本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物與方法。
背景技術(shù)：
：番茄(LycopersiconesculentumL.)是世界上重要的蔬菜作物之一，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于番茄及其制品的獨(dú)特食用、保健及輔助治療的功效，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和貿(mào)易中占有重要的地位。根據(jù)世界加工番茄理事會(huì)(WPTC)發(fā)布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：2013年全球加工番茄產(chǎn)量為3,301.2萬(wàn)噸。伴隨著我國(guó)番茄種業(yè)的優(yōu)勢(shì)發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)了一些套牌品種，以次充好，影響了種植戶的產(chǎn)量和收入；甚至人非法盜取育種材料進(jìn)行繁種，嚴(yán)重影響了我國(guó)育種單位的利益及我國(guó)番茄種業(yè)的健康發(fā)展，因此，優(yōu)良番茄品種真實(shí)性的快速、準(zhǔn)確鑒定以服務(wù)于種子執(zhí)法單位的監(jiān)管檢測(cè)及育種單位種子質(zhì)量?jī)?nèi)部控制，成為番茄生產(chǎn)中迫切需要解決的問(wèn)題之一。傳統(tǒng)鑒定番茄品種真實(shí)性的方法主要有形態(tài)學(xué)田間小區(qū)鑒定法。田間小區(qū)鑒定方法主要是對(duì)番茄的子葉、葉片、第一束花的形成時(shí)間和果實(shí)的顏色、果實(shí)室數(shù)、果實(shí)表面構(gòu)造和抗病特性等主要園藝性狀進(jìn)行鑒別，從而判斷品種真實(shí)性及種子純度(呂書文,李海濤,許文奎,王永成,金秀玲(2004)淺談利用苗期標(biāo)志性狀檢測(cè)番茄雜交種的純度.種子23(4):74-75.)。這種方法較費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，占用大量的土地，需要經(jīng)過(guò)3-5個(gè)月的生長(zhǎng)成熟期；有時(shí)可用于品種鑒定的形態(tài)特征數(shù)目有限，且多數(shù)形態(tài)性狀易受環(huán)境因素的影響，所以僅靠形態(tài)特征來(lái)鑒別品種真實(shí)性及種子純度的準(zhǔn)確率會(huì)受到影響?？焖贉y(cè)定法中有一些是生化技術(shù)，特別是聚丙烯酰胺電泳法，用于檢測(cè)種子中貯藏蛋白和同工酶遺傳組成的差異，是目前使用較多的室內(nèi)檢測(cè)方法。用于番茄品種純度鑒定的同工酶主要有POD，EST，ACP，ADH，MDH等，但由于栽培番茄遺傳變異小、多態(tài)性較低、可利用的酶種類少，且酶的表達(dá)量與組織發(fā)育狀況及發(fā)育時(shí)期有關(guān)，難以用于一些F1代雜種的品種鑒定與純度檢測(cè)。以DNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記如RFLP、RAPD、SSR、AFLP與ISSR等，具有檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，已開始應(yīng)用于蔬菜作物品種真實(shí)性鑒定與純度檢測(cè)中。SSR(SimpleSequenceRepeat)標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子標(biāo)記，屬于顯性標(biāo)記，在基因組中分布平均、多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)程序簡(jiǎn)單而逐漸被重視，與其他分子標(biāo)記(RFLP、RAPD、AFLP等)相比，具有所需樣品DNA量少、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、易于推廣等特點(diǎn)，已在許多農(nóng)作物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性研究、標(biāo)記和定位基因以及分子標(biāo)記輔助選擇等方面得到廣泛應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何鑒定番茄品種真實(shí)性與種子純度。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物為成套引物1和/或成套引物2，所述成套引物1為名稱分別為Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13和Sol_SSR96的引物對(duì)中的至少一種；所述成套引物2為名稱分別為Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300的引物對(duì)中的至少一種；所述Sol_SSR19、所述Sol_SSR120、所述Sol_SSR305、所述Sol_SSR18、所述Sol_SSR132、所述Sol_SSR3、所述Sol_SSR110、所述Sol_SSR146、所述Sol_SSR125、所述Sol_SSR117、所述Sol_SSR101、所述Sol_SSR218、所述Sol_SSR225、所述Sol_SSR97、所述Sol_SSR185、所述Sol_SSR233、所述Sol_SSR184、所述Sol_SSR254、所述Sol_SSR318、所述Sol_SSR272、所述Sol_SSR68、所述Sol_SSR169、所述Sol_SSR13、所述Sol_SSR96、所述Sol_SSR190、所述Sol_SSR303、所述Sol_SSR302、所述Sol_SSR148、所述Sol_SSR304、所述Sol_SSR45、所述Sol_SSR24、所述Sol_SSR76、所述Sol_SSR306、所述Sol_SSR308、所述Sol_SSR201、所述Sol_SSR23、所述Sol_SSR126、所述Sol_SSR312、所述Sol_SSR224、所述Sol_SSR313、所述Sol_SSR239、所述Sol_SSR315、所述Sol_SSR69、所述Sol_SSR266、所述Sol_SSR317、所述Sol_SSR283、所述Sol_SSR321和所述Sol_SSR300的兩條引物的序列依次為如下c1)、c2)、c3)或c4)：c1)序列表中序列1-96所示的96條序列；c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的96條序列；c3)與c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；c4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的序列雜交的序列；其中序列表中序列2n與序列2n-1組成一個(gè)引物對(duì)(表1)，序列2n為下游引物，序列2n-1為上游引物，n為1-24中的一個(gè)自然數(shù)。序列表中序列1-96中，各序列的第1位均為相應(yīng)引物的5’端。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的序列為在序列表中序列1-96所示的96條序列中的至少一條的5′端和/或3′端添加一至十個(gè)核苷酸得到的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的序列1-96所示的96條序列中的至少一條的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述85％以上同一性，可為85％、90％或95％以上的同一性。上述成套引物中的各引物對(duì)均可由熒光物質(zhì)標(biāo)記。所述熒光物質(zhì)具體可為FAM(如6-FAM)、NED、PET或VIC。所述熒光物質(zhì)具體均可標(biāo)記在各引物對(duì)上游引物的5’端。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述Sol_SSR19、所述Sol_SSR120、所述Sol_SSR125、所述Sol_SSR101、所述Sol_SSR225、所述Sol_SSR68、所述Sol_SSR190、所述Sol_SSR304、所述Sol_SSR23、所述Sol_SSR313、所述Sol_SSR239、所述Sol_SSR266和所述Sol_SSR321均由6-FAM標(biāo)記；所述Sol_SSR3、所述Sol_SSR146、所述Sol_SSR117、所述Sol_SSR184、所述Sol_SSR272、所述Sol_SSR96、所述Sol_SSR24、所述Sol_SSR201、所述Sol_SSR126、所述Sol_SSR224、所述Sol_SSR315和所述Sol_SSR283均由NED標(biāo)記；所述Sol_SSR305、所述Sol_SSR132、所述Sol_SSR110、所述Sol_SSR233、所述Sol_SSR254、所述Sol_SSR318、所述Sol_SSR302、所述Sol_SSR148、所述Sol_SSR76、所述Sol_SSR308和所述Sol_SSR300均由PET標(biāo)記；所述Sol_SSR18、所述Sol_SSR218、所述Sol_SSR97、所述Sol_SSR185、所述Sol_SSR169、所述Sol_SSR13、所述Sol_SSR303、所述Sol_SSR45、所述Sol_SSR306、所述Sol_SSR312、所述Sol_SSR69和所述Sol_SSR317均由VIC標(biāo)記。上述成套引物中的各對(duì)引物可以單獨(dú)使用分別進(jìn)行單獨(dú)的PCR擴(kuò)增。各對(duì)引物單獨(dú)使用時(shí)，這引物對(duì)間的配比沒(méi)有要求。每種引物對(duì)中的兩條單鏈DNA的摩爾比均可為1：1。所述成套引物中的各引物對(duì)均可獨(dú)立包裝，各單鏈DNA也均可獨(dú)立包裝。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性的方法，包括：利用所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物對(duì)兩個(gè)或兩個(gè)以上待測(cè)番茄基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到各待測(cè)番茄的PCR產(chǎn)物；根據(jù)各待測(cè)番茄的PCR產(chǎn)物的差異確定所述兩個(gè)或兩個(gè)以上待測(cè)番茄是否為同一品種。上述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性的方法中，所述差異具體是指各待測(cè)番茄的各個(gè)引物對(duì)的PCR產(chǎn)物中DNA片段個(gè)數(shù)和/或長(zhǎng)度在不同待測(cè)番茄間的差異。所述差異可通過(guò)DNA分析儀和/或DNA分析軟件和/或模塊進(jìn)行確定。所述DNA分析儀具體可為ABI3730xlDNA分析儀。所述DNA分析軟件可為GENEMAPPER。上述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性的方法中，確定所述兩個(gè)或兩個(gè)以上待測(cè)番茄是否為同一品種的具體方法可為：在兩個(gè)待測(cè)番茄的所述番茄SSR引物對(duì)的PCR產(chǎn)物中，如兩個(gè)待測(cè)番茄的PCR產(chǎn)物的差異個(gè)數(shù)≥2，這兩個(gè)待測(cè)番茄為“不同品種”；如兩個(gè)待測(cè)番茄的PCR產(chǎn)物的差異個(gè)數(shù)＝1，這兩個(gè)待測(cè)番茄為“近似品種”；如兩個(gè)待測(cè)番茄的PCR產(chǎn)物的差異個(gè)數(shù)＝0，這兩個(gè)待測(cè)番茄為“極近似或相同品種”。對(duì)利用48對(duì)SSR引物仍未檢測(cè)到≥2個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)的待測(cè)番茄，如果相關(guān)品種存在特定標(biāo)記，必要時(shí)增加其特定標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。上述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性的方法中，利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中各引物對(duì)的上下游引物在反應(yīng)體系中的濃度均可為10pM。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度均可為56℃。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的10μL反應(yīng)體系均可為：2×TaqPCRMix5μL，上下游引物(上下游引物在反應(yīng)體系中的濃度均為10pM)，待測(cè)DNA樣品，補(bǔ)水到終體積為10μL。其中2×TaqPCRMix具體可為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為CW0718M。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件均可為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。在利用所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物鑒定番茄品種真實(shí)性時(shí)，可先利用所述成套引物1進(jìn)行鑒定，并按照上述確定所述兩個(gè)或兩個(gè)以上待測(cè)番茄是否為同一品種的方法確定待測(cè)番茄樣品是否為同一品種；在利用所述成套引物1鑒定的結(jié)果為“近似品種”或“極近似或相同品種”時(shí)，再利用所述成套引物2進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，并按照上述確定所述兩個(gè)或兩個(gè)以上待測(cè)番茄是否為同一品種的方法最終確定待測(cè)番茄樣品是否為同一品種。在僅利用所述成套引物1進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，利用所述成套引物1得到的結(jié)果即為最后結(jié)果，在先后利用所述成套引物1和所述成套引物2進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，利用所述成套引物2得到的結(jié)果即為最終結(jié)果。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定番茄種子純度的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定番茄種子純度的方法，包括：利用所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物對(duì)待測(cè)番茄樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到各待測(cè)番茄樣品的PCR產(chǎn)物；根據(jù)所述待測(cè)番茄樣品間PCR產(chǎn)物的差異確定所述待測(cè)番茄樣品的種子純度。所述根據(jù)所述待測(cè)番茄樣品間PCR產(chǎn)物的差異確定所述待測(cè)番茄樣品的種子純度具體可為根據(jù)公式1和公式2計(jì)算待測(cè)番茄種子純度；種子純度p＝(NT-ND)/NT×100％(公式1)，其中p表示利用一對(duì)番茄SSR引物對(duì)得到的種子純度，所述番茄SSR引物對(duì)為所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物中的引物對(duì)，NT表示供檢種子數(shù)目，ND表示利用一對(duì)番茄SSR引物對(duì)得到的雜種子數(shù)目；種子純度P＝利用所用的所述番茄SSR引物對(duì)得到的種子純度之和/n(公式2)，其中n表示所用的所述番茄SSR引物對(duì)數(shù)目。上述鑒定或輔助鑒定番茄種子純度的方法中，所述待測(cè)番茄樣品的樣品數(shù)可大于等于10，如大于等于94。上述鑒定或輔助鑒定番茄種子純度的方法中，所述差異具體是指各待測(cè)番茄樣品的各個(gè)引物對(duì)的PCR產(chǎn)物中DNA片段個(gè)數(shù)和/或長(zhǎng)度在不同待測(cè)番茄樣品間的差異。所述差異可通過(guò)DNA分析儀和/或DNA分析軟件和/或模塊進(jìn)行確定。所述DNA分析儀具體可為ABI3730xlDNA分析儀。所述DNA分析軟件可為GENEMAPPER。上述鑒定或輔助鑒定番茄種子純度的方法中，利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中各引物對(duì)的上下游引物在反應(yīng)體系中的濃度均可為10pM。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度均可為56℃。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的10μL反應(yīng)體系均可為：2×TaqPCRMix5μL，上下游引物(上下游引物在反應(yīng)體系中的濃度均為10pM)，待測(cè)DNA樣品，補(bǔ)水到終體積為10μL。其中2×TaqPCRMix具體可為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為CW0718M。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件均可為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。上述鑒定或輔助鑒定番茄種子純度的方法中，再利用所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物鑒定種子純度時(shí)，可先利用所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行測(cè)試選出有利于鑒定所述待測(cè)樣本種子純度的引物對(duì)，選出的引物對(duì)可為1-48對(duì)，利用選出的引物對(duì)進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性或種子純度的系統(tǒng)。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性或種子純度的系統(tǒng)，包括所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物。所述系統(tǒng)可僅為鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物，也可由所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物與進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器組成，也可由所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物與進(jìn)行DNA分析所需的儀器和/或軟件和/或模塊組成，也可由所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物與所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑和/或儀器以及所述進(jìn)行DNA分析所需的儀器和/或軟件和/或模塊組成。所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的試劑可為2×TaqPCRMix，2×TaqPCRMix可為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為CW0718M。所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需的儀器可為PCR儀。所述進(jìn)行DNA分析所需的儀器可為DNA分析儀，如ABI3730xlDNA分析儀。所述進(jìn)行DNA分析所需的軟件可為GENEMAPPER。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物在下述X1)-X5)中任一種中的應(yīng)用：X1)在制備鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性產(chǎn)品中的應(yīng)用；X2)在制備鑒定或輔助鑒定番茄種子純度產(chǎn)品中的應(yīng)用；X3)在鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性中的應(yīng)用；X4)在鑒定或輔助鑒定番茄種子純度中的應(yīng)用；X5)在番茄育種中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述系統(tǒng)在下述X1)-X5)中任一種中的應(yīng)用：X1)在制備鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性產(chǎn)品中的應(yīng)用；X2)在制備鑒定或輔助鑒定番茄種子純度產(chǎn)品中的應(yīng)用；X3)在鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性中的應(yīng)用；X4)在鑒定或輔助鑒定番茄種子純度中的應(yīng)用；X5)在番茄育種中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了番茄SSR指紋圖譜構(gòu)建方法。本發(fā)明所提供的番茄SSR指紋圖譜構(gòu)建方法，包括利用所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物對(duì)供試番茄DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建供試番茄的SSR指紋圖譜。上述番茄SSR指紋圖譜構(gòu)建方法中，所述檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)DNA分析儀和/或DNA分析軟件進(jìn)行檢測(cè)。所述DNA分析儀具體可為ABI3730xlDNA分析儀。所述DNA分析軟件具體可為GENEMAPPER。上述番茄SSR指紋圖譜構(gòu)建方法中，利用所述DNA分析儀進(jìn)行檢測(cè)可包括：將不同熒光物質(zhì)標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行稀釋混合后再利用所述DNA分析儀進(jìn)行電泳。其中，6-FAM(藍(lán)色)和VIC(綠色)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物均可稀釋30倍，NED(黑色)和PET(紅色)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物均可稀釋10倍。各稀釋后的PCR產(chǎn)物可等體積混合。利用所述DNA分析儀進(jìn)行電泳前還可包括將稀釋混合得到的液體95℃變性5min然后于冰上冷卻10min。上述番茄SSR指紋圖譜構(gòu)建方法中，利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中各引物對(duì)的上下游引物在反應(yīng)體系中的濃度均可為10pM。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度均可為56℃。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的10μL反應(yīng)體系均可為：2×TaqPCRMix5μL，上下游引物(上下游引物在反應(yīng)體系中的濃度均為10pM)，待測(cè)DNA樣品，補(bǔ)水到終體積為10μL。其中2×TaqPCRMix具體可為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為CW0718M。利用每個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件均可為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述番茄SSR指紋圖譜構(gòu)建方法在鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性或種子純度中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物或所述系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明所提供的所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物或所述系統(tǒng)的制備方法，包括A1)或A2)：A1)將所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物中各單鏈DNA單獨(dú)包裝；A2)將所述鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物中各單鏈DNA包裝在一起。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物不僅可以用來(lái)鑒定番茄品種真實(shí)性，還可以鑒定番茄的種子純度，且具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、不受環(huán)境條件及發(fā)育時(shí)期的影響、統(tǒng)計(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明還建立了番茄SSR指紋圖譜及品種真實(shí)性鑒定方法與種子純度鑒定，用于番茄品種真實(shí)性的鑒定和種子純度的鑒定。利用本發(fā)明的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和/或種子純度的成套引物在鑒定種子純度時(shí)，不僅可以鑒定同一父母本的雜交后代的純度，還可以從一批種子中檢測(cè)是否純?cè)陔s種子及該批種子的純度。本發(fā)明立足于我國(guó)番茄育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展，建立了精確、快速、高通量和高度自動(dòng)化的基于SSR標(biāo)記的番茄品種真實(shí)性鑒定及種子純度鑒定技術(shù)體系，為保護(hù)我國(guó)番茄育種單位產(chǎn)權(quán)利益、維護(hù)我國(guó)番茄育種產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展提供技術(shù)支撐，對(duì)規(guī)范、監(jiān)管種子市場(chǎng)、保護(hù)種植戶的產(chǎn)量和收入具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。附圖說(shuō)明圖1為100份番茄品種的聚類分析結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物的制備本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物為成套引物1和成套引物2，成套引物1為名稱分別為Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13和Sol_SSR96的24對(duì)引物；成套引物2為名稱分別為Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300的24對(duì)引物。每對(duì)引物的上游引物的5’端均由熒光物質(zhì)標(biāo)記，每對(duì)引物對(duì)的序列及標(biāo)記的熒光物質(zhì)如表1所示，其中序列表中序列2n與序列2n-1組成一個(gè)引物對(duì)，序列2n為下游引物，序列2n-1為上游引物，n為1-24中的一個(gè)自然數(shù)。鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物中的成套引物1和成套引物2均獨(dú)立包裝，成套引物1中的各單鏈DNA均獨(dú)立包裝，成套引物2中的各單鏈DNA均獨(dú)立包裝。表1、鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物實(shí)施例2、利用鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物進(jìn)行番茄品種真實(shí)性鑒定(1)構(gòu)建圖譜的番茄材料由北京農(nóng)林科學(xué)院蔬菜中心李常保老師提供，從402份材料中，隨機(jī)選取100份品種材料(表2)。所選雜交種如表3所示。表2、100份供試番茄品種表3、12份代表性番茄雜交品種材料品種名稱類別特征性狀備注京番104大粉粉色超大果類雜交種京番203大粉粉色中大果類雜交種京番501大紅紅色中大果類雜交種京番601大紅紅色大果類雜交種京番701大黃黃色大果類雜交種京番彩星1號(hào)小彩黑彩色短橢圓櫻桃類雜交種京番紅羅1號(hào)小紅紅色羅曼型櫻桃類雜交種京番黃星1號(hào)小黃黃色長(zhǎng)橢圓櫻桃類雜交種京番綠星1號(hào)小綠綠色正圓型櫻桃類雜交種京番紫星1號(hào)小紫紫色正圓櫻桃類雜交種京番相思豆小紅紅色迷你超小果櫻桃類雜交種京番中彩1綠彩綠彩條紋中等果類雜交種(2)提取供試番茄品種的DNA采用CTAB法提取供試品種的DNA：取番茄幼葉20mg～30mg至2.0mL離心管中，研磨機(jī)中研磨10min；加入750μL預(yù)熱的CTAB提取液后，充分搖勻，65℃水浴45min；加入750μL氯仿，上下混勻3min，12000g離心5min；吸取500μL上清液至另一只2.0mL離心管中，加入0.7倍體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒離心管數(shù)次，12000g離心10min，棄上清液；加入75％乙醇漂洗2次，離心后棄上清液，自然風(fēng)干；加入100μL1.0×TE緩沖液，充分溶解后得到供試番茄品種DNA，4℃保存?zhèn)溆?。其中，CTAB提取液的配制方法為：稱取20gCTAB和81.816gNaCl溶于適量水中，然后加入1mol/LTris-HCl(pH＝8.0)100mL，0.5mol/LEDTA溶液(pH＝8.0)40mL，定容至1000mL，在103.4kPa(121℃)條件下滅菌20min。于4℃貯存。(3)PCR擴(kuò)增用實(shí)施例1的成套引物1中的每對(duì)引物分別對(duì)供試番茄品種DNA進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，每個(gè)引物對(duì)的PCR擴(kuò)增均采用如下10μL的反應(yīng)體系：2×TaqPCRMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為CW0718M)5μL，上下游引物各0.04μL(上下游引物在反應(yīng)體系中的濃度均為10pM)，濃度為50ng/μL的供試番茄品種DNA1μL，補(bǔ)水到終體積為10μL。每個(gè)引物對(duì)的PCR擴(kuò)增的條件均為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。(4)PCR產(chǎn)物檢測(cè)：每種供試番茄品種DNA的PCR產(chǎn)物均按照如下方法經(jīng)ABI3730xlDNA分析儀進(jìn)行檢測(cè)：首先將6-FAM(藍(lán)色)和VIC(綠色)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋30倍，NED(黑色)和PET(紅色)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋10倍；分別取等體積的上述4種稀釋后溶液混合形成混合液；吸取1μL混合液加入到ABI3730xlDNA分析儀專用96深孔板孔中。板中各孔分別加入0.1μLLIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出后立即置于冰上，冷卻10min以上。瞬時(shí)離心10s后置放到ABI3730xlDNA分析儀上進(jìn)行電泳，用GENEMAPPER進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)采集。(5)數(shù)據(jù)記錄：將每一位點(diǎn)的待測(cè)樣品間的擴(kuò)增片段的帶型(即PCR產(chǎn)物電泳條帶數(shù)目)和移動(dòng)位置(即PCR產(chǎn)物電泳條帶大小)進(jìn)行比較，確定待測(cè)樣品該位點(diǎn)的等位變異大小，純合位點(diǎn)的等位變異記錄為X/X，雜合位點(diǎn)的等位變異記錄為X/Y，其中X，Y分別為該位點(diǎn)上兩個(gè)等位變異，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后；缺失位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)記錄為0/0；多個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)整合在一起形成不同番茄品種的SSR指紋圖譜庫(kù)。將成套引物1替換為成套引物2，按照步驟(3)-(5)的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增、檢測(cè)及數(shù)據(jù)記錄，最終得到的本發(fā)明的100份番茄品種的SSR指紋數(shù)據(jù)如表4所示。表4、100份番茄品種的指紋數(shù)據(jù)(1)表4、100份番茄品種的指紋數(shù)據(jù)(2)表4、100份番茄品種的指紋數(shù)據(jù)(3)表4、100份番茄品種的指紋數(shù)據(jù)(4)表4、100份番茄品種的指紋數(shù)據(jù)(5)注：表4的100份番茄品種的指紋數(shù)據(jù)(1)-(5)中，SSR19、SSR120、SSR305、SSR18、SSR132、SSR3、SSR110、SSR146、SSR125、SSR117、SSR101、SSR218、SSR225、SSR97、SSR185、SSR233、SSR184、SSR254、SSR318、SSR272、SSR68、SSR169、SSR13、SSR96、SSR190、SSR303、SSR302、SSR148、SSR304、SSR45、SSR24、SSR76、SSR306、SSR308、SSR201、SSR23、SSR126、SSR312、SSR224、SSR313、SSR239、SSR315、SSR69、SSR266、SSR317、SSR283、SSR321和SSR300分別表示Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13、Sol_SSR96、Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300。依據(jù)鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物中的48對(duì)核心SSR引物PCR產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果確定待測(cè)番茄是否為同一品種：當(dāng)兩個(gè)番茄樣品的各個(gè)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物的差異個(gè)數(shù)(位點(diǎn)數(shù))≥2，判定這兩個(gè)樣品為“不同品種”；當(dāng)兩個(gè)番茄樣品的各個(gè)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物的差異個(gè)數(shù)(位點(diǎn)數(shù))＝1，判定這兩個(gè)樣品為“近似品種”；當(dāng)兩個(gè)番茄樣品的各個(gè)位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物的差異個(gè)數(shù)(位點(diǎn)數(shù))＝0，判定這兩個(gè)樣品為“極近似或相同品種”。在利用鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物鑒定番茄品種真實(shí)性時(shí)，可先利用成套引物1進(jìn)行鑒定，并按照上述確定待測(cè)番茄是否為同一品種的方法確定待測(cè)番茄樣品是否為同一品種；在利用成套引物1鑒定的結(jié)果為“近似品種”或“極近似或相同品種”時(shí)，再利用成套引物2進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，并按照上述確定待測(cè)番茄是否為同一品種的方法最終確定待測(cè)番茄樣品是否為同一品種。在僅利用成套引物1進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，利用成套引物1得到的結(jié)果即為最后結(jié)果，在先后利用成套引物1和成套引物2進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，利用成套引物2得到的結(jié)果即為最終結(jié)果。結(jié)果分析：通過(guò)以上檢測(cè)，獲得100份番茄品種的指紋數(shù)據(jù)，進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，每?jī)蓚€(gè)品種間的差異位點(diǎn)數(shù)都大于2，說(shuō)明鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性的成套引物可以有效的把這些番茄品種鑒別開(表4)；利用NTSYS軟件進(jìn)行品種聚類，分析品種間的遺傳關(guān)系，從圖中可以看出可以把這100份番茄品種全部區(qū)別開(圖1)。實(shí)施例3、利用鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物對(duì)番茄雜交種子的純度進(jìn)行鑒定實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體步驟如下：(1)樣品從送檢的JF101番茄品種(北京市農(nóng)林科學(xué)院)的種子中隨機(jī)選取100-200粒番茄種子進(jìn)行培育，獲得不少于94個(gè)番茄單株，連同以及該品種的父本與母本Y15-013\Y15-049(父本與母本作為對(duì)照樣品，北京市農(nóng)林科學(xué)院)植株，共獲得96個(gè)樣品。(2)提取供試番茄品種的DNA：采用CTAB法提取上述96個(gè)樣品的DNA，具體提取方法同實(shí)施例2步驟(2)。(3)PCR擴(kuò)增用實(shí)施例1的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物對(duì)步驟(2)得到的96份DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系與條件均同實(shí)施例2步驟(3)。(4)PCR產(chǎn)物檢測(cè)每種DNA的PCR產(chǎn)物均按照如下方法經(jīng)ABI3730xlDNA分析儀進(jìn)行檢測(cè)：首先將6-FAM(藍(lán)色)和VIC(綠色)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋30倍，NED(黑色)和PET(紅色)熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋10倍；分別取等體積的上述4種稀釋后溶液混合形成混合液；吸取1μL混合液加入到ABI3730xlDNA分析儀專用96深孔板孔中。板中各孔分別加入0.1μLLIZ500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，取出后立即置于冰上，冷卻10min以上。瞬時(shí)離心10s后置放到ABI3730xlDNA分析儀上進(jìn)行電泳，用GENEMAPPER進(jìn)行圖像分析及數(shù)據(jù)采集。(5)數(shù)據(jù)記錄：將每一位點(diǎn)待測(cè)樣品和父本(P1)與母本(P2)擴(kuò)增片段的帶型(即PCR產(chǎn)物電泳條帶數(shù)目)和移動(dòng)位置(即PCR產(chǎn)物電泳條帶大小)進(jìn)行比較，根據(jù)父本與母本的移動(dòng)位置和擴(kuò)增片段大小，確定待測(cè)樣品該位點(diǎn)的等位變異大小，純合位點(diǎn)的等位變異記錄為X/X，雜合位點(diǎn)的等位變異記錄為X/Y，其中X，Y分別為該位點(diǎn)上兩個(gè)等位變異，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后；缺失位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)記錄為0/0。其中Sol_SSR3、Sol_SSR266和Sol_SSR218的結(jié)果如表5所示。表5、番茄種子的指紋數(shù)據(jù)指紋數(shù)據(jù)中與其他種子不一致的種子即為雜種子，利用Sol_SSR3得到的雜種子數(shù)目為0，即利用該引物對(duì)得到的種子純度為100％，利用Sol_SSR266得到的雜種子數(shù)目為0，即利用該引物對(duì)得到的種子純度為100％，利用Sol_SSR218得到的雜種子數(shù)目為1，即利用該引物對(duì)得到的種子純度為1/94×100％＝98.9％。其余45對(duì)引物的結(jié)果顯示待測(cè)的94粒種子均為父本與母本Y15-013\Y15-049的后代，即純度為100％。(6)數(shù)據(jù)計(jì)算：利用公式1與公式2計(jì)算種子純度：種子純度p＝(NT-ND)/NT×100％(公式1)，其中p表示利用一對(duì)番茄SSR引物對(duì)得到的種子純度，番茄SSR引物對(duì)為實(shí)施例1的鑒定或輔助鑒定番茄品種真實(shí)性和種子純度的成套引物中的引物對(duì)，NT表示供檢種子數(shù)目，ND表示利用一對(duì)番茄SSR引物對(duì)得到的雜種子數(shù)目；種子純度P＝利用所用的所述番茄SSR引物對(duì)得到的種子純度之和/n(公式2)，其中n表示所用的所述番茄SSR引物對(duì)數(shù)目。根據(jù)公式1與公式2計(jì)算該待測(cè)番茄種子的種子純度為P＝(100％×47+98.9％)/48＝99.98％。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3