390-△fad2，得到線性表達(dá)載體，回收該線性片段。將片段1采用同源重組定向克隆的方法重組到該線性表達(dá)載體上（具體方法參考clontechinfusionkit說(shuō)明書(shū)），得到重組載體pcubi1390-△fad2-sense-oswsl4。

（2）對(duì)重組載體pcubi1390-△fad2-sense-oswsl4進(jìn)行測(cè)序，得到正確地質(zhì)粒，再用限制性內(nèi)切酶bamhi酶切測(cè)序正確地重組載體pcubi1390-△fad2-sense-oswsl4，得到了線性載體，回收該線性載體。將片段2采用同源重組定向克隆的方法重組到該線性載體上（具體方法參考clontechinfusionkit說(shuō)明書(shū)），得到重組載體pcubi1390-△fad2-oswsl4。

（3）對(duì)重組載體pcubi1390-△fad2-oswsl4進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該重組載體pcubi1390-△fad2-oswsl4是在saci酶切位點(diǎn)正向插入了片段1，bamhi酶切位點(diǎn)插入了片段2，即構(gòu)建成功，命名為pcubi1390-△fad2-oswsl4。

實(shí)施例3、rna干擾植株的獲得與鑒定

一、rna干擾植株的獲得

1、將重組載體pcubi1390-△fad2-oswsl4用熱激法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌eha105中得到含有重組載體的根癌農(nóng)桿菌eha105，命名為eha105/pcubi1390-△fad2-oswsl4。

2、將含有重組載體eha105/pcubi1390-△fad2-oswsl4的農(nóng)桿菌侵染野生型水稻rx69的胚性愈傷組織。經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)，繼代，分化的一系列過(guò)程，待植株地上高度約為15cm時(shí)，開(kāi)瓶口歷練1天，然后清洗掉培養(yǎng)基，移栽至溫室栽培，即為t0代植株。t0代植株自交收獲種子并種植，得到穩(wěn)定的t1代植株。

二、rnai干擾轉(zhuǎn)基因植株的pcr鑒定

將上述獲得的t1代幼苗和受體親本水稻rx69植株的幼苗（簡(jiǎn)稱為wt）的基因組dna，并采用引物1390-f（5’-tgccttcatacgctatttatttgc-3’）和引物fad2-r（5’-tgccttcatacgctatttatttgc-3’）進(jìn)行pcr分子檢測(cè)鑒定陽(yáng)性苗，得到含有片段1pcr產(chǎn)物的植株為陽(yáng)性苗，取三株陽(yáng)性苗，分別命名為rnai-1，rnai-2，rnai-3植株。

三、rnai干擾轉(zhuǎn)基因植株的oswsl4基因表達(dá)水平的鑒定

分別提取rnai-1植株、rnai-2植株、rnai-3植株和受體親本水稻rx69植株（簡(jiǎn)稱為wt）葉片的rna，設(shè)定內(nèi)參為ubiquitin，利用內(nèi)參引物ubi-f和ubi-r，以及oswsl4基因特異性定量引物wsl4-rt-f和wsl4-rt-r進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)。結(jié)果表明（圖1），與野生型對(duì)照相比，rnai干擾轉(zhuǎn)基因植株中oswsl4基因表達(dá)水平顯著下降。上述引物如下：

ubi-f：5’-gctccgtggcggtatcat-3’

ubi-r：5’-cggcagttgacagccctag-3’

wsl4-rt-f：5’-gccctccaaatgtggtaact-3’

wsl4-rt-r:5’-gccatcgctttatccatctt-3’

四、rnai干擾轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定

分別將rnai-1植株、rnai-2植株、rnai-3植株和受體親本水稻rx69植株（簡(jiǎn)稱為wt）種植在培養(yǎng)箱中（30°c光照12h，25°c黑暗12h循環(huán)，濕度60%），待長(zhǎng)到三葉期，觀察葉色表型是否有差異。觀察結(jié)果如圖2，與受體親本水稻rx69植株相比，rnai-1植株，rnai-2植株和rnai-3植株均出現(xiàn)白條紋的表型，oswsl4基因表達(dá)水平和葉綠素含量明顯降低（圖3），從而證明了oswsl4影響葉綠素的含量，干擾其基因，葉片出現(xiàn)了白條紋的表型且葉片色素明顯降低。

實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)載體的構(gòu)建和鑒定

1、互補(bǔ)載體的構(gòu)建

根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)引物ppr-g-f和ppr-g-r

ppr-g-f:ccatgattacgaattcatggcgtatcctcctatcgttgc

ppr-g-r:taccgagctcgaattcgccgacttccgaccgaacat

提取水稻rx69的dna。以此為模板，用引物ppr-g-f和ppr-g-f使用primestar?hsdna聚合酶（takara）進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一個(gè)5.7kb大小的片段，包括2.2kb的上游啟動(dòng)子區(qū)序列，wsl4完整的編碼區(qū)以及下游2kb的終止區(qū)序列。產(chǎn)物跑膠回收后，in-fusion(clontech)同源重組連入pcambia1305載體中，獲得互補(bǔ)載體pcambia1305-gwsl4。

2、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)載體的鑒定

互補(bǔ)載體pcambia1305-gwsl4轉(zhuǎn)入wsl4突變體愈傷中，經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)，繼代，分化的一系列過(guò)程，待植株地上高度約為15cm時(shí)，開(kāi)瓶口歷練1天，然后清洗掉培養(yǎng)基，移栽至溫室栽培，即為t0代植株。t0代植株自交收獲種子并種植，得到穩(wěn)定的t1代植株。將上述獲得的t1代幼苗，突變體wsl4植株的幼苗的基因組dna（陰性對(duì)照），互補(bǔ)載體pcambia1305-gwsl4質(zhì)粒（陽(yáng)性對(duì)照）并采用引物gwsl4-f（5'taggcaccccaggctttacact3'）和引物gwsl4-r（5'gtaacgtaggacaaaacc3'）進(jìn)行pcr分子檢測(cè)鑒定陽(yáng)性苗，能夠擴(kuò)增出692bp片段的為陽(yáng)性苗，命名為wsl4/wsl4植株。共獲得了6個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系恢復(fù)了野生型的表型，同時(shí)葉綠素a和葉綠素b都恢復(fù)了野生型的水平，wsl4基因的表達(dá)也與野生型幾乎持平（圖4）。以上結(jié)果表明wsl4突變體白條紋的表型是由于oswsl4（loc_os02g35750）突變?cè)斐傻摹?/p>

實(shí)施例5、wsl4蛋白的亞細(xì)胞定位

為了了解wsl4蛋白的亞細(xì)胞定位情況，我們首先用chlorop(http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorop/)和targetp（http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/）對(duì)wsl4蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)wsl4蛋白的n端的存在著葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽（ctp），加上wsl4葉綠素缺陷的表型，我們猜測(cè)wsl4可能定位在葉綠體中。為了確定wsl4的真實(shí)定位和突變后的蛋白是否改變定位，我們分別以野生型和突變體cdna為模板，擴(kuò)增出編碼wsl4全長(zhǎng)序列和wsl4突變后的序列（除去終止子），連接到載體pan580上，分別命名為pan580-wsl4-gfp和pan580-wsl4-gfp并轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中，28℃黑暗培養(yǎng)16小時(shí)以后用激光共聚焦顯微鏡拍照，結(jié)果顯示，wsl4-gfp和wsl4-gfp都和葉綠素自發(fā)熒光（用于葉綠體marker）共定位（圖5a），進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)wsl4和wsl4與葉綠體擬核markerpend（cfp）共定位（圖5b），綜合上述結(jié)果說(shuō)明wsl4蛋白定位于葉綠體中并且與葉綠體擬核共定位，而且突變后的蛋白并沒(méi)有改變定位，也定位于葉綠體擬核內(nèi)。

實(shí)施例6、rna剪接分析

水稻葉綠體內(nèi)含子有兩種類型，分別為i型和ii型。i型僅包括基因trnl，ii型包括atpf、ndha、ndhb、petb、petd、rpl2、rpl16、rps12、rps16、trna、trng、trnk、trni、trnv和ycf3，其中rps12、ycf3有兩個(gè)內(nèi)含子(micheletal.,1989;delongevialle.,2010)。我們檢測(cè)了17個(gè)ii型內(nèi)含子的葉綠體基因（atpf、ndha、ndhb、petb、petd、rpl2、rpl16、rps12-1、rps16、trna、trng、trnk、trni、trnv、ycf3-1、ycf3-2）和一個(gè)i型內(nèi)含子的葉綠體基因trnl，用pcr的方法擴(kuò)增出野生型和突變體中所有剪接位點(diǎn)基因的cds，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本的情況并拍照，發(fā)現(xiàn)ii型內(nèi)含子的atpf、ndha、rpl2、rps12-1基因中野生型和突變體轉(zhuǎn)錄本存在差異（圖6）。所以oswsl4可能在atpf、ndha、rpl2、rps12-1等四個(gè)葉綠體ii類內(nèi)含子基因的剪接中起重要作用。

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

<120>一種水稻葉綠素含量相關(guān)蛋白o(hù)swsl4及其編碼基因與應(yīng)用

<130>1

<160>2

<210>1

<211>554

<212>氨基酸

<400>1

maapaptaspppppamsgllsfassrpypplpaprpaaaaprprlriagsaaaapnavshrasssfssgdrlrslvrrgeldealrlvgsarrpdagtcaalikklsasgrtaearrvlaacgpdvmaynamvagycgagqldaarrlvaempvepdaytyntlirglcgrgrtanalavldemlrrrcvpdvvtytilleatckrsgykqamklldemrdkgctpdivtynvvvngicqegrvddaieflknlpsygcepntvsynivlkglctaerwedaeelmgemgqkgcppnvvtfnmlisflcrkglvepalevleqipkygctpnslsynpllhafckqkkmdkamafldlmvsrgcypdivsyntlltalcrsgevdvavellhqlkdkgcapvlisyntvidgltkagktkealellnemvskglqpdiitystiaaglcredriedairafgkvqdmgirpntvlynaiilglckrrethsaidlfaymigngcmpnestytilieglayeglikeardlldelcsrgvvrkslinkgairlld

<210>2

<211>1665

<212>dna

<400>2

atggccgcgcccgcgcccacagcttcgccgccgccgccgcccgccatgtccggcctcctc60

tccttcgcctcgtcccgcccctaccctcccctccccgcgcccagacccgccgccgccgcc120

cccaggccgcgcctccgcatagcgggttccgccgccgcggcccccaacgccgtgtcccac180

cgggcatcctcctccttctcctccggagaccgcctccgctcgctcgtccgccgcggggag240

ctcgacgaggcgctccgcctcgtcgggtccgcgcggaggcccgacgcgggcacctgcgcc300

gcgctcatcaagaagctcagcgcgtcggggcgcaccgcggaggcccgccgcgtgctggcc360

gcgtgcggccccgacgtcatggcgtacaacgccatggtggccgggtactgcggcgcgggg420

cagctcgacgccgcgcggcggctcgtcgcggagatgcccgtggagcccgacgcctacacc480

tacaacacgctcatccgaggcctctgcggacgcggccggaccgcgaacgcgctggcggtg540

ctcgacgaaatgctccgccggcgatgtgtgccggacgtggtcacctacaccatcctcctc600

gaggccacgtgcaagaggagcgggtacaagcaggccatgaagcttctcgacgagatgcga660

gataaggggtgcaccccggacattgtcacctacaacgtcgttgtcaatggaatctgccaa720

gaaggacgggttgacgatgccattgagttcttgaagaacctcccgtcatatggctgtgaa780

ccaaacacagttagctataacattgtgttgaagggcctgtgtaccgcggagcgatgggag840

gatgccgaggagctcatgggcgagatgggccagaagggttgccctccaaatgtggtaact900

tttaacatgctcatcagtttcttatgccggaaaggattggttgagccagcactggaagtc960

cttgagcagatccccaagtacggttgcacacctaattcgttgagttacaacccgcttctc1020

cacgcattctgcaagcaaaaaaagatggataaagcgatggcgtttttggatttgatggtg1080

tccagaggctgttatccagacatcgtttcatacaacactctacttactgcactctgccgc1140

agtggtgaggttgacgtcgctgttgaattgcttcatcaactcaaggacaagggctgcgct1200

cctgtcttgataagttataacacggtcattgatgggcttacgaaggctgggaagacaaag1260

gaagcactagagctgctcaatgagatggtcagcaaagggctccaaccagatattatcaca1320

tactcgacaatagctgctggtctttgtagagaagatagaattgaagatgcaattagggca1380

tttggtaaagtgcaagatatgggcataaggcccaacactgtgttgtacaatgcgataatt1440

cttgggctttgcaaaaggcgtgaaacacacagtgccattgatcttttcgcttacatgata1500

gggaatggctgcatgccgaatgaatcaacttacaccatattgattgaaggcttggcttat1560

gagggattgatcaaggaggcacgggatttgctggatgaattatgttcgagaggtgttgta1620

aggaagagcttgataaataagggagccattagactgcttgattga1665