專利名稱：滇重樓莖葉單體皂苷在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及滇重樓莖葉單體皂苷的用途，尤其涉及在制藥領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
白血病(leukeamia)是發(fā)生于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。我國白血病發(fā)病率為2.76/10萬，惡性腫瘤死亡率中，白血病居第6位(男性)和第8位(女性)，在兒童及35歲以下成人中高居第1位(葉任高，陸再英主編。內(nèi)科學。第6版。北京人民衛(wèi)生出版社，2004年6月，625)。近年來對白血病的研究逐步深入，在白血病的治療方面，由于有效聯(lián)合化療(chemotherapy)的應(yīng)用和骨髓移植的進展，有不少患者已可長期無病生存。但白血病化療藥物毒副反應(yīng)較大，而且患者最終產(chǎn)生耐藥導致化療失敗。骨髓移植存在骨髓選擇適合的供者困難和價格昂貴的問題，并且移植后相關(guān)死亡率相對較高。學者們不斷探索治療白血病的有效途徑，如生物治療、分子靶向治療等，但傳統(tǒng)的化療仍被認為是最基本的治療手段(何明生，陳明清，王熙才主編。現(xiàn)代腫瘤臨床實用治療學。云南科技出版社，2004年10月，179)。因此，尋找能消滅白血病克隆而對正常造血細胞損傷較小的藥物，成為控制白血病較理想的方法和途徑。
滇重樓(Paris Polyphylla Var.Yunnanensis L)是延齡草科(Trillaceae)重樓屬植物，又名獨角蓮、七葉一枝花、三層草，《中華人民共和國藥典》1995年版、2000年版和2005年版收載該藥為云南重樓(滇重樓)或七葉一枝花的干燥根莖(國家藥典委員會。中華人民共和國藥曲(一部)。北京化學工業(yè)出版社，2005214)為藥用原料。
滇重樓根是多種中成藥和配伍藥的主要原料，民間采用量很大，從上世紀90年代中期以后，僅云南省的用量每年就達數(shù)百噸，全國需要量達到1000噸左右。而其生長速度極其緩慢，因此每年的消耗遠遠超出了野生重樓的生長量，使重樓資源日趨枯竭。滇重樓莖葉則生長迅速，每年其生長量相當于同年根生長量的7～8倍，至今尚未被開發(fā)利用。根據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計，以近年藥用滇重樓根的量計算，每年就有至少3500噸滇重樓的莖葉被丟棄，造成資源的巨大浪費。所以，對重樓地上部分的研究，不僅是對資源的充分利用，也是對自然的保護。迄今為止，國內(nèi)外均未利用地上部分藥用，更無滇重樓莖葉中的單體皂苷用于抗白血病方面的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供滇重樓莖葉單體皂苷的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
實際上，本發(fā)明涉及滇重樓莖葉單體皂苷在制備改善或治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及的滇重樓莖葉單體皂苷的制備方法包括下述步驟(1)以滇重樓地上部分的莖葉為原料，用有機溶劑提取獲得提取物；(2)提取物經(jīng)皂苷樹脂柱，70％洗脫部分為總皂苷；(3)總皂苷經(jīng)硅膠柱層析，洗脫得若干部分，合并相同部位，分別再經(jīng)反相柱層析，洗脫獲得相同皂苷后，分別再重結(jié)晶得到純度為96％以上的滇重樓莖葉單體皂苷I、II、III、IV。
其中，步驟(1)所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、氯仿或乙酸乙酯中的一種。
本發(fā)明所述的滇重樓莖葉單體皂苷用在藥物上時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有0.1％～99％，優(yōu)選為0.5％～90％的本發(fā)明的滇重樓莖葉單體皂苷，其余為藥物學上可接受的，對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用本發(fā)明所述的滇重樓莖葉單體皂苷的藥物生物活性試驗結(jié)果來說明它在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
一、材料和方法1實驗材料1.1樣品、細胞株與試劑(1)樣品滇重樓皂苷I～IV，純度為96％的生物活性提取物，其結(jié)構(gòu)式為

其中，

glc.py＝β-D-glucopyranosylrha.py＝α-L-rhamnopyranosylara.fur＝α-L-arabinofuranosyl上述滇重樓皂苷I～IV在甲醇溶液中均為無色針狀結(jié)晶，熔點216℃～218℃，在中國科學院昆明植物研究所植化研究室分離提純。
(2)細胞株K562(人紅細胞白血病細胞株)、HL60(人急性早幼粒細胞白血病細胞株)，均購自中國科學院上海細胞生物研究所。
(3)主要試劑A.RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司，批號31800-022)；B.小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號040623)；C.Hoechst33258(sigma公司solarbio，B2883)；D.碘化丙啶(PI，Sigma公司)；E.RNA酶(RnaseA，華美生物工程公司)；F.青霉素(中諾藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號04101029)；G.鏈霉素(山東瑞陽制藥有限公司產(chǎn)品，批號03120207)；H.二甲基亞砜(DMSO，AMRESCO公司產(chǎn)品)；I.膜連蛋白-V(Annexin-VFITC，購自IMMUNOTECH公司)；J.鼠單抗Bcl-2(產(chǎn)品編號MAB-0014)、免多抗Bax(產(chǎn)品編號RAB-0092)、兔survivin多克隆抗體(產(chǎn)品編號RAB-0536)，均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；抗Fas抗體為sigma公司產(chǎn)品；K.Immuno-Bridge+試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；L.鬼臼乙叉甙(VP-16，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院亞東藥業(yè)公司浦東藥廠生產(chǎn)，批號028003)；M.順鉑(DDP，云南個舊生物藥業(yè)公司生產(chǎn)，批號20020802)；
N.二甲基四氮唑藍(MTT，AMRESCO生產(chǎn)，批號0752B18)；O.十二烷基硫酸鈉(SDS，上海生物工程有限公司)。
1.2實驗儀器設(shè)備(1)CO2培養(yǎng)箱日本SANYO公司，MCO-15AC型；(2)醫(yī)用凈化工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-IFD型；(3)低速自動平衡離心機北京醫(yī)用離心機廠，LD25-2型；(4)倒置顯微鏡日本OLYMPUS TOKYO公司，CK型；(5)倒置相差顯微鏡重慶光學儀器廠，AC220VIN；(6)熒光顯微鏡LEICA DMIRB型；(7)過濾器上海新亞凈化器件廠；(8)電熱恒溫干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠，GZX-DH-300-S-II型；(9)手提式高壓消毒鍋上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司，YXQ.SG41.280型；(10)流式細胞儀美國BACKMAN-COULTER公司，EPICS XL型；(11)電子天平常熟市雙杰測試儀器廠，JJ200型；(12)酶標板自動讀數(shù)儀美國Bioteck公司，RIDMODEI-3550型；(13)一次性96孔板美國NUNC公司；1.3試劑配置1.3.1RPMI-1640完全培養(yǎng)液的配置(1)將一袋RPMI-1640培養(yǎng)基溶于1L三蒸水中；(2)加入2.2克碳酸氫鈉，充分混勻；(3)過濾器(濾膜為直徑0.22μm+0.45μm)過濾；(4)加10％小牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，調(diào)PH值為7.2，即為RPMI-1640完全培養(yǎng)液。
1.3.2PBS平衡鹽溶液配置
(1)稱取磷酸二氫鈉2.96g、磷酸氫二鈉29.01g、氯化鈉9.0g；(2)將之溶解于600ml雙蒸水中，調(diào)PH值至7.2～7.4之間；(3)最后用雙蒸水定容至1L，即為濃度為0.1mmol/l的PBS溶液(使用時根據(jù)不同濃度的需要進行稀釋)。
1.3.3固定液配置取甲醇30ml、乙酸10ml(3∶1)，混勻避光保存?zhèn)溆谩?br> 2實驗方法2.1細胞培養(yǎng)將K562、HL60細胞置于含有10％小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，用4g/L臺盼藍染色后計算細胞活率為＞98％，調(diào)整細胞密度為5×104/ml備用。
2.2樣品的配置滇重樓莖葉皂苷，設(shè)5個濃度，先用DMSO溶解為10mg/ml，再用RPMI 1640培養(yǎng)液分別稀釋，超聲波混勻，備用。
2.3改良MTT法(1)取備用的K562、HL60細胞懸液接種于96扎培養(yǎng)板，每孔90ul；(2)加入不同濃度的受試樣品，每孔10ul，使其終濃度分別為25、5、1、0.1、0.01ug/ml，每個濃度均設(shè)3個復孔；(3)DDP、VP-16為陽性對照，等體積細胞懸液為陰性對照，1％DMSO為溶媒對照，等體積RPMI-1640培養(yǎng)液為空白對照；(4)加藥后細胞置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時；(5)每孔加MTT(5mg/ml)10ul，繼續(xù)培養(yǎng)4小時；(6)每孔加三聯(lián)液[10％SDS+5％異丁醇+0.012mol/L HCL(W/V/V)]100ul靜置12小時；(7)設(shè)570nm為測定波長，630nm為參考波長，用酶標儀測定各孔的OD值。按下列公式計算細胞增殖抑制率抑制率(％)＝[1-(給藥孔OD值-空白孔OD值)/(陰性孔OD值-空白孔OD值)]×100％采用LOGIT法計算半數(shù)抑制濃度IC50。
2.4細胞形態(tài)學觀察取備用的K562、HL60細胞懸液入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入稀釋后的皂苷II(使其終濃度為5ug/ml)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24小時，然后A.離心收集皂苷II處理后的細胞樣品于離心管內(nèi)，加入0.5ml固定液，緩緩懸起細胞，固定10分鐘；B.離心去固定液，用0.01mmol/L的PBS溶液洗兩遍，每次3分鐘(洗滌期間手動晃動)；C.最后一次離心后吸去大部分液體保留50ul液體，再緩緩懸起細胞，滴加至載玻片上，盡量使細胞分布均勻；D.稍晾干，使細胞貼在載玻片上不易隨液體流動；E.均勻滴上0.5ml Hoechst33258染色液，染色5分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干；F.用0.01mmol/L PBS洗兩遍，每次3分鐘。用吸水紙從邊緣吸去液體，微晾干；G.置于熒光顯微鏡下可檢測到呈藍色的細胞核(激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右)。
2.5流式細胞術(shù)檢測DNA含量A.細胞培養(yǎng)同試驗方法2.1所述。
B.樣品制備取對數(shù)生長期的K562、HL60細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，隨機分為3組，每組細胞懸液為10ml。第一組為樣品組(加入皂苷II，使其終濃度為5ug/ml)，第二組為陽性對照組(加入VP-16，使其終濃度為5ug/ml)，第三組為陰性對照組(不加任何藥品)。
C.三組分別處理24h、48h、72h后離心收集細胞；D.0.01mmol/L PBS液洗滌兩次，加入70％冷乙醇(無水乙醇+0.01mmol/L PBS液配制)制成單細胞懸液，4℃保存過夜；E.離心(1000g×10min)，棄上清，PBS液洗滌1次，離心控盡殘液；F.加入Triton X-100及200ug/ml的RnaseA各200ul，置37℃30分鐘；G.加入100ug/ml的PI染料1ml，室溫避光靜置15分鐘；H.流式細胞儀上進行檢測(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長670nm)，每份樣品測定10000個細胞，隨機軟件檢測DNA含量及計算相應(yīng)的凋亡率。
2.6磷脂酰絲氨酸(PS)轉(zhuǎn)位檢測A.細胞培養(yǎng)同試驗方法2.1所述。
B.樣品制備取對數(shù)生長期的K562細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，隨機分為3組，每組細胞懸液為10ml。第一組為樣品組(加入皂苷II，使其終濃度為5ug/ml)，第二組為陽性對照組(加入VP-16，使其終濃度為5ug/ml)，第三組為陰性對照組(不加任何藥品)；各組均處理24小時。
C.離心收集細胞，PBS液洗滌兩次，低速離心棄上清；D.將細胞重懸于Diluted binding buffer液，將細胞調(diào)至1×106/ml；E.取100ul細胞懸液加入至12×75mm試管中，加入5ul Annexin VFITC標記液和2.5ul PI，混勻；F.將試管置于冰浴中避光孵育10分鐘，加入10ul冷Diluted bindingbuffer，立即上流式細胞儀進行檢測(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長670nm)，每份樣品測定10000個細胞，隨機軟件分析結(jié)果。
2.7免疫組化染色2.6.1Bcl-2表達的免疫組化檢測免疫組化染色操作按試劑盒說明書進行，具體步驟如下
A.細胞培養(yǎng)同試驗方法2.1所述。
B.樣品制備取對數(shù)生長期的K562細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，隨機分為3組，每組細胞懸液為10ml。第一組為樣品組(加入皂苷II，使其終濃度為5ug/ml)，第二組為陽性對照組(加入VP-16，使其終濃度為5ug/ml)，第三組為陰性對照組(不加任何藥品)；各組均處理24小時。
C.離心收集細胞，0.01mmol/L PBS洗3次，離心棄上清；D.加4％多聚甲醛1～2ml混勻，室溫固定15分鐘；E.離心棄上清，PBS洗5分鐘×3次，離心棄上清；將細胞滴到玻片上，微晾干；F.滴3％H2O2，室溫避光30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；G.PBS洗3分鐘×3次，稍晾干；H.滴加5％羊血清封閉，37℃孵育30分鐘，傾去，勿洗；I.滴加工作液Bcl-2(一抗)，37℃孵育1小時，PBS沖洗2分鐘×3次；J.滴加試劑1，室溫孵育20分鐘，PBS沖洗2分鐘×3次；K.滴加試劑2，室溫孵育20分鐘，PBS沖洗2分鐘×3次；L.DAB溶液顯色；M.自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。
2.6.2Bax表達的免疫組化檢測A.細胞培養(yǎng)同前；B.樣品制備取對數(shù)生長期的K562細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，隨機分為3組，每組細胞懸液為10ml。第一組為樣品組(加入皂苷II，使其終濃度為5ug/ml)，第二組為陽性對照組(加入VP-16，使其終濃度為5ug/ml)，第三組為陰性對照組(不加任何藥品)；各組均處理24小時。
C.離心收集細胞，0.01mmol/L PBS洗3次，離心棄上清；D.加4％多聚甲醛1～2ml混勻，室溫固定15分鐘；
E.離心棄上清，PBS洗5分鐘×3次，離心棄上清；將細胞滴到玻片上，微晾干；F.滴3％H2O2，室溫避光30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；G.PBS洗3分鐘×3次，稍晾干；H.滴加5％羊血清封閉，37℃孵育30分鐘，傾去，勿洗；I.滴加工作液Bax(一抗)，37℃孵育1小時，PBS沖洗2分鐘×3次；J.滴加試劑1，室溫孵育20分鐘，PBS沖洗2分鐘×3次；K.滴加試劑2，室溫孵育20分鐘，PBS沖洗2分鐘×3次；L.DAB溶液顯色；M.自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。
2.6.3Fas表達的免疫組化檢測與上述方法類似，I步驟中一抗為Fas。以上3種組化均設(shè)以PBS取代一抗作陰性對照組。
2.8熒光免疫法流式細胞儀檢測細胞凋亡蛋白2.8.1Bcl-2蛋白檢測A.細胞培養(yǎng)同前；B.樣品制備取對數(shù)生長期的HL60細胞，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，隨機分為3組，每組細胞懸液為10ml。第一組為樣品組(加入皂苷II，使其終濃度為5ug/ml)，第二組為陽性對照組(加入VP-16，使其終濃度為5ug/ml)，第三組為陰性對照組(不加任何藥品)。
C.將細胞收集至10ml離心管中，300×g離心5min，棄上清；加入4mlPBS以300×g離心5min，棄上清，用PBS將細胞調(diào)至1×106/ml。
D.分別于Bcl-2及同型對照管中加入100ul細胞懸液及100ulIntraPrep Reagent 1，混勻，于室溫中孵育15min；E.加入4mlPBS洗滌，300×g離心5min，棄上清；
F.每管各加入100ul IntraPrep Reagent 2，輕輕混勻，室溫下孵育5min；G.Bcl-2管中加20ul Bcl-2FITC，同型對照管中加入IgG1-FITC 20ul，混勻，室溫避光孵育15min；H.加入4mlPBS，300×g離心5min，棄上清；加含有10g/L多聚甲醛PBS液0.5ml上機測定。
2.8.2Bax蛋白檢測A～F步驟與上述方法類似；G.加入5.0ul Bax混勻，室溫避光孵育30min；H.加入4mlPBS，300×g離心5min，棄上清；I.加入2.0ul羊抗鼠FITC2，避光孵育30min；J.加入4mlPBS，300×g離心5min，棄上清，加0.5mlPBS混勻。
上機檢測以Flow-Chek校準光路及流路，用Flow-Set較準PMT電壓，用同型對照調(diào)整陰性，流式細胞儀分別檢測Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達的百分率。
2.9統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，實驗結(jié)果以(均數(shù)±標準差)表示，各組間差異采用單因素方差分析，若整體有差異，則兩兩比較用LSD檢驗。兩樣本均數(shù)間的差異顯著性用t檢驗。
二、實驗結(jié)果1.滇重樓皂苷I～IV對K562及HL-60細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.81±0.8、0.08±0.04、0.45±0.26、0.18±0.15ug/ml和2.13±1.03、0.05±0.03、0.01±0.006、0.09±0.01ug/ml，均小于10ug/ml，表現(xiàn)較好的劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。
2.用5ug/ml皂苷II處理K562、HL60細胞24h時，細胞出現(xiàn)大小不等，形狀不規(guī)整，胞核分裂固縮，染色質(zhì)濃集等形態(tài)特征。
3.用皂苷II分別處理K562、HL60細胞24h、48h及72h時均出現(xiàn)亞二倍體峰，并隨作用時間的延長而增加。K562細胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，HL60細胞出現(xiàn)S期阻滯。
4.用皂苷II處理K562細胞24h時，11.2％的細胞出現(xiàn)PS轉(zhuǎn)位，陽性對照組僅3.55％。免疫組織化學染色表明處理組K562細胞低表達Bcl-2蛋白，Bax蛋白無明顯變化，Bcl-2/Bax比值下降；Fas蛋白表達較對照組無明顯上升。(5)皂苷II處理HL60細胞不同時間，熒光免疫法流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白下調(diào)(4.8％→1.6％)、Bax蛋白上調(diào)(12％→63.5％)，Bcl-2/Bax比值較前明顯下降。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點1.迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中尚無滇重樓莖葉單體皂苷作為有效成分在治療白血病方面的報道，也沒有該成分具有抗白血病活性的報道。從傳統(tǒng)的中藥及植物資源中尋找能有效治療白血病的藥物，是國內(nèi)外新藥研究中異?；钴S的領(lǐng)域。本發(fā)明對所述的滇重樓莖葉單體皂苷作為制備和預防白血病的藥物進行了深入研究，取得了令人鼓舞的藥理試驗結(jié)果。
2.滇重樓皂苷I～IV能抑制人白血病細胞株K562、HL60的增殖，其IC50值均小于10ug/ml，具有較強的體外抗白血病活性。皂苷II體外可誘導K562、HL60細胞凋亡，隨著作用時間的延長細胞凋亡率增高。皂苷II誘導K562、HL60細胞凋亡與Bcl-2/Bax比值下降有關(guān)，分析Bcl-2和Bax應(yīng)是滇重樓莖葉皂苷II抗白血病的分子靶點，具有十分重要的意義，預示著良好的藥用前景。
3.本發(fā)明充分利用現(xiàn)有的被白白丟棄的滇重樓的莖葉為原料，變廢為寶，充分利用植物資源，成本低廉，制備工藝簡單，并可制成口服劑型或注射劑型，為人類最終攻克白血病提供了一種經(jīng)濟實用的藥物。


圖1為滇重樓莖葉皂苷對K562細胞的濃度-抑制率曲線圖；圖2為滇重樓莖葉皂苷對HL60細胞的濃度-抑制率曲線圖；圖3為倒置相差顯微鏡觀察5ug/ml皂苷II對K562、HL60細胞作用24小時的影響(×200)，其中，AHL60細胞對照組；BHL60細胞處理組；CK562細胞對照組；DK562細胞處理組；圖4為熒光顯微鏡觀察5ug/ml皂苷II對K562、HL60細胞作用24小時的影響(×400)，其中，AK562細胞對照組；BK562細胞處理組；CHL60細胞對照組；DHL60細胞處理組；圖5為K562細胞經(jīng)5ug/ml皂苷II作用不同時間后細胞周期變化；圖6為5ug/ml皂苷II作用K562細胞不同時間誘導細胞凋亡；圖7為HL60細胞經(jīng)5ug/ml皂苷II作用不同時間后細胞周期變化；圖8為5ug/ml皂苷II作用HL60細胞不同時間誘導細胞凋亡；圖9為K562細胞經(jīng)5ug/ml皂苷作用24h后PS轉(zhuǎn)位，其中，A對照組；B處理組；C陽性對照組；圖10為免疫組化檢測5ug/ml皂苷II作用K562細胞24h時Bcl-2的表達(×200)，其中，A對照組；B處理組；圖11為免疫組化檢測5ug/ml皂苷II作用K562細胞24h時Bax的表達(×200)，其中，A對照組；B處理組；圖12為免疫組化檢測5ug/ml皂苷II作用K562細胞48h時Fas的表達(×200)其中，A對照組；B處理組。
具體實施例方式
通過下面給出的具體實施例可以進一步清楚地了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明內(nèi)容的限定。
實施例1
——滇重樓莖葉單體皂苷的制備以滇重樓地上部分的莖葉為原料，粉碎，用乙醇提?。换厥找掖己蟮乃芪?，上皂苷樹脂柱分別用水，70％乙醇，95％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分回收乙醇為總皂苷；總皂苷經(jīng)硅膠柱層析，用有機溶劑系統(tǒng)(8∶2v/v)洗脫得十部分，分別將第二，四，六九部分各自蒸除有機溶劑，獲得四個餾分；各餾分再經(jīng)反相柱層析，用有機溶劑系統(tǒng)(8∶2--9∶1v/v)洗脫得皂苷I、II、III、IV、個成分；分別重結(jié)晶，各自得到純度為96％-99％的滇重樓莖葉單體皂苷I、II、III、IV。
實施例2滇重樓莖葉皂苷對K562、HL60細胞增殖的影響滇重樓莖葉皂苷I～IV能明顯抑制K562、HL60細胞的增殖，其作用呈較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)計算，滇重樓莖葉皂苷I～IV對K562細胞的IC50分別為0.81±0.8、0.08±0.04、0.45±0.26、0.18±0.15ug/ml，對HL60的IC50分別為2.13±1.03、0.05±0.03、0.01±0.006、0.09±0.01ug/ml，均小于10ug/ml。結(jié)果見表1，其濃度-抑制率曲線見圖1、圖2。
實驗重復3次。滇重樓莖葉皂苷I～IV抑制K562細胞增殖的作用見表1-4，VP-16(陽性對照組)抑制K562細胞增殖的作用見表5；滇重樓莖葉皂苷I～IV抑制HL60細胞增殖的作用見表6-9，DDP(陽性對照組)抑制K562細胞增殖的作用見表10。
表1.滇重樓莖葉皂苷I抑制K562細胞增殖的作用


注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表2.滇重樓莖葉皂苷II抑制K562細胞增殖的作用

注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3 滇重樓莖葉皂苷III抑制K562細胞增殖的作用

注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4 滇重樓莖葉皂苷IV抑制K562細胞增殖的作用

注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表5 VP-16對K562細胞增殖的抑制作用

表6 滇重樓莖葉皂苷I抑制HL60細胞增殖的作用

注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表7 滇重樓莖葉皂苷II抑制HL60細胞增殖的作用

注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表8 滇重樓莖葉皂苷III抑制HL60細胞增殖的作用

注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表9 滇重樓莖葉皂苷IV抑制HL60細胞增殖的作用


注與媒溶對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表10 DDP對HL60細胞增殖的抑制作用

實施例3——細胞形態(tài)學觀察K562、HL60細胞分別經(jīng)5ug/ml的皂苷II作用24小時后，在倒置相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞大小不一，形狀不規(guī)整，胞核分裂固縮。經(jīng)Hoechst33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞體積變小，核固縮，細胞核或細胞漿內(nèi)可見致密的顆粒狀強熒光，嚴重時細胞出泡形成凋亡小體。而正常細胞呈彌漫均勻熒光，且熒光較處理組弱(見圖3，4)。
實施例4——FCM分析凋亡細胞的結(jié)果細胞凋亡后形成凋亡小體，導致細胞DNA丟失，5ug/ml皂苷II處理K562細胞24h、48h、72h后，在流式細胞儀檢測的DNA含量圖中，在G1期前出現(xiàn)亞二倍體峰，細胞凋亡率分別為2.1％(24h)、5.1％(48h)、7.9％(72h)，呈一定的時效關(guān)系(見圖3)。與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。我們還觀察到藥物作用后G0/G1期細胞略有上升，G2/M期細胞明顯下降，細胞阻滯在G2/M期(見圖5，6)。
5ug/ml皂苷II處理HL60細胞24h、48h、72h后，在流式細胞儀檢測的DNA含量圖中，G1期前出現(xiàn)亞二倍體峰，細胞凋亡率分別為8.3％(24h)、15.6％(48h)、27.1％(72h)，呈一定的時效關(guān)系(見圖5)。與對照組相比，差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。本實驗中還觀察到藥物作用24h后，S期細胞增多，G2/M期細胞減少。作用48h～72h后，S期細胞減少，G2/M期細胞逐漸增多。細胞阻滯在S期(見圖7，8)。
實施例5——FCM檢測細胞PS轉(zhuǎn)位結(jié)果Annecin VFITC及PI雙標記后，F(xiàn)CM檢測發(fā)現(xiàn)5ug/ml皂苷II作用K562細胞24小時，11.2％的細胞出現(xiàn)V+PI-(早期凋亡)，1.37％細胞出現(xiàn)V+PI+(晚期凋亡)。而陽性對照組分別為3.55％、0.78％(見圖9)。
實施例6——Bcl-2免疫組化染色結(jié)果Bcl-2蛋白借其末端一個由19個氨基酸組成的疏水性羧基末端與膜相連，定位于細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜及核膜上。5ug/ml皂苷II作用K562細胞24小時，用Bcl-2單抗進行免疫組化檢測，結(jié)果顯示空白對照組Bcl-2表達較高，細胞內(nèi)呈強陽性反應(yīng)，細胞呈深棕色。而實驗組細胞顏色明顯變淺，顯示Bcl-2表達量明顯減少(見圖10)。
實施例7——免疫組化染色結(jié)果Bax蛋白主要定位于細胞質(zhì)，K562細胞經(jīng)皂苷II處理后，Bax蛋白染色強度未見明顯增加(見圖11)。
實施例8——Fas免疫組化染色結(jié)果Fas(Apo-1，CD95)受體是I型跨膜蛋白，是一類能夠直接誘導細胞凋亡的細胞表面抗原。5ug/ml皂苷II作用K562細胞48小時，用Fas單抗進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)處理后K562染色無明顯增強(見圖12)。
實施例9——間接熒光法流式細胞儀檢測Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達5ug/ml皂苷II處理HL60細胞24h、48h后Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達情況見表11。
表11.滇重樓莖葉皂苷II誘導HL60細胞凋亡蛋白表達率

研究滇重樓莖葉皂苷單體I、II、III、IV體外抑制白血病細胞增殖，對其類型和濃度進行篩選，發(fā)現(xiàn)皂苷單體II活性較穩(wěn)定、細胞毒作用較強。選取皂苷II進一步研究其誘導白血病細胞凋亡的作用，探討其抗白血病作用的機制。為將滇重樓莖葉皂苷II開發(fā)成新的靶向治療白血病的藥物提供了可靠的實驗依據(jù)和新思路。
試驗數(shù)據(jù)表明，滇重樓莖葉皂苷II能降低Bcl-2蛋白表達水平，破壞Bcl-2和Bax之間的平衡，通滇重樓莖葉皂苷II對其他腫瘤細胞的增殖抑制作用提供了一定的理論基礎(chǔ)，為將滇重樓莖葉皂苷II開發(fā)成新的靶向抗白血病藥物提供了一定的理論依據(jù)。
權(quán)利要求
1.滇重樓莖葉單體皂苷在制備改善或治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
2.滇重樓莖葉皂苷II在制備改善或治療白血病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了滇重樓莖葉單體皂苷在制藥領(lǐng)域中的新用途。本發(fā)明以滇重樓的莖葉為原料，充分利用植物資源，變廢為寶，保護生態(tài)環(huán)境。深入的生物活性試驗表明，滇重樓皂苷I～IV能抑制人白血病細胞株K562、HL60的增殖，其IC
文檔編號C07H17/04GK1923212SQ20061001098
公開日2007年3月7日 申請日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日
發(fā)明者何明生, 陳昌祥, 王方方, 單芳 申請人:云南省腫瘤醫(yī)院