本發(fā)明涉及一種從重樓、延齡草或其它植株中提取、制備高純度重樓皂苷vi的方法，所得樣品可用于缺血性心腦血管疾病的治療及預(yù)防。

背景技術(shù)：

重樓為百合科重樓屬多年生草本植物，全世界共有27種，我國有25種，其中有19種分布于我國西南地區(qū)，多以根莖入藥，是我國常用的傳統(tǒng)中藥，被歷年版中國藥典收載，《中華人民共和國藥典》2015年版收載重樓品種為七葉一枝花parispolyphyllasmithvar.chinensis(franch.)hara和云南重樓parispolyphyllasmithvar.yunnanensis(franch.)hand.的干燥根莖。重樓性微寒，味苦，歸肝經(jīng)，有小毒。功效：消腫止痛，清熱解毒，息風(fēng)定驚，用于跌打損傷，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，驚風(fēng)抽搐等癥。

重樓藥材中主要含有甾體皂苷類化合物，目前已報道了近90個，根據(jù)結(jié)構(gòu)類型主要分為偏諾甾體皂苷(pennogeninsaponins)和薯蕷甾體皂苷(diosgeninsaponins)，以及c-22內(nèi)酯甾體皂苷、孕甾烷皂苷(pregnanesaponins)和呋甾烷型甾體皂苷(furostanolsaponins)等，大多數(shù)甾體皂苷具有較強(qiáng)的藥理和生理活性，具有抗腫瘤、止血、抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、保護(hù)肝臟與腎臟等功效，臨床方面重樓皂苷廣泛應(yīng)用于治療腫瘤、泌尿系統(tǒng)感染和婦科血癥等各類疾病的治療。近年來，許多學(xué)者對重樓皂苷的藥理活性和臨床應(yīng)用進(jìn)行深入而廣泛的研究，為重樓皂苷的綜合開發(fā)和利用開辟更廣闊的前景，但由于重樓資源限制，影響了重樓皂苷的綜合開發(fā)和利用。

重樓皂苷vi是重樓皂苷的主要有效成分之一，也是重樓藥材和含重樓藥材制劑質(zhì)量主要控制的有效成分之一，具有較好的止血和抗腫瘤活性，對婦科血癥有較好的療效，能有效地預(yù)防小鼠結(jié)腸炎癌變。研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷vi不僅存在于重樓屬藥材中，而且還存在于延齡草屬等相關(guān)科屬植物中，為重樓皂苷vi的分離、制備和深入研究、開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

延齡草，別名頭頂一顆珠、芋兒七、獅兒七，為百合科延齡草屬植物延齡草(trilliumtschonoskiimaxim.)，含有重樓皂苷vi、延齡草苷等甾體皂苷類、黃酮苷類和苯丙素苷類等化合物。主要分布在我國湖北、西藏、云南、四川、陜西、甘肅、安徽、浙江(西北部目山)及福建武夷山等地，目前人工栽培已基本成功。

重樓皂苷vi分離、制備，目前主要用于藥材化學(xué)成分分離和鑒定。孫迪等人(七葉一枝花的化學(xué)成分研究[j].食品與藥品，2016，18(2)：98-101.)、李慧敏等人(延齡草化學(xué)成分的分離與鑒定[j].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2013，30(7)：509-516.)、文彥詩等人(滇重樓須根中的化學(xué)成分[j].西部林業(yè)科學(xué)，2015，44(6)：51-55.)、劉楊等人(金線重樓的皂苷成分研究[j].中南藥學(xué)，2015，15(1)：41-43.)，主要采用甲醇、乙醇等溶劑提取、正丁醇萃取，然后將萃取液進(jìn)行硅膠柱層析、反相材料柱層析或通過半制備方法，以氯仿、甲醇或乙腈等溶劑為洗脫劑，最后通過多次甲醇結(jié)晶得到，所得最終產(chǎn)品易存在甲醇等有機(jī)溶劑殘留。另外，由于氯仿、甲醇和乙腈溶劑毒性都比較大，易揮發(fā)，長時間使用對人體傷害也比較大，且對環(huán)境污染也比較嚴(yán)重，限制了其在工業(yè)上的大量使用，目前只是用于少量重樓皂苷vi樣品制備，不適宜規(guī)?；a(chǎn)、制備重樓皂苷vi。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從富含重樓皂苷vi(重樓皂苷vi含量大于0.1％)的重樓或其它植物中提取制備重樓皂苷vi的方法及應(yīng)用。采用本發(fā)明制備重樓皂苷vi，主要使用溶劑為乙醇、乙酸乙酯和水，工藝簡便可行，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，毒性小，且所用溶劑易回收、可反復(fù)使用，對環(huán)境污染較小，所得最終產(chǎn)物經(jīng)水洗后基本不含有機(jī)溶劑殘留。初步藥效學(xué)研究表明，該成分對心腦血管疾病有較好的治療作用，為下一步藥物、功能食品的研發(fā)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明涉及一種從富含重樓皂苷vi的重樓、延齡草或其它植株中提取制備高純度重樓皂苷vi的方法及應(yīng)用：

1、一種高純度重樓皂苷ⅵ的制備方法，其特征在于以下步驟：

1)重樓或延齡草干燥植株粗粉碎，用40％-95％乙醇溶液回流提取，料液比為1:10-1:50，提取次數(shù)1-4次，提取溫度50-90℃，每次提取時間60-180min，提取液經(jīng)過濾，合并真空濃縮成含醇量30％-50％溶液，過濾得上清液，備用，殘?jiān)鼦壢ィ饕バO性成分和油脂類化合物；

2)步驟1)得到的上清液上大孔吸附樹脂柱，先用2-4倍柱體積30％-50％乙醇洗，主要除去極性較大的甾體皂苷等成分，再用3-5倍柱體積70％-90％乙醇洗脫，將70％-90％乙醇洗脫液合并，濃縮，即得富含重樓皂苷ⅵ的粗提取物；

3)步驟2)得到的樣品，100目硅膠拌樣后，上100-200目硅膠柱，進(jìn)行硅膠柱層析，用3-5倍柱體積乙酸乙酯-乙醇(25:1-5:1，w/w)洗脫溶劑洗脫，薄層層析檢測，將含有重樓皂苷vi成分的洗脫液合并，回收溶劑至近干；

4)步驟3)得到的樣品用40％-60％乙醇溶解后上反相柱，先用2-4倍柱體積60％-70％乙醇洗脫，除去與重樓皂苷vi分子量相似和極性相近的成分，再用3-5倍柱體積75％-85％乙醇洗脫，取75％-85％洗脫液回收乙醇至基本無醇味后，放置，讓其慢慢析出沉淀，沉淀部分即為重樓皂苷vi粗品；

5)步驟4)析出的沉淀過濾，用純凈水洗滌2-3次，所得沉淀部分水浴濃縮至近干，105℃干燥1-2小時，即得所需重樓皂苷ⅵ；

6)步驟5)所得高純度重樓皂苷vi樣品采用hplc檢測純度大于98％，水分小于2％。

安全性評價

將本發(fā)明所得重樓皂苷ⅵ樣品進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)研究，結(jié)果表明小鼠半數(shù)致死量小于2.19g/kg，為臨床推薦使用劑量(2mg/kg)的1095倍，死亡及存活動物剖檢，未見臟器異常變化。本發(fā)明得到的重樓皂苷ⅵ樣品安全性有保障。

本發(fā)明所得重樓皂苷ⅵ進(jìn)行藥效學(xué)研究

1)小鼠常壓缺氧耐受性研究

采用小鼠常壓缺氧耐受性實(shí)驗(yàn)對藥物耐缺氧作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明重樓皂苷ⅵ40mg/kg.bw、60mg/kg.bw劑量連續(xù)給藥20d，可明顯延長常壓缺氧條件下小鼠的存活時間，延長率分別為72.85％、77.49％。與空白對照組比較，具有顯著性差異，提示重樓皂苷ⅵ具有增加心肌供氧量和提高心肌耐缺氧能力的作用。

2)對頸總動脈結(jié)扎所致小鼠大腦缺血的影響

采用頸總動脈結(jié)扎所致小鼠大腦缺血實(shí)驗(yàn)對藥物抗腦缺血作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明重樓皂苷ⅵ40mg/kg.bw連續(xù)給藥30d，可明顯延長結(jié)扎頸總動脈后小鼠的存活時間，延長率為184.76％，與空白對照組比較，具有顯著性差異，提示重樓皂苷ⅵ對急性腦缺血有一定保護(hù)作用。

3)對缺血再灌注所致大鼠心肌損傷的影響

在sd大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎40分鐘、再灌注2小時的心肌缺血試驗(yàn)中，十二指腸給予重樓皂苷ⅵ20、40、60mg/kg，能明顯減輕心肌梗死的程度，縮小梗死面積，減輕梗死區(qū)重量，使梗死區(qū)占心室及心臟百分比降低；低劑量還能使sod值增加，但三劑量均對mda、ck、ldh的水平無明顯影響。結(jié)果提示重樓皂苷ⅵ對心肌缺血再灌注損傷有明確保護(hù)作用。

4)對大鼠離體心臟心肌缺血所致心肌梗死的影響

在langendorff離體灌流心臟上結(jié)扎大鼠冠狀動脈，觀察重樓皂苷ⅵ對離體心臟血流動力學(xué)(左室壓峰值lvsp、左室壓最大變化速率dp/dtmax、冠脈流量caf)的影響，并以硝基四氮唑藍(lán)(n-bt)染色法，觀察其對心肌梗死范圍的影響。結(jié)果表明，重樓皂苷ⅵ能夠明顯減輕心肌梗死程度，并能降低dp/dtmax值，增加冠脈流量，從而減弱心梗心臟的心收縮力，改善心臟供血供氧。結(jié)果提示重樓皂苷ⅵ對急性缺血的心臟有直接保護(hù)作用。

5)對中腦動脈阻斷大鼠模型的影響

sd大鼠以20、40、60mg/kg/d的劑量連續(xù)5天灌胃給予重樓皂苷ⅵ，能劑量依賴地改善fecl3引起的mcao大鼠的神經(jīng)功能障礙，縮小腦梗死范圍，減輕腦水腫。結(jié)果提示重樓皂苷ⅵ對急性腦缺血有一定保護(hù)作用。40mg/kg的重樓皂苷ⅵ作用強(qiáng)度較等劑量的三七總皂苷、益脈康片稍強(qiáng)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

上述藥效學(xué)結(jié)果表明，重樓皂苷ⅵ對缺血性心腦血管有較好的的保護(hù)作用，可用于缺血性心腦血管疾病治療藥物、功能食品等產(chǎn)品的開發(fā)。

穩(wěn)定性研究：按《中華人民共和國藥典》2015版四部9001穩(wěn)定性研究有關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則要求進(jìn)行加速條件下穩(wěn)定性研究。

將本發(fā)明所得重樓皂苷ⅵ采用鋁塑復(fù)合膜包裝、在加速條件(溫度40℃、相對濕度75％)下進(jìn)行為期6個月的穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果如下：

試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所得重樓皂苷ⅵ樣品在加速條件(溫度40℃、相對濕度75％)下放置6個月(相當(dāng)于常溫條件下保存3年)，重樓皂苷ⅵ含量降低為1.40％(按要求考察期內(nèi)含量降幅應(yīng)小于10％)，本發(fā)明所得重樓皂苷ⅵ原料含量穩(wěn)定。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1)重樓全株干燥后粗粉碎，用40％乙醇溶液提取，料液比為1:40，提取次數(shù)2次，提取溫度90℃，每次提取時間60min，提取液經(jīng)過濾，上清液真空濃縮至含醇量為30％；

2)步驟1)得到的濃縮液，離心得沉淀和上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?/p>

3)步驟2)得到的上清液上大孔吸附樹脂柱d101，分別用4倍柱體積30％乙醇、3倍柱體積70％乙醇洗脫，將70％乙醇洗脫液合并，濃縮至比重大于1.25，即得富含重樓皂苷ⅵ的提取物；

4)步驟3)得到的樣品，100目硅膠拌樣后，上100目硅膠柱，依次用5倍柱體積乙酸乙酯-乙醇(25:1,w/w)洗脫，薄層層析檢測，將含有重樓皂苷vi成分的洗脫液合并，回收溶劑至近干；

5)步驟4)得到的樣品用40％乙醇溶解后上c-18柱，依次用3倍柱體積60％和3倍柱體積80％乙醇洗脫，取80％洗脫液回收乙醇后，放置，讓其慢慢析出沉淀，沉淀部分即為重樓皂苷vi粗品；

6)步驟5)析出的沉淀過濾，用純凈水洗滌2-3次，所得沉淀部分水浴濃縮至近干，105℃干燥1小時，即得所需重樓皂苷ⅵ,重樓皂苷ⅵ經(jīng)hplc檢測，含量為98.3％，水分1.52％。

實(shí)施例2：

1)重樓全株干燥后粗粉碎，用50％乙醇溶液提取，料液比為1:20，提取次數(shù)3次，提取溫度80℃，每次提取時間120min，提取液經(jīng)過濾，上清液調(diào)至含醇量為50％備用；

2)步驟1)得到的提取液，離心得沉淀和上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?/p>

3)步驟2)得到的上清液上大孔吸附樹脂柱hpd-100，分別用4倍柱體積50％乙醇，4倍柱體積70％乙醇洗脫，將70％乙醇洗脫液合并，濃縮至比重大于1.25，即得富含重樓皂苷vi的提取物；

4)步驟3)得到的樣品，100目硅膠拌樣后，上100目硅膠柱，依次用4倍柱體積乙酸乙酯-乙醇(20:1，w/w)洗脫，薄層層析檢測，將含有重樓皂苷vi成分的洗脫液合并，回收溶劑至近干；

5)步驟4)得到的樣品用50％乙醇溶解后上c-18柱，依次用4倍柱體積60％乙醇、5倍柱體積75％乙醇洗脫，取75％洗脫液回收乙醇后，放置，讓其慢慢析出沉淀，沉淀部分即為重樓皂苷vi粗品；

6)將上述析出的沉淀過濾，用純凈水洗滌2-3次，所得沉淀部分水浴濃縮至近干，105℃干燥1.5小時，即得所需重樓皂苷ⅵ,重樓皂苷ⅵ經(jīng)hplc檢測，含量為99.3％，水分0.98％。

實(shí)施例3：

1)重樓全株干燥后粗粉碎，用80％乙醇溶液提取，料液比為1:40，提取次數(shù)4次，提取溫度70℃，每次提取時間180min，提取液經(jīng)過濾，清液真空濃縮至含醇量40％；

2)步驟1)得到的濃縮液，離心得沉淀和上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?/p>

3)步驟2)得到的上清液上大孔吸附樹脂柱hpd-700，分別用2倍柱體積50％，3倍柱體積85％乙醇洗脫，將85％乙醇洗脫液合并，濃縮至比重大于1.25，即得富含重樓皂苷ⅵ提取物；

4)步驟3)得到的樣品，100目硅膠拌樣后，上100目硅膠柱，依次用4倍柱體積乙酸乙酯-乙醇(16:1，w/w)洗脫，薄層層析檢測，將含有重樓皂苷vi成分的洗脫液合并，回收溶劑至近干；

5)步驟4)得到的樣品用60％乙醇溶解后上rp-18柱，依次用2倍柱體積70％、3倍柱體積85％乙醇洗脫，85％洗脫液回收乙醇至基本無醇味后，放置，讓其慢慢析出沉淀，沉淀部分即為重樓皂苷vi粗品。

6)將上述析出的沉淀過濾，用純凈水洗滌2-3次，所得沉淀部分水浴濃縮至近干，105℃干燥2小時，即得所需重樓皂苷ⅵ,重樓皂苷ⅵ經(jīng)hplc檢測，含量為98.8％，水分0.86％。

實(shí)施例4：

1)重樓全株干燥后粗粉碎，用95％乙醇溶液提取，料液比為1:50，提取次數(shù)1次，提取溫度50℃，提取時間180min，提取液經(jīng)過濾，清液真空濃縮至含醇量50％；

2)步驟1)得到的濃縮液，離心得沉淀和上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?/p>

3)步驟2)得到的上清液上大孔吸附樹脂柱ads-8，分別用3倍柱體積50％，3倍柱體積90％乙醇洗脫，將90％乙醇洗脫液合并，濃縮至比重大于1.25，即得富含重樓皂苷vi提取物；

4)步驟3)得到的樣品，100目硅膠拌樣后，上200目硅膠柱，依次用3倍柱體積乙酸乙酯-乙醇(12:1,w/w)洗脫，薄層層析檢測，將含有重樓皂苷vi成分的洗脫液合并，回收溶劑至近干；

5)步驟4)得到的樣品用60％乙醇溶解后上rp-18柱，依次用3倍柱體積70％和3倍柱體積85％乙醇洗脫，取85％洗脫液回收乙醇至基本無醇味后，放置，讓其慢慢析出沉淀，沉淀部分即為重樓皂苷vi粗品；

6)將上述析出的沉淀過濾，用純凈水洗滌2-3次，所得沉淀部分水浴濃縮至近干，105℃干燥2小時，即得所需重樓皂苷ⅵ,重樓皂苷ⅵ經(jīng)hplc檢測，含量為98.6％，水分1.01％。

實(shí)施例5：

1)取延齡草全株干燥后粗粉碎，用60％乙醇溶液提取，料液比為1:30，提取次數(shù)2次，提取溫度80℃，每次提取時間150min，提取液經(jīng)過濾，清液真空濃縮至含醇量40％；

2)步驟1)得到的濃縮液，過濾得沉淀和上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?/p>

3)步驟2)得到的上清液上大孔吸附樹脂柱lsa-20，分別用3倍柱體積50％，5倍柱體積75％乙醇洗脫，將75％乙醇洗脫液合并，濃縮至比重大于1.25，即得富含重樓皂苷vi提取物；

4)步驟3)得到的樣品，100目硅膠拌樣后，上200目硅膠柱，依次用4倍柱體積乙酸乙酯-乙醇(10:1,w/w)洗脫，薄層層析檢測，將含有重樓皂苷vi成分的洗脫液合并，回收溶劑至近干；

5)步驟4)得到的樣品用40％乙醇溶解后上ods柱，依次用2倍柱體積70％乙醇和4倍柱體積75％乙醇洗脫，取75％洗脫液回收乙醇至基本無醇味后，放置，讓其慢慢析出沉淀，沉淀部分即為重樓皂苷vi粗品；

6)將上述析出的沉淀過濾，用純凈水洗滌2-3次，所得沉淀部分水浴濃縮至近干，105℃干燥1小時，即得所需重樓皂苷ⅵ,重樓皂苷ⅵ經(jīng)hplc檢測，含量為98.5％，水分1.32％。

實(shí)施例6：

1)延齡草全株干燥后粉碎，用95％乙醇溶液提取，料液比為1:10，提取次數(shù)3次，提取溫度75℃，每次提取時間60min，提取液經(jīng)過濾，上清液真空濃縮至含醇量50％；

2)步驟1)得到的濃縮液，離心得沉淀和上清液，沉淀?xiàng)壢ィ?/p>

3)步驟2)得到的上清液上大孔吸附樹脂柱hp-20，分別用4倍柱體積50％，4倍柱體積80％乙醇洗脫，將80％乙醇洗脫液合并，濃縮至比重大于1.25，即得富含重樓皂苷vi提取物；

4)步驟3)得到的樣品，100目硅膠拌樣后，上200目硅膠柱，依次用3倍柱體積乙酸乙酯-乙醇(5:1,w/w)洗脫，將含有重樓皂苷vi成分的洗脫液合并，減壓回收溶劑至近干；

5)步驟4)得到的樣品用60％乙醇溶解后上ods柱，依次用2倍柱體積70％乙醇、3倍柱體積85％乙醇洗脫，取85％洗脫液回收乙醇后，放置，讓其慢慢析出沉淀，沉淀部分即為重樓皂苷vi粗品；

6)將上述析出的沉淀過濾，用純凈水洗滌2-3次，所得沉淀部分水浴濃縮至近干，105℃干燥2小時，即得所需重樓皂苷ⅵ，重樓皂苷ⅵ經(jīng)hplc檢測，含量為99.2％，水分0.92％。