本發(fā)明涉及多肽類藥物的制備，具體其涉及一種液相合成縮宮素的方法，屬于多肽液相合成技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

縮宮素，也叫催產(chǎn)素，英文名oxytocin，分子式c43h66n12o12s2，分子量為1007.2，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

縮宮素主要分布在人和哺乳動(dòng)物的下丘腦垂體后葉，臨床上用于催產(chǎn)、產(chǎn)后出血和引產(chǎn)。隨著對(duì)其研究的逐漸深入，除了縮宮素常見(jiàn)的收縮子宮、泌乳等作用外，人們發(fā)現(xiàn)縮宮素還有許多復(fù)雜的生理功能，如參與學(xué)習(xí)、記憶過(guò)程、影響藥物成癮性及對(duì)社會(huì)適應(yīng)性行為、母性行為、性行為、攝食、痛覺(jué)調(diào)節(jié)以及心血管、體溫的調(diào)節(jié)等。

目前，國(guó)內(nèi)的縮宮素原料藥基本上自豬或牛下丘腦垂體后葉中提取，效價(jià)160iu/ml，而且，動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)品存在生物安全性風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，天然存在的相關(guān)雜質(zhì)，如加壓素等，難以被純化除去。

迄今為止，縮宮素的液相合成法涉及安全難以掌控的反應(yīng)條件(如氨鈉法)，反應(yīng)步驟多，產(chǎn)率低；另一方面，雖然固相合成法的引入簡(jiǎn)化了縮宮素的合成工藝，但是，從國(guó)內(nèi)外報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看，固相合成法合成縮宮素的產(chǎn)率、純度和效價(jià)仍不能滿足需求，其中boc固相合成法涉及氟化氫等危險(xiǎn)化合物在工業(yè)上逐漸不被采用，而fmoc固相合成法均采用哌啶作為脫帽試劑。哌啶是一種液體，不易運(yùn)輸和儲(chǔ)存，特別是作為受管制的易制毒化學(xué)品，對(duì)企業(yè)的采購(gòu)、使用和物料管理帶來(lái)不便。

縮宮素合成的最大的挑戰(zhàn)還包括，二硫鍵的形成，其產(chǎn)率和純度，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。

1953年，vincentduvigneaud首次用多肽液相合成法合成了縮宮素，并證實(shí)了其生物活性；隨后又將此方法進(jìn)行了改進(jìn)。這些兩種方法最終均采用金屬鈉/液氨脫去保護(hù)縮宮素的保護(hù)基和空氣氧化法形成二硫鍵。其他的脫半胱氨酸保護(hù)基和環(huán)化形成二硫鍵的方法，包括，1)photaki合成了保護(hù)的縮宮素直鏈序列后，用甲醇鈉/甲醇脫去巰基保護(hù)基bz或z，然后用1,2-二碘乙烷反應(yīng)形成二硫鍵，最后用hbr/acoh脫去其他保護(hù)基得到縮宮素粗品，其純化所得的縮宮素效價(jià)380iu/mg；mühlemann也采用了1,2-二碘乙烷作為氧化劑形成二硫鍵，環(huán)化收率30％；2)fujii等分別選用mbzl和acm為巰基保護(hù)基的半胱氨酸合成了保護(hù)的縮宮素直鏈序列，用三氟乙酸鉈鹽分別脫去mbzl和acm并形成二硫鍵，得到縮宮素粗品，產(chǎn)率分別為45％和39％；3)akaji等分別選用acm,tacm和but為巰基保護(hù)基的半胱氨酸合成了保護(hù)的縮宮素直鏈序列，用甲基三氯硅烷/二苯基亞砜分別脫去了acm,tacm,和but并形成二硫鍵，環(huán)化產(chǎn)率分別是56％，69％和64％。fernandoalbericio等用boc/mbharesin法和fmoc/palresin法進(jìn)行了縮宮素固相合成的比較研究，還對(duì)形成二硫鍵的方法進(jìn)行了研究，包括空氣氧化法、碘氧化法、三氟乙酸鉈鹽氧化法。二硫鍵形成的研究結(jié)果表明，三氟乙酸鉈鹽的效果最佳(產(chǎn)率72％)，碘氧化法的產(chǎn)率28％。

目前，國(guó)內(nèi)報(bào)道的縮宮素合成方法主要有液相法和fmoc固相法。其中，中國(guó)發(fā)明專利zl2010102549195公布了一種液相合成縮宮素的方法:該方法用金屬鈉/液氨法脫去保護(hù)基，然后，用空氣氧化法形成二硫鍵，收率25％，未見(jiàn)生物效價(jià)報(bào)道。中國(guó)發(fā)明專利zl2008100849408公布了一種液相法和固相法結(jié)合合成縮宮素的方法:該方法合成了半胱氨酸巰基用fmoc基團(tuán)保護(hù)的兩個(gè)片段，進(jìn)行片段縮合(縮合時(shí)間為10-40小時(shí))，然后，用哌啶將巰基保護(hù)基fmoc脫去后，采用空氣氧化法形成二硫鍵。該方法收率7-10％，產(chǎn)品的效價(jià)為600iu/ml，未見(jiàn)報(bào)道其純度。這里用體積計(jì)算效價(jià)的方法，無(wú)法判斷縮宮素的真實(shí)效價(jià)，因?yàn)槊亢辽s宮素的量未知。中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)zl2005101123565)公布了一種固相合成縮宮素的方法:該方法以rinkamide樹脂為固相載體，fmoc保護(hù)氨基酸為單體，其中半胱氨酸采用fmoc-cys(trt)-oh，使用哌啶作為脫帽試劑，依次逐個(gè)合成了保護(hù)縮宮素氨基酸序列，然后，將肽鏈從樹脂上切割下來(lái)，乙醚沉淀切肽溶液獲得還原性縮宮素后，在偏堿性溶液中(ph7-8)用空氣、或雙氧水進(jìn)行氧化，形成二硫鍵，收率21％，未見(jiàn)報(bào)道效價(jià)；中國(guó)發(fā)明專利(zl201210256922x)公布了一種固相合成縮宮素的方法:該方法以rinkamide樹脂為固相載體，fmoc保護(hù)氨基酸為單體，其中n末端半胱氨酸采用boc-cys(trt)-oh，使用哌啶作為脫帽試劑，依次逐個(gè)合成了保護(hù)縮宮素氨基酸序列，然后，將肽鏈從樹脂上切割下來(lái)，乙醚沉淀切肽溶液獲得未環(huán)化的縮宮素后，在偏堿性溶液中用空氣、或雙氧水進(jìn)行氧化，形成二硫鍵，其收率33％，未見(jiàn)報(bào)道效價(jià)。這些縮宮素固相合成法的共同點(diǎn)是：1)環(huán)化反應(yīng)均在溶液中進(jìn)行，均采用空氣氧化法、或雙氧水氧化法形成二硫鍵，收率最高為33％；2)n末端氨基在未保護(hù)(游離)狀態(tài)下進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)；3)脫帽試劑均采用哌啶；4)未見(jiàn)報(bào)道縮宮素的生物效價(jià)、或可參考的生物效價(jià)。

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外縮宮素的合成還存在一系列的挑戰(zhàn)，如使用易制毒化學(xué)品哌啶、乙醚等，劇毒且昂貴的試劑三氟乙酸鉈鹽等，難以掌控的反應(yīng)條件(如金屬鈉/液氨、hf等)，而且，合成所得縮宮素產(chǎn)品的收率和效價(jià)都較低。

在本發(fā)明中，結(jié)合使用了boc多肽合成法和fmoc多肽合成法，所有反應(yīng)均在溫和條件下進(jìn)行，未使用國(guó)內(nèi)外所有液相合成縮宮素的文獻(xiàn)報(bào)道的氨鈉法脫帽反應(yīng)；首次未使用劇毒試劑或不安全的反應(yīng)條件進(jìn)行縮宮素的液相合成，極大降低了縮宮素的合成成本，為工業(yè)化生產(chǎn)縮宮素提供了參考。本發(fā)明中所有的化學(xué)反應(yīng)均在溫和的條件下進(jìn)行，不涉及劇烈難以控制的反應(yīng)條件和劇毒的化學(xué)試劑，得到了高純度(99％以上)、高效價(jià)(588iu/mg，)的縮宮素產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)目前縮宮素合成技術(shù)存在的問(wèn)題，提供一種合成效率高、成本較低、環(huán)境友好、反應(yīng)條件溫和、純度和效價(jià)高，可以工業(yè)化生產(chǎn)的縮宮素液相合成工藝。最終所得的縮宮素純品，按照歐洲藥典(8.0版)，含量測(cè)定法測(cè)定本發(fā)明所生產(chǎn)的縮宮素含量為98.1％，效價(jià)588iu/mg。

本發(fā)明的方法步驟如下：

分別合成片段1、片段2和片段3，然后片段1和片段2組裝合成化合物4，化合物4皂化后得到化合物5，化合物5和片段3組裝得到保護(hù)縮宮素氨基酸序列(化合物6)，經(jīng)環(huán)化和脫帽反應(yīng)后，乙酸乙酯結(jié)晶得到縮宮素粗品，最后采用c18反相硅膠色譜純化，得到縮宮素產(chǎn)品。

按照本發(fā)明優(yōu)選的方案：

1.合成片段1：boc-cys(acm)-tyr(tbu)-oh

將boc-cys(acm)-oh(1eq.),hosu(1.1eq.),用四氫呋喃溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.)用少量thf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱h-tyr(tbu)-oh(1.1eq.)和nahco3(1.1eq.)用水溶解，加入以上溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成后，0.5m鹽酸調(diào)ph至中性，過(guò)濾掉不溶物，濃縮除去thf，0.5m鹽酸調(diào)ph至2得白色固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得片段1。

2.合成片段2：h-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome

(1)合成化合物2.1：fmoc-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-cys(acm)-oh(1eq.),hobt(1.1eq.),用thf和少量dmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.)用少量thf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱h-pro-ome.hcl(1.1eq.)用thf溶解，加入tea(1.1eq.)，混勻，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.1。

(2)合成化合物2.2：h-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.1用適量二乙胺溶解，濃縮至少量，加石油醚析出，過(guò)濾，石油醚洗滌，真空干燥得化合物2.2。

(3)合成化合物2.3：fmoc-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-asn(trt)-oh(1.1eq.),hobt(1.1eq.),用thf和少量dmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.)用少量thf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱化合物2.2(1eq.)用thf溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.3。

(4)合成化合物2.4：h-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.3用適量二乙胺溶解，濃縮至少量，加飽和nahco3析出，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥，然后用石油醚攪拌洗滌三次，過(guò)濾，真空干燥得化合物2.4。

(5)合成化合物2.5：fmoc-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-gln(trt)-oh(1.1eq.),hobt(1.1eq.),用thf和少量dmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.)用少量thf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱化合物2.4(1eq.)用thf溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.5。

(6)合成化合物2.6：h-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.5用適量二乙胺溶解，濃縮至少量，加飽和nahco3析出，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥，然后用石油醚攪拌洗滌三次，過(guò)濾，真空干燥得化合物2.6。

(7)合成化合物2.7：fmoc-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-ile-oh(1.1eq.),hobt(1.1eq.),用thf和少量dmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.)用少量thf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱化合物2.6(1eq.)用thf溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.7。

(8)合成片段2：h-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.7用適量二乙胺溶解，濃縮至少量，加飽和nahco3析出，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥，然后用石油醚攪拌洗滌三次，過(guò)濾，真空干燥得化合物2。

3.合成片段3：h-leu-gly-nh2

稱fmoc-leu-oh(1eq.),bop(1eq.)用dmf溶解，加dipea(1.2eq.)，5min后，稱h-gly-nh2.hcl(1.1eq.)用dmf溶解，加tea(1.1eq.)，倒入以上反應(yīng)液中，tlc(dcm:meoh:acoh＝100:6:1)跟蹤監(jiān)測(cè),反應(yīng)完全后，用0.1mhcl溶液析出，水洗至中性，真空干燥得產(chǎn)物fmoc-ile-gly-nh2.hcl。將干燥的fmoc-ile-gly-nh2.hcl加入適量二乙胺，tlc(dcm:meoh:acoh＝100:6:1)跟蹤監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完全后，濃縮，石油醚析出，過(guò)濾，石油醚洗滌，真空干燥得到片段3。

4.合成化合物4：

稱片段1(1.1eq.),hobt(1.1eq.)用thf和少量dmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.)用少量thf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱片段2(1eq.)用thf溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用飽和碳酸氫鈉溶液析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物4。

5.合成化合物5：

化合物4(1eq.)用thf溶解，-10℃冷浴10min，加入2mlioh(5eq.)溶液冰浴反應(yīng)，hplc檢測(cè)反應(yīng)完全后，0.5m鹽酸溶液調(diào)ph至中性，濃縮，析出白色固體，過(guò)濾，水洗，真空干燥得化合物5。

6.合成化合物6：

化合物5(1eq.)、bop(1eq.)用dmf溶解，加入dipea(1.1eq.)，5min后，稱片段3(1.1eq.)用dmf溶解，投入以上反應(yīng)液。hplc檢測(cè)反應(yīng)完全后，0.1m鹽酸溶液析出白色固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物5。

7.合成化合物7：

碘(10eq.)用dmf溶解，緩慢加入化合物6(1eq.)，hplc檢測(cè)反應(yīng)完全后，0.1％硫代硫酸鈉溶液析出白色固體，過(guò)濾，水洗，真空干燥得化合物7。

8.合成縮宮素粗品：

將化合物7溶于三氟乙酸，10min后，濃縮至少量，加dcm，濃縮至少量，重復(fù)三次，加乙酸乙酯冷藏，過(guò)夜，過(guò)濾，固體真空干燥。

9.縮宮素粗品純化：

粗肽的預(yù)處理：稱取0.5g粗肽用10ml0.1mnah2po4溶液溶解，加入乙腈使得乙腈的濃度為15％，然后用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

純化條件與梯度：

制備柱：dachb-50，富士硅膠-10μm-c18

檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm，流速：50ml/min

流動(dòng)相：a0.1mnah2po4溶液，b50％乙腈/a，0-60min：30％b-50％b

收集純度99％以上的收集液，25℃濃縮，ps聚合物脫鹽，濃縮，凍干，得縮宮素純品，hplc圖譜見(jiàn)附圖；以歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按歐洲藥典縮宮素含量測(cè)定法，本發(fā)明所得到的縮宮素含量為98.1％，效價(jià)588iu/mg。

本發(fā)明的有益效果：

在本發(fā)明中，結(jié)合使用了boc多肽合成法和fmoc多肽合成法，所有反應(yīng)均在溫和條件下進(jìn)行，未使用國(guó)內(nèi)外所有液相合成縮宮素的文獻(xiàn)報(bào)道的氨鈉法脫帽反應(yīng)；首次未使用劇毒試劑或不安全的反應(yīng)條件進(jìn)行縮宮素的液相合成，極大降低了縮宮素的合成成本，為工業(yè)化生產(chǎn)縮宮素提供了參考。本發(fā)明中所有的化學(xué)反應(yīng)均在溫和的條件下進(jìn)行，不涉及劇烈難以控制的反應(yīng)條件和劇毒的化學(xué)試劑，得到了高純度(99％以上)、高效價(jià)(588iu/mg)的縮宮素產(chǎn)品。

附圖說(shuō)明：

圖1是片段1：boc-cys(acm)-tyr(tbu)-oh的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,30-50％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖2是片段1高酸裂解樣品h-cys(acm)-tyr-oh的esi-ms圖；

圖3是fmoc-cys(acm)-pro-ome的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,30-90％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖4是h-cys(acm)-pro-ome的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,0-10％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖5是fmoc-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,50-90％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖6是h-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,30-90％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖7是h-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,50-90％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖8是h-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome(片段2)的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,50-90％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖9是h-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome(片段2)的esi-ms圖；

圖10是fmoc-leu-gly-nh2的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,60-65％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖11是h-leu-gly-nh2(片段3)的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,0-30％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖12是h-leu-gly-nh2(片段3)的esi-ms圖；

圖13是化合物4的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,75-80％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖14是化合物5的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,80-90％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖15是化合物6的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,80-85％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖16是化合物7的rp-hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,80-85％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖17是縮宮素粗品的rp-hplc圖，分析條件：a:0.1mnah2po4/h2o,b:50％can/h2o,30-60％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)220nm；

圖18是縮宮素純品的rp-hplc圖，分析條件：a:0.1mnah2po4/h2o,b:50％can/h2o,30-60％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)220nm；

圖19是縮宮素純品的esi-ms圖；

圖20是片段3按方案1合成的產(chǎn)物boc-leu-gly-nh2的hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,10-50％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；

圖21是片段3按方案1合成的產(chǎn)物h-leu-gly-nh2的hplc圖，分析條件：a:3％acn/h2o,0.1％tfa,b:acn,0-30％b,0-30min,色譜柱：c18,250x4.6mm,流速1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明權(quán)利要求書和說(shuō)明書中出現(xiàn)物質(zhì)的英文縮寫對(duì)應(yīng)的中文名稱見(jiàn)表1

表1本發(fā)明中出現(xiàn)物質(zhì)的英文縮寫對(duì)應(yīng)的中文名稱

實(shí)施例1：

合成片段1：boc-cys(acm)-tyr(tbu)-oh

將boc-cys(acm)-oh(100mol,29.2g,1eq.),hosu(110mmol,12.6g,1.1eq.)，用四氫呋喃200ml溶解，-10℃冷浴10min，dcc(110mmol,22.7g,1.1eq.)用20mlthf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱h-tyr(tbu)-oh(110mmol,26.1g,1.1eq.)和nahco3(110mmol,9.2g,1.1eq.)用150ml水溶解，加入以上溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成后，0.5m鹽酸調(diào)ph至中性，過(guò)濾掉不溶物，濃縮除去thf，0.5m鹽酸調(diào)ph至2得白色固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得片段1，純度99.1％，產(chǎn)物47.1g，收率92％。片段1：boc-cys(acm)-tyr(tbu)-ohrp-hplc圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖1，其高酸裂解樣品(h-cys(acm)-tyr-ohm/zcalculated.355.4；found356.3[m+h]⁺)的esi-ms質(zhì)譜圖見(jiàn)附圖2。

實(shí)施例2：

合成片段2：h-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome

(1)合成化合物2.1：fmoc-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-cys(acm)-oh(100mmol,41.5g,1eq.),hobt(105mmol,14.1g,1.05eq.)，用200mlthf和30mldmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(105mmol,21.6g,1.05eq.)用20mlthf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱h-pro-ome.hcl(105mmol,17.4g,1.05eq.)用100mlthf溶解，加入tea(105mmol,14.5ml,1.05eq.)，混勻，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.1，純度95.3％，產(chǎn)物50.9g，收率97％(產(chǎn)率均按100mmol計(jì)算，下同)。hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖3。

(2)合成化合物2.2：h-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.1用200ml二乙胺溶解，濃縮至少量，加石油醚析出，過(guò)濾，石油醚洗滌，真空干燥得化合物2.2。純度98.0％，產(chǎn)物28.8g，產(chǎn)率95％。hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖4。

(3)合成化合物2.3：fmoc-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-asn(trt)-oh(1.1eq.,104.4mmol,62.3g),hobt(1.1eq.,104.4mmol,14.1g),用dcm200ml和dmf20ml溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.,104.4mmol,21.5g)用20mldcm溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱化合物2.2(1eq.94.9mmol,28.8g)用50mldmf溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.3。純度99％，產(chǎn)物75g，產(chǎn)率85％。hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖5。

(4)合成化合物2.4：h-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.3用200ml二乙胺溶解，濃縮至少量，加飽和nahco3析出，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥，然后用石油醚攪拌洗滌三次，過(guò)濾，真空干燥得化合物2.4。純度96.3％，產(chǎn)物55.7g，產(chǎn)率84.4％。hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖6。

(5)合成化合物2.5：fmoc-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-gln(trt)-oh(1.1eq.,92.8mmol,56.7g),hobt(1.1eq.,92.8mmol,12.5g),用150mlthf和50mldmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.,92.8mmol,19.1g)用20mlthf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱化合物2.4(1eq.,84.4mmol,55.7g)用150mlthf溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.5,產(chǎn)物106.4g，產(chǎn)率85％。

(6)合成化合物2.6：h-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.5用150ml二乙胺溶解，濃縮至少量，加飽和nahco3析出，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥，然后用石油醚攪拌洗滌三次，過(guò)濾，真空干燥得化合物2.6,純度98.3％，產(chǎn)物86.5g，產(chǎn)率84％。hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖7。

(7)合成化合物2.7：fmoc-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將fmoc-ile-oh(1.1eq.,92.4mmol,32.6g),hobt(1.1eq.,92.4mmol,12.5g),用150mlthf和50mldmf溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.,92.4mmol,19g)用少20mlthf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱化合物2.6(1eq.,84mmol,86.5g)用150mlthf溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用0.1m鹽酸析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物2.7。純度90.3％，產(chǎn)物114.4g，產(chǎn)率83.8％。

(8)合成片段2：h-ile-gln(trt)-asn(trt)-cys(acm)-pro-ome：

將干燥好的化合物2.7用150ml二乙胺溶解，濃縮至少量，加飽和nahco3析出，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥，然后用石油醚攪拌洗滌三次，過(guò)濾，真空干燥得化合物2。純度94.2％，產(chǎn)物91.5g，產(chǎn)率80.1％。hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖8。其高酸裂解樣品(h-ile-gln-asn-cys(acm)-pro-omem/zcalculated.658.3；found681.1.3[m+na]⁺)的esi-ms質(zhì)譜圖見(jiàn)附圖9。

實(shí)施例3：

按方案2合成片段3：h-leu-gly-nh2

稱fmoc-leu-oh(1eq.,100mmol,35.3g),bop(1.01eq.,101mmol,44.7g)用dmf200ml溶解，加dipea(1.2eq.,120mmol,21ml)，5min后，稱h-gly-nh2.hcl(1.1eq.,110mmol,12.2g)用dmf100ml溶解，加tea(1.1eq.,110mmol,15ml)，倒入以上反應(yīng)液中，tlc(dcm:meoh:acoh＝100:6:1)跟蹤監(jiān)測(cè),反應(yīng)完全后，用0.1mhcl溶液析出，水洗至中性，真空干燥得產(chǎn)物fmoc-leu-gly-nh2.hcl,純度97％，產(chǎn)物43.7g，產(chǎn)率98％,hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖10。

將干燥的fmoc-leu-gly-nh2.hcl加入400ml二乙胺，tlc(dcm:meoh:acoh＝100:6:1)跟蹤監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完全后，濃縮，石油醚析出，過(guò)濾，石油醚洗滌，真空干燥得到片段3,純度98.4％，產(chǎn)物17.9g，產(chǎn)率95.6％,hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖11，(h-leu-gly-nh2m/zcalculated.187.1；found210.0[m+na]⁺)esi-ms質(zhì)譜圖見(jiàn)附圖12。

實(shí)施例4：

合成化合物4：

稱片段1(1.1eq.,88mmol,45g),hobt(1.1eq.,88mmol,11.9mg)用thf150ml和dmf60ml溶解，-10℃冷浴10min，dcc(1.1eq.,88mmol,18.1mg)用20mlthf溶解，加入以上溶液中，反應(yīng)20min后，稱片段2(1eq.,80mmol,91.5g)用thf100ml溶解，加入以上反應(yīng)溶液中。15-25℃反應(yīng)，hplc監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，過(guò)濾除去不溶物，濃縮，用飽和碳酸氫鈉溶液析出固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物4。純度86％，產(chǎn)物115.5g，產(chǎn)率70.6％,rp-hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖13。

實(shí)施例5：

合成化合物5：

化合物4(1eq.,115.5g)用thf800ml溶解，-10℃冷浴10min，加入1.5mnaoh(5eq.,353mmol)溶液235ml冰浴反應(yīng)，hplc檢測(cè)反應(yīng)完全后，0.5m鹽酸溶液調(diào)ph至中性，濃縮，析出白色固體，過(guò)濾，水洗，真空干燥得化合物5。純度93％，產(chǎn)物106.2g，產(chǎn)率65.5％,rp-hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖14。

實(shí)施例6：

合成化合物6：

化合物5(1eq.,65.5mmol,106.2g)、bop(1.05eq.,68.8mmol,30.4g)用dmf150ml溶解，加入dipea(1.1eq.,72mmol,12.5ml)，5min后，稱片段3(1.1eq.,72mmol,13.4g)用dmf100ml溶解，投入以上反應(yīng)液。hplc檢測(cè)反應(yīng)完全后，0.1m鹽酸溶液析出白色固體，過(guò)濾，水洗至中性，真空干燥得化合物5。純度88.6％，產(chǎn)物107.5g，產(chǎn)率60％,rp-hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖15。

實(shí)施例7：

合成化合物7：

碘(10eq.,600mmol,152g)用dmf1200ml溶解，緩慢加入化合物6(1eq.,60mmol,107.5g)，hplc檢測(cè)反應(yīng)完全后，0.1％硫代硫酸鈉溶液析出白色固體，過(guò)濾，水洗，真空干燥得化合物7。純度95％，產(chǎn)物96.5g，產(chǎn)率58.6％,rp-hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖16。

實(shí)施例8：

合成縮宮素粗品：

將化合物7溶于三氟乙酸裂解液(tfa:tis:h2o＝95:5:5)200ml，5min后，濃縮至少量，加dcm，濃縮至少量，重復(fù)三次，加乙酸乙酯冷藏，10h后，過(guò)濾，固體真空干燥。得到縮宮素粗品，純度94.5％，產(chǎn)物稱重26.6g，產(chǎn)率26.4％，rp-hplc分析圖譜見(jiàn)說(shuō)明書附圖17。

實(shí)施例9：

縮宮素粗品純化：

粗肽的預(yù)處理：稱取0.5g粗肽用10ml0.1mnah2po4溶液溶解，加入乙腈使得乙腈的濃度為15％，然后用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

純化條件與梯度：

制備柱：dachb-50，富士硅膠-10μm-c18

檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm，流速：50ml/min

流動(dòng)相：a0.1mnah2po4溶液，b50％乙腈/a，0-60min：30％b-50％b

收集純度99％以上的收集液，25℃濃縮，ps聚合物脫鹽，加乙酸，濃縮，凍干，得縮宮素10.6g，hplc圖譜見(jiàn)附圖18，esi-ms圖見(jiàn)附圖19(oxytocinm/zcalculated.1006.4；found1007.5[m+h]⁺)；以歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按歐洲藥典縮宮素含量測(cè)定法，除去水分和醋酸，含量為98.2％，效價(jià)為588iu/mg。

實(shí)施例10

用方案1合成片段3：

稱boc-leu-oh(1eq.,100mmol,23.1g)和bop(1.01eq.,101mmol,44.7g)，并用用dcm200ml和dmf20ml溶解，加dipea(1.2eq.,120mmol,21ml)，5min后，稱h-gly-nh2.hcl(1.1eq.,110mmol,12.2g)用dmf100ml溶解，加tea(1.1eq.,110mmol,15ml)，倒入以上反應(yīng)液中，tlc(dcm:meoh:acoh＝100:20:1)跟蹤監(jiān)測(cè),反應(yīng)完全后，用0.5mhcl溶液析出白色稠狀物質(zhì)，ea溶解，萃取，水洗滌3遍，飽和氯化鈉洗滌1遍，無(wú)水mgso4干燥30min，過(guò)濾，濃縮至干，純度99.1％，hplc分析圖譜見(jiàn)附圖20。

將上述產(chǎn)物加200ml30％tfa/dcm(三氟乙酸/二氯甲烷)溶液，反應(yīng)30min，濃縮至干，真空干燥得產(chǎn)物h-leu-gly-nh2。純度96％，產(chǎn)物25.6g，產(chǎn)率85％。hplc分析圖譜見(jiàn)附圖21。