本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽及其合成方法，尤其涉及一種具有新骨架的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的海洋多肽α芋螺毒素類似物及其合成方法。

背景技術(shù)：

芋螺毒素(conotoxin或conopeptide,或ctx)，由海洋腹足綱軟體動物芋螺(conus)的毒液管和毒囊內(nèi)壁的毒腺所分泌，由許多單一毒肽組成的雞尾酒樣的混合毒素，主要成分是一些對不同離子通道及神經(jīng)受體高專一性的活性多肽化合物。每種芋螺的毒液中可能含50～200個活性多肽。不同種芋螺所含活性肽各不相同，即使同種芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差別，理論上估計有5萬多種不同活性肽存在于芋螺毒液中。芋螺毒素多數(shù)由10～40個氨基酸殘基組成，富含兩對或三對二硫鍵，是發(fā)現(xiàn)的最小核酸編碼的動物神經(jīng)毒素肽，也是二硫鍵密度最高的小肽，可作用于各種離子通道和受體的類型及亞型。

α-芋螺毒素是a-超家族芋螺毒素中分布最廣、豐度最高的家族，它們是一些12～30aa的小肽，通常含兩個二硫鍵，有20種α-芋螺毒素的一級結(jié)構(gòu)得到了確證，分別來自不同的芋螺種。α-芋螺毒素是神經(jīng)或肌肉乙酰膽堿受體的抑制劑。而一種芋螺中同時可能含有6種以上的α-芋螺毒素，其靶位分子均為nachr受體。已知不同生物物種或同一種物種體內(nèi)均存在多種nachr受體亞型，某些生物體內(nèi)nachr受體亞型可達(dá)16種之多。為了適應(yīng)此種生態(tài)環(huán)境，α-芋螺毒素的分子結(jié)構(gòu)不斷進(jìn)化，其二硫鍵間的loop環(huán)框架與氨基酸組成發(fā)生變異。

α芋螺毒素vc1.1是一種作用于乙酰膽堿受體的具有潛在鎮(zhèn)痛活性的多肽，含有四個半胱氨酸形成兩對二硫鍵來維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。目前主要的合成方法是固相合成法，但由于兩對二硫鍵的形成需要進(jìn)行兩步氧化，實驗過程較為繁瑣且降低了最終產(chǎn)率。而且二硫鍵在體內(nèi)容易被谷胱甘肽酶和氧化還原酶還原而使生物活性降低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽，通過改造α芋螺毒素vc1.1得到，合成過程簡單，解決了現(xiàn)有技術(shù)中α芋螺毒素vc1.1的合成實驗步驟繁瑣，終產(chǎn)率低的問題。

本發(fā)明的另一目的是提供一種具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽的合成方法。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽，具有潛在鎮(zhèn)痛性多肽的氨基酸序列是ghcsdprfnydhpeicggaagg。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽的合成方法，具體按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1，將野生型α芋螺毒素vc1.1肽鏈2、8位上的一對二硫鍵刪除，并在肽鏈2、8位分別引入組氨酸與苯丙氨酸，得到具有潛在鎮(zhèn)痛性多肽的氨基酸序列，選擇野生型α芋螺毒素vc1.1作為模板，采用modeller軟件，在linux系統(tǒng)環(huán)境下，利用同源建模方法生成目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，采用dope打分對所獲得的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行打分排序，選取最優(yōu)目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型；

步驟2，采用fmoc固相合成法對最優(yōu)目標(biāo)蛋白的多肽序列進(jìn)行化學(xué)全合成，采用2-ctc樹脂，樹脂活化后，在樹脂上對多肽鏈進(jìn)行合成，利用質(zhì)量濃度15％-25％的哌啶/dmf溶液進(jìn)行氨基酸氮端fmoc的脫保護(hù)，利用hctu、dipea進(jìn)行各氨基酸之間的偶聯(lián)反應(yīng)；偶聯(lián)完成后采用tfa的稀溶液作為切割劑，將多肽鏈從樹脂上切割下來，即得。

本發(fā)明的特征還在于，所述具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽的合成方法還包括以下步驟：將步驟2中所得多肽產(chǎn)物溶解于1ml-5ml的dmf溶液，使多肽濃度達(dá)2mm-5mm，根據(jù)已加入的dmf的體積，加入5mm-25mm的hatu和10mm-50mm的dipea，室溫攪拌3h-4h，反應(yīng)完成后，加入質(zhì)量濃度20％-60％的乙腈水溶液凍干，得到環(huán)化多肽，將環(huán)化多肽的保護(hù)基進(jìn)行切割，采用tfa：tips：h2o＝96：2：2的溶液作為切割劑；室溫攪拌2h-3h，反應(yīng)完成，旋蒸除去大量tfa后，加入冰乙醚，環(huán)多肽析出；隨后采用hplc進(jìn)行純化，得到具有鎮(zhèn)痛活性的環(huán)多肽。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明刪除α芋螺毒素vc1.1序列中的一對二硫鍵，簡化了化學(xué)全合成中的實驗步驟，容易得到最終產(chǎn)物，終產(chǎn)率提高，因為本發(fā)明具有潛在鎮(zhèn)痛性多肽僅含有一對二硫鍵，所以合成過程中不會形成二硫鍵異構(gòu)體，氧化過程只需在弱堿環(huán)境(0.1mnh4hco3，ph＝8～8.5)中氧化，這大大減小了后續(xù)分離純化的負(fù)擔(dān)。相反，野生型α芋螺毒素vc1.1含有兩對二硫鍵，合成過程中需要選擇性保護(hù)，氧化過程也需要兩步，不僅要在空氣中氧化，還需要碘氧化法。因此，本發(fā)明的多肽具有合成容易，純化簡便，避免了異構(gòu)體形成的優(yōu)點。

此外，經(jīng)分子動力學(xué)模擬與核磁共振技術(shù)測定，本發(fā)明具有潛在鎮(zhèn)痛性多肽保留了野生型多肽的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性；經(jīng)過環(huán)化獲得具有鎮(zhèn)痛活性的環(huán)多肽類似物，能夠用于海洋多肽鎮(zhèn)痛藥物的開發(fā)，且該結(jié)構(gòu)序列短結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠用來修飾提高活性并設(shè)計其它多肽藥物。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明刪除α芋螺毒素vc1.1序列中的一對二硫鍵的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是本發(fā)明多肽骨架分子內(nèi)氫鍵的穩(wěn)定性曲線。

圖3a是多肽抑制α9α10nachr的電流強(qiáng)度曲線圖。

圖3b是多肽濃度抑制曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明具有潛在鎮(zhèn)痛性多肽的氨基酸序列是ghcsdprfnydhpeicggaagg；α芋螺毒素vc1.1的氨基酸序列是gccdprcnydhpeic#，#代表氨基化；如圖1所示，α芋螺毒素vc1.1肽鏈2、8位上的二硫鍵被刪除，并在肽鏈2、8位分別引入組氨酸與苯丙氨酸。

實施例1，

具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽的合成方法，具體按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1，在同源模建過程中，需要提供目標(biāo)蛋白與模板蛋白的序列比對及模板蛋白的三維結(jié)構(gòu)，然后使用modeller軟件直接生成目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)；將野生型α芋螺毒素vc1.1肽鏈2、8位上的一對二硫鍵刪除，并在肽鏈2、8位分別引入組氨酸與苯丙氨酸，選擇野生型α芋螺毒素vc1.1作為模板，采用modeller軟件，在linux系統(tǒng)環(huán)境下，利用同源建模方法采用modeller9.14生成100個目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，采用dope打分對所獲得的三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行打分排序，選取最優(yōu)目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型；

步驟2，采用fmoc固相合成法對最優(yōu)目標(biāo)蛋白的多肽序列進(jìn)行化學(xué)全合成，采用2-ctc樹脂，樹脂活化后，在樹脂上對多肽鏈進(jìn)行合成，利用質(zhì)量濃度20％的哌啶/dmf溶液進(jìn)行氨基酸氮端fmoc的脫保護(hù)，利用hctu、dipea進(jìn)行各氨基酸之間的偶聯(lián)反應(yīng)；偶聯(lián)完成后采用tfa的稀溶液作為切割劑，將多肽鏈從樹脂上切割下來，得到具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽。本發(fā)明采用fmoc固相合成法，因其反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，同時避開使用hf作為多肽從樹脂上的切割劑。

步驟3，環(huán)化獲得具有鎮(zhèn)痛活性的環(huán)多肽：對步驟2中所得多肽粗產(chǎn)物進(jìn)行首尾環(huán)化，將其溶解于2ml的dmf溶液，使多肽濃度達(dá)3mm，根據(jù)已加入的dmf的體積，加入10mm的hatu和20mm的dipea，室溫攪拌3h，反應(yīng)完成后，加入50％的乙腈/水溶液凍干，得到已經(jīng)環(huán)化的多肽；為提高環(huán)化產(chǎn)率，多肽鏈上的側(cè)鏈保護(hù)基被保留，因此環(huán)化結(jié)束后，將各保護(hù)基進(jìn)行切割，采用tfa：tips：h2o＝96：2：2的溶液作為切割劑；室溫攪拌2h，反應(yīng)完成，旋蒸除去大量tfa后，加入冰乙醚，環(huán)肽析出。隨后采用hplc進(jìn)行純化，得到的產(chǎn)物對其進(jìn)行表征。常用的表征手段有分析高效液相色譜(analyticalhplc)、質(zhì)譜(ms)、以及核磁共振(nmr)等。其中analyticalhplc用來表征獲得樣品的純度；ms表征樣品的分子量；nmr用來表征樣品的結(jié)構(gòu)。

實施例2，

具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽的合成方法，具體按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1與實施例1相同；

步驟2，采用fmoc固相合成法對最優(yōu)目標(biāo)蛋白的多肽序列進(jìn)行化學(xué)全合成，采用2-ctc樹脂，樹脂活化后，在樹脂上對多肽鏈進(jìn)行合成，利用質(zhì)量濃度15％的哌啶/dmf溶液進(jìn)行氨基酸氮端fmoc的脫保護(hù)，利用hctu、dipea進(jìn)行各氨基酸之間的偶聯(lián)反應(yīng)；偶聯(lián)完成后采用tfa的稀溶液作為切割劑，將多肽鏈從樹脂上切割下來，得到具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽。本發(fā)明采用fmoc固相合成法，因其反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，同時避開使用hf作為多肽從樹脂上的切割劑。

步驟3，環(huán)化獲得具有鎮(zhèn)痛活性的環(huán)多肽：對步驟2中所得多肽粗產(chǎn)物進(jìn)行首尾環(huán)化，將其溶解于1ml的dmf溶液，使多肽濃度達(dá)2mm，根據(jù)已加入的dmf的體積，加入25mm的hatu和10mm的dipea，室溫攪拌3h，反應(yīng)完成后，加入20％的乙腈/水溶液凍干，得到已經(jīng)環(huán)化的多肽；為提高環(huán)化產(chǎn)率，多肽鏈上的側(cè)鏈保護(hù)基被保留，因此環(huán)化結(jié)束后，將各保護(hù)基進(jìn)行切割，采用tfa：tips：h2o＝96：2：2的溶液作為切割劑；室溫攪拌3h，反應(yīng)完成，旋蒸除去大量tfa后，加入冰乙醚，環(huán)肽析出。隨后采用hplc進(jìn)行純化，得到的產(chǎn)物對其進(jìn)行表征。常用的表征手段有分析高效液相色譜(analyticalhplc)、質(zhì)譜(ms)、以及核磁共振(nmr)等。其中analyticalhplc用來表征獲得樣品的純度；ms表征樣品的分子量；nmr用來表征樣品的結(jié)構(gòu)。

實施例3，

具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽的合成方法，具體按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1與實施例1相同；

步驟2，采用fmoc固相合成法對最優(yōu)目標(biāo)蛋白的多肽序列進(jìn)行化學(xué)全合成，采用2-ctc樹脂，樹脂活化后，在樹脂上對多肽鏈進(jìn)行合成，利用質(zhì)量濃度25％的哌啶/dmf溶液進(jìn)行氨基酸氮端fmoc的脫保護(hù)，利用hctu、dipea進(jìn)行各氨基酸之間的偶聯(lián)反應(yīng)；偶聯(lián)完成后采用tfa的稀溶液作為切割劑，將多肽鏈從樹脂上切割下來，得到具有潛在鎮(zhèn)痛性的多肽。本發(fā)明采用fmoc固相合成法，因其反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，同時避開使用hf作為多肽從樹脂上的切割劑。

步驟3，環(huán)化獲得具有鎮(zhèn)痛活性的環(huán)多肽：對步驟2中所得多肽粗產(chǎn)物進(jìn)行首尾環(huán)化，將其溶解于5ml的dmf溶液，使多肽濃度達(dá)5mm，根據(jù)已加入的dmf的體積，加入5mm的hatu和50mm的dipea，室溫攪拌4h，反應(yīng)完成后，加入60％的乙腈/水溶液凍干，得到已經(jīng)環(huán)化的多肽；為提高環(huán)化產(chǎn)率，多肽鏈上的側(cè)鏈保護(hù)基被保留，因此環(huán)化結(jié)束后，將各保護(hù)基進(jìn)行切割，采用tfa：tips：h2o＝96：2：2的溶液作為切割劑；室溫攪拌2h，反應(yīng)完成，旋蒸除去大量tfa后，加入冰乙醚，環(huán)肽析出。隨后采用hplc進(jìn)行純化，得到的產(chǎn)物對其進(jìn)行表征。常用的表征手段有分析高效液相色譜(analyticalhplc)、質(zhì)譜(ms)、以及核磁共振(nmr)等。其中analyticalhplc用來表征獲得樣品的純度；ms表征樣品的分子量；nmr用來表征樣品的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明多肽的生物活性：

本發(fā)明多肽的生物活性測試是在非洲爪蟾卵母細(xì)胞(xenopusoocytes)上采用雙電極電壓鉗(moleculardevicescorp.,sunnyvale,ca))進(jìn)行。測試之前，經(jīng)過乙醚麻醉青蛙、解剖取卵、縫合、離子通道rna轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)等過程(大約需要1周時間)。非均質(zhì)α9α10nachr表達(dá)是通過控制注射不同亞單位mrna的濃度比來實現(xiàn)的。離子通道受體表達(dá)后采用雙膜片鉗來測試毒素的抑制活性。在測試過程中，α芋螺毒素及類似物持續(xù)灌流300s，流速為2ml/min，再加入乙酰膽堿(ach，50μm)持續(xù)灌流120s，流速為5ml/min。然后再施加乙酰膽堿(ach，50μm)流速改為5ml/min，持續(xù)120s。施加激動劑的過程中記錄電流強(qiáng)度。如圖3a所示hcvc1.1與cvc1.1對乙酰膽堿受體激動電流具有顯著的抑制，hcvc1.1的活性與vc1.1相比有所降低，但是跟cvc1.1的抑制活性相當(dāng)。另外，如圖3b所示的多肽濃度抑制曲線進(jìn)一步證實，hcvc1.1的活性雖然低于vc1.1的但是跟cvc1.1的活性相當(dāng)，前者的濃度抑制曲線與后者相比僅略向右平移。通過分析電流強(qiáng)度衰退的強(qiáng)弱推導(dǎo)α芋螺毒素及類似物的半抑制濃度ic50。活性數(shù)據(jù)表明，新設(shè)計的多肽具有明顯的α9α10nachr抑制活性，其活性與改造前相比僅僅降低了3倍，見圖3a。

本發(fā)明多肽的穩(wěn)定性：對其進(jìn)行30ns的分子動力學(xué)模擬，觀察結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的變化，采用二維核磁共振技術(shù)將本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)與野生型結(jié)構(gòu)作比較，驗證結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

分子動力學(xué)模擬：單位溫度變化引起的hn化學(xué)位移變化可以反映多肽骨架分子內(nèi)氫鍵的穩(wěn)定性。當(dāng)化學(xué)位移隨溫度變化越慢，說明對溫度的變化越不敏感，對應(yīng)的多肽結(jié)構(gòu)也越穩(wěn)定。如圖2所示，2號位x代表組氨酸(h)或半胱氨酸(c)，其中野生型α芋螺毒素vc1.1、經(jīng)過環(huán)化的野生型芋螺毒素cvc1.1的2、8號位均對應(yīng)于半胱氨酸，而本發(fā)明多肽hcvc1.12號位對應(yīng)組氨酸(h)，8號位x代表苯丙氨酸(f)。分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示，本發(fā)明多肽主鏈的rmsd平均值在左右，和改造前多肽主鏈的rmsd值相當(dāng)，因此分子動力學(xué)模擬結(jié)果顯示刪除多肽一對二硫鍵其主鏈區(qū)的二級結(jié)構(gòu)不會發(fā)生大的變化，多肽的穩(wěn)定性良好。

二維核磁共振研究：通過開展d2o交換實驗考察新設(shè)計多肽骨架分子內(nèi)氫鍵的穩(wěn)定性。一般來講，分子內(nèi)氫鍵越穩(wěn)定，重水交換的速率就會越慢，化學(xué)位移在單位時間內(nèi)的變化就會越小。同上操作，α芋螺毒素或類似物被溶解在90％h2o/10％d2o，配制成ph為4.5、濃度2mg/ml的溶液。記錄溫度在274k到316k變化所對應(yīng)的tocsy數(shù)值。然后，再向樣品中加入氘代乙腈，重復(fù)上面操作，記錄在溫度變化區(qū)間內(nèi)對應(yīng)的tocsy值。

研究結(jié)果顯示，見圖2，本發(fā)明多肽的化學(xué)位移變化值與改造前相當(dāng)，甚至主鏈核心區(qū)的變化值還略高于改造前的多肽，因此本發(fā)明多肽雖然刪除一對二硫鍵，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與改造前相當(dāng)。

終產(chǎn)率提高：本發(fā)明多肽合成的產(chǎn)率與改造前相比，提高了36％，并且純化過程更加簡便，節(jié)約了純化的溶劑，降低了能耗。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。