本發(fā)明提供了一種能夠大規(guī)模生產(chǎn)艾塞那肽的合成方法，特別是有助于減少消旋和缺失肽及緩解β折疊的形成，屬于多肽合成技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病。持續(xù)高血糖與長(zhǎng)期代謝紊亂等可導(dǎo)致全身組織器官，特別是眼、腎、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)的損害及其功能障礙和衰竭。嚴(yán)重者可引起失水，電解質(zhì)紊亂和酸堿平衡失調(diào)等急性并發(fā)癥酮癥酸中毒和高滲昏迷。全世界糖尿病患者超過(guò)1.5億，其中II型糖尿病人超過(guò)了一半。

艾塞那肽，適應(yīng)癥為本品用于改善2型糖尿病患者的血糖控制，適用于單用二甲雙胍、磺酰脲類(lèi)．以及二甲雙胍合用磺酰脲類(lèi)，血糖仍控制不佳的患者。

艾塞那肽的序列如下：

His¹-Gly²-Glu³-Gly⁴-Thr⁵-Phe⁶-Thr⁷-Ser⁸-Asp⁹-Leu¹⁰-Ser¹¹-Lys¹²-Gln¹³-Met¹⁴-Glu¹⁵-Glu¹⁶-Glu¹⁷-Ala¹⁸-Val¹⁹-Arg²⁰-Leu²¹-Phe²²-Ile²³-Glu²⁴-Trp²⁵-Leu²⁶-Lys²⁷-Asn²⁸-Gly²⁹-Gly³⁰-Pro³¹-Ser³²-Ser³³-Gly³⁴-Ala³⁵-Pro³⁶-Pro³⁷-Pro³⁸-Ser³⁹-NH₂

目前艾塞那肽的合成主要有三種方法：

A：利用基因重組技術(shù)獲得艾塞那肽的序列，在專(zhuān)利CN1635117A、CN1693459A中公開(kāi)了該種方法制備艾塞那肽的技術(shù)；

B：采用液相合成或固液結(jié)合的方法合成，但由于液相合成的工藝比較繁瑣，后處理麻煩，涉及到的關(guān)鍵工藝點(diǎn)太多，因此不利于序列比較長(zhǎng)的多肽的合成。本方法在專(zhuān)利CN1018 35794A中有公開(kāi)提及；

C：采用固相合成的方法，由于液相合成每個(gè)步驟都要進(jìn)行分離提純，對(duì)于39個(gè)殘基的多肽來(lái)說(shuō)，合成周期長(zhǎng)，且中間工藝的關(guān)鍵參數(shù)太多，不易控制，很容易造成工藝的不穩(wěn)定，因此大多還是采用固相合成的方法合成艾塞那肽。如國(guó)內(nèi)專(zhuān)利中的CN101538324、CN101357 938。但是由于逐步偶聯(lián)氨基酸的過(guò)程中，由于每個(gè)氨基酸的特性不同，其存在不同程度的副反應(yīng)，尤其是常規(guī)Fmoc保護(hù)的氨基酸，在連接過(guò)程中，有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)與目標(biāo)肽的性質(zhì)十分接近，導(dǎo)致最終純化分離困難影響收率和產(chǎn)品質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)常規(guī)合成中的不足，采用特殊結(jié)構(gòu)的氨基酸或二肽、三肽小片段，降低了合成過(guò)程中難分離雜質(zhì)的產(chǎn)生概率，可以用以大規(guī)模的生產(chǎn)。

術(shù)語(yǔ)說(shuō)明：

Linker：在多肽與樹(shù)脂間插入的連接臂，起到連接多肽和改善樹(shù)脂性質(zhì)的作用。

偶聯(lián)試劑：能引起氨基酸羧基和氨基縮合形成酰胺鍵的試劑。

β-折疊：多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，肽鍵平面折疊成鋸齒狀，相鄰肽鏈主鏈的N-H和C=O之間形成有規(guī)則的氫鍵，在β-折疊中，所有的肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與β-折疊的長(zhǎng)軸呈垂直關(guān)系。

裂解液：多肽合成完成后，將多肽側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)切斷以及肽鏈從樹(shù)脂上釋放的試劑。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

艾塞那肽的合成步驟：

1）以MBHA/AM resin為起始原料，以linker、氨基酸或二肽、三肽為主要原料進(jìn)行合成。

2）以DIC/HoBt、DIC/HoAt為縮合試劑進(jìn)行縮合延長(zhǎng)肽鏈，20%哌啶/DMF溶液或0.1M 的HoBt 20%哌啶/2%DBU/DMF溶液為脫保護(hù)試劑脫除Fmoc基團(tuán)。

重復(fù)氨基酸偶聯(lián)，脫Fmoc，氨基酸偶聯(lián)，脫Fmoc的過(guò)程得到艾塞那肽的肽樹(shù)脂：

His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin/MBHA resin

所述的各Fmoc-氨基酸、二肽、三肽用量與樹(shù)脂用量的摩爾比為：2~6:1；氨基酸與縮合試劑預(yù)活化在冰水浴的條件下預(yù)活化5~15min，反應(yīng)溫度控制在20-35℃，反應(yīng)時(shí)間控制在30-150mins。

上述步驟得到的肽樹(shù)脂經(jīng)裂解液裂解后，經(jīng)甲基叔丁基醚沉淀得到艾塞那肽粗肽。

切割液比例為：TFA：ETD：H₂O=（87.5~95）：（10~2.5）：（2.5~5）；樹(shù)脂與切割液的比例為6~15ml/g肽樹(shù)脂，裂解液在-10~-20℃下預(yù)冷30mins，裂解時(shí)間在2.5~4hrs，裂解溫度在20~40℃。

本發(fā)明優(yōu)選TFA：EDT：H₂O=90：5：5，裂解液在-20℃下預(yù)冷30mins，裂解時(shí)間為180mins，裂解溫度控制在30℃，裂解液與樹(shù)脂比例選擇為8ml/g肽樹(shù)脂，過(guò)濾后的裂解液與甲基叔丁基醚比例為1:6（v/v）。

將得到的艾塞那肽粗品經(jīng)制備色譜純化凍干后得到艾塞那肽成品。

Fmoc-His-Gly-OH.HCl的制備為：

將原料Fmoc-His(Trt)-OH溶于無(wú)水DCM中，再加入1.5eq的EDCI，HoSu在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，攪拌22hrs，然后水洗，飽和食鹽水洗，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥得到Fmoc-His(Trt)-Osu，將得到的Fmoc-His(Trt)-Osu用THF溶解，滴加到含有1.2eq的H-Gly-OH的碳酸氫鈉水溶液中，反應(yīng)3hrs，過(guò)濾，旋蒸。然后用磷酸水溶液調(diào)節(jié)Ph到3~4，DCM萃取，后有機(jī)相酸洗，水洗，飽和食鹽水洗滌，干燥后得到Fmoc-His(Trt)-Gly-OH用4N 的鹽酸乙酸乙酯處理2.5hrs，旋干后，過(guò)層析柱得到Fmoc-His-Gly-OH.HCl。

本發(fā)明的有益效果是：該方法以AM/MAHA樹(shù)脂為起始樹(shù)脂，然后通過(guò)Rink amide linker作為連接橋，再依次連接氨基酸或二肽，三肽片段的方法得到艾塞那肽的肽樹(shù)脂，本發(fā)明通過(guò)Fmoc-(Hmb)Leu21-OH的引入有效緩解了肽鏈Ser11-Val19間的β折疊的情況，并通過(guò)Fmoc-Pro36-Pro37-Pro38–OH片段的引入有效減少了逐步連接Pro36-Pro37-Pro38過(guò)程中De-Pro的雜質(zhì)。最后采用Fmoc-His-Gly-OH的引入減少了（D-His1）以及（De-Gly2）、（+Gly)的雜質(zhì)，從而降低了分離純化時(shí)的難度，大大提高了產(chǎn)品收率和純度。

具體的實(shí)施方式：

以下通過(guò)實(shí)例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但是，這些實(shí)例只是為了更加詳細(xì)具體的說(shuō)明本發(fā)明的具體操作，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。

實(shí)施例1

將原料Fmoc-His(Trt)-OH（62g，100mmol）溶于無(wú)水DCM(200ml)中，再加入EDCI(28.8g，150mmol)，HoSu(17.3g，150mmol)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，攪拌22hrs，然后水洗(60ml*3)，飽和食鹽水洗(60ml*3)，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥得到Fmoc-His(Trt)-Osu(68.5g，收率：95.6%)。將得到的Fmoc-His(Trt)-Osu（95.6mmol）用THF(100ml)溶解，滴加到含有H-Gly-OH(9.75g，114.7mmol)的碳酸氫鈉(15.2g，143.4mmol)水溶液(50ml)中，反應(yīng)3hrs，過(guò)濾，旋蒸。然后用5%磷酸水溶液調(diào)節(jié)pH值到3~4，DCM萃取，隨后有機(jī)相經(jīng)酸洗，水洗，飽和食鹽水洗滌，干燥后得到的Fmoc-His(Trt)-Gly-OH用4N 的鹽酸乙酸乙酯(100ml)處理2.5hrs，旋干后，經(jīng)層析柱純化，得到Fmoc-His-Gly-OH.HCl(34.1g，78.39mmol)，收率82%；

實(shí)例2全保護(hù)的艾塞那肽肽樹(shù)脂的制備

（1）稱(chēng)取AM resin（9.4g，5mmol，sub：0.53mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應(yīng)器中，加入100mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(5.4g，10mmol)，HoBt(1.35g，10mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(1.58ml，10mmol)，在循環(huán)水溫30℃的夾套反應(yīng)器中反應(yīng)2.5hrs，反應(yīng)終點(diǎn)用茚三酮檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，呈陰性，說(shuō)明反應(yīng)完全。

反應(yīng)完全后，用脫保護(hù)液脫保護(hù)，Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro -Pro-Ser(tBu)-AM resin 段用20%哌啶/DMF溶液脫保護(hù)30mins，His-Gly-Glu(OtBu)-Gly- Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)段脫保護(hù)用0.1M 的HoBt 20%哌啶/2%DBU/DMF溶液脫保護(hù)30mins。

每步氨基酸的偶聯(lián)按照[0024]中連接方式偶聯(lián)，但每次偶聯(lián)試劑及氨基酸需要在冰水浴中預(yù)活化15min左右，再進(jìn)行連接。

依次偶聯(lián)的氨基酸為：

Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Pro-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-(Hmb)Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-His-Gly-OH。

制得艾塞那肽的全保護(hù)肽樹(shù)脂如下：

His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin。

實(shí)例3全保護(hù)的艾塞那肽肽樹(shù)脂的制備

稱(chēng)取AM resin（28.3g，15mmol，sub：0.53mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應(yīng)器中，加入300mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(16.19g，30mmol)，HoBt(4.06g，30mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(4.75ml，30mmol)，在循環(huán)水溫30℃的夾套反應(yīng)器中反應(yīng)2.5hrs，反應(yīng)終點(diǎn)用茚三酮檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，呈陰性，說(shuō)明反應(yīng)完全，其余氨基酸的連接按照Rink amide linker 的偶聯(lián)方式進(jìn)行連接，但每次都是對(duì)氨基酸在冰水浴條件進(jìn)行預(yù)活化15min左右，再進(jìn)行偶聯(lián)得到艾塞那肽全保護(hù)肽樹(shù)脂：

His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin。

實(shí)例4全保護(hù)的艾塞那肽肽樹(shù)脂的制備

稱(chēng)取MBHA resin（10g，5mmol，sub:0.5mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應(yīng)器中，加入100mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(5.4g，10mmol)，HoBt(1.35g，10mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(1.58ml，10mmol)，在循環(huán)水溫30℃的夾套反應(yīng)器中反應(yīng)2.5hrs，反應(yīng)終點(diǎn)用茚三酮檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，呈陰性，說(shuō)明反應(yīng)完全，其余氨基酸的連接按照Rink amide linker 的偶聯(lián)方式進(jìn)行連接，但每次都是對(duì)氨基酸在冰水浴條件進(jìn)行預(yù)活化15min左右，再進(jìn)行偶聯(lián)得到艾塞那肽全保護(hù)肽樹(shù)脂：

His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide MBHA resin。

實(shí)例5全保護(hù)的艾塞那肽肽樹(shù)脂的制備

稱(chēng)取MBHA resin（30g，15mmol，sub:0.5mmol/g）加入到帶夾套的玻璃反應(yīng)器中，加入300mlDCM溶脹2hrs，再抽濾，并用2%DIEA/DCM溶液洗滌2次，DMF洗滌兩次，加入Rink amide linker(16.19g，30mmol)，HoBt(4.06g，30mmol)，再用適量DMF溶解后，加入DIC(4.75ml，30mmol)，在循環(huán)水溫30℃的夾套反應(yīng)器中反應(yīng)2.5hrs，反應(yīng)終點(diǎn)用茚三酮檢測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，呈陰性，說(shuō)明反應(yīng)完全，其余氨基酸的連接按照Rink amide linker 的偶聯(lián)方式進(jìn)行連接，但每次都是對(duì)氨基酸在冰水浴條件進(jìn)行預(yù)活化15min左右，再進(jìn)行偶聯(lián)得到艾塞那肽全保護(hù)肽樹(shù)脂：

His-Gly-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu10-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-(Hmb)Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-rink amide AM resin。

實(shí)例6 艾塞那肽粗肽的制備

裂解液的配制：配置裂解液100ml，其中三氟乙酸90ml，EDT(1，2-乙二硫醇）5ml，純水5ml，搖勻后-20℃冷卻30min備用。

將實(shí)例2中的全保護(hù)艾塞那肽樹(shù)脂10g(-20℃預(yù)冷30min)，加入到250ml帶有磁子的圓底燒瓶中，將[034]中的裂解液取出搖勻，量取80ml加入到燒瓶中，裂解溫度在30min上升到30℃，并維持30±2℃攪拌2.5hrs。用砂芯漏斗過(guò)濾并用少量切割液洗滌樹(shù)脂。將合并的濾液緩慢導(dǎo)入冷甲基叔丁基醚（-20℃預(yù)冷2hr）540ml，倒入過(guò)程要保持甲基叔丁基勻速攪拌，出現(xiàn)白色沉淀，用布氏漏斗過(guò)濾，并用冷甲基叔丁基醚洗滌濾餅3次，真空抽干得到粗肽4.82g（收率：92.1%）

實(shí)例7 艾塞那肽粗肽的制備

裂解液的配制：配置裂解液100ml，其中三氟乙酸90ml，EDT(1，2-乙二硫醇）5ml，純水5ml，搖勻后-20℃冷卻30min備用。

將實(shí)例3中的全保護(hù)艾塞那肽樹(shù)脂10g(-20℃預(yù)冷30min)，加入到250ml帶有磁子的圓底燒瓶中，將[037]中的裂解液取出搖勻，量取80ml加入到燒瓶中，裂解溫度在30min上升到30℃，并維持30±2℃攪拌2.5hrs。用砂芯漏斗過(guò)濾并用少量切割液洗滌樹(shù)脂。將合并的濾液緩慢導(dǎo)入冷甲基叔丁基醚（-20℃預(yù)冷2hr）540ml，倒入過(guò)程要保持甲基叔丁基醚勻速攪拌，出現(xiàn)白色沉淀，用布氏漏斗過(guò)濾，并用冷甲基叔丁基醚洗滌濾餅3次，真空抽干得到粗肽4.75g（收率：91.8%）

實(shí)例8 艾塞那肽粗肽的制備

裂解液的配制：配置裂解液500ml，其中三氟乙酸450ml，EDT(1，2-乙二硫醇）25ml，純水25ml，搖勻后-20℃冷卻30min備用。

將實(shí)例4中的全保護(hù)艾塞那肽樹(shù)脂50g(-20℃預(yù)冷30min)，加入到1L帶有磁子的圓底燒瓶中，將[040]中的裂解液取出搖勻，量取400ml加入到燒瓶中，裂解溫度在30min上升到30℃，并維持30±2℃攪拌2.5hrs。用砂芯漏斗過(guò)濾并用少量切割液洗滌樹(shù)脂。將合并的濾液緩慢導(dǎo)入冷甲基叔丁基醚（-20℃預(yù)冷2hr）2.7L，倒入過(guò)程要保持甲基叔丁基勻速攪拌，出現(xiàn)白色沉淀，用布氏漏斗過(guò)濾，并用冷甲基叔丁基醚洗滌濾餅3次，真空抽干得到粗肽24.8g（收率：93.3%）

實(shí)例9 艾塞那肽粗品的純化

稱(chēng)取艾塞那肽的粗品用10%的醋酸水溶液溶解，溶液用0.45μm的微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，待用。

高效液相色譜法進(jìn)行純化的條件，色譜柱以粒徑為10μm，孔徑為300?的C18鍵合硅膠為固定相。經(jīng)過(guò)2步純化一步換鹽得到艾塞那肽的成品。純度為99。47%，[D-His1]雜質(zhì)，[De-Gly2]雜質(zhì)，[+Gly2]雜質(zhì)均小于0.1%。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。