本發(fā)明涉及法醫(yī)學
技術領域：
，具體涉及DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板。
背景技術：
：人類有22對常染色體和1對性染色體，性染色體上存在著眾多的多態(tài)性DNA遺傳標記，在某些特殊案件(如性侵犯罪及部分親緣關系鑒定)中，性染色體遺傳標記分析具有重要價值。Y染色體的STR基因座是Y-DNA重要遺傳標記之一。由于Y染色體為連鎖遺傳，呈單倍型，除擬常染色區(qū)外，在減數(shù)分類時不與其他染色體發(fā)生重組，因此單個樣本在大多數(shù)的Y-STR基因座只檢出1個等位基因。然而，有少數(shù)Y-STR基因座可檢出多個等位基因，例如DYS389基因座、DYS385基因座、DYS527基因座等。其中DYS389基因座是Y-STR中最常用基因座之一，多數(shù)市售成品化試劑盒中均含有該基因座，因此制備DYS389基因座的等位基因分型標準物具有重要的應用價值。等位基因分型標準物是指某一STR基因座在人群中常見的等位基因的混合物。等位基因分型標準物對于STR基因座的精確分型十分重要，能夠?qū)Σ煌瑢嶒炇乙驗閮x器和檢測條件不同而對同一等位基因檢測出不同大小的片段進行校正，是STR基因座分型的標準。DYS389基因座的重復結(jié)構比較復雜，依次包含區(qū)段一、連接序列和區(qū)段二，其中連接序列的大小為48bp。區(qū)段一的5’端和區(qū)段二的5’端均有一段相同的序列，所以采用一個引物對即可PCR擴增出兩個長度不同的DNA片段，從而將DYS389基因座分成DYS389I和DYS389II兩個基因座(見圖1，記載與如下文獻中：JohnM.Butler，AdvancedTopicsinForensicDNATyping:Methodology.AcademicPress.2011.)。制備等位基因分型標準物，需要篩選含有不同等位基因分型的血卡樣本，而DYS389基因座上兩擴增片段的長度不同且二者存在包含關系，以及不同血卡樣本的差異使得擴增后隨機出現(xiàn)兩個不同峰高的擴增片段，難以根據(jù)兩擴增片段的峰高調(diào)平，不能滿足等位基因分型標準物平整度的要求。因此，迫切需要制備DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是如何制備DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板。所述DYS389基因座可分成DYS389I和DYS389II兩個基因座。為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了一種DNA組合物，該DNA組合物可作為DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板，所述DNA組合物可含有DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4、DNA片段5、DNA片段6、DNA片段7、DNA片段8、DNA片段9、DNA片段10、DNA片段11、DNA片段12、DNA片段13、DNA片段14、DNA片段15、DNA片段16和DNA片段17。所述DNA片段1的核苷酸序列可如序列表中的序列1所示。所述DNA片段2的核苷酸序列可如序列表中的序列2所示。所述DNA片段3的核苷酸序列可如序列表中的序列3所示。所述DNA片段4的核苷酸序列可如序列表中的序列4所示。所述DNA片段5的核苷酸序列可如序列表中的序列5所示。所述DNA片段6的核苷酸序列可如序列表中的序列6所示。所述DNA片段7的核苷酸序列可如序列表中的序列7所示。所述DNA片段8的核苷酸序列可如序列表中的序列8所示。所述DNA片段9的核苷酸序列可如序列表中的序列9所示。所述DNA片段10的核苷酸序列可如序列表中的序列10所示。所述DNA片段11的核苷酸序列可如序列表中的序列11所示。所述DNA片段12的核苷酸序列可如序列表中的序列12所示。所述DNA片段13的核苷酸序列可如序列表中的序列13所示。所述DNA片段14的核苷酸序列可如序列表中的序列14所示。所述DNA片段15的核苷酸序列可如序列表中的序列15所示。所述DNA片段16的核苷酸序列可如序列表中的序列16所示。所述DNA片段17的核苷酸序列可如序列表中的序列17所示。所述DNA組合物具體可由所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17組成。所述DNA組合物中，所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17的質(zhì)量比可為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述DNA組合物中，所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17的質(zhì)量比具體可為1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了重組質(zhì)粒組合物，所述重組質(zhì)粒組合物也可作為DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板。本發(fā)明所提供的重組質(zhì)粒組合物，具體可為重組質(zhì)粒組合物1，其可包括重組質(zhì)粒組合物甲和重組質(zhì)粒組合物乙。所述重組質(zhì)粒組合物甲可通過如下方法制備的：將所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5和所述DNA片段6分別插入到6個載體中，得到6個重組載體；將所述6個重組載體混合，得到重組質(zhì)粒組合物甲。所述重組質(zhì)粒組合物乙是通過如下方法制備的：將所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17分別插入到11個載體中，得到11個重組載體；將所述11個重組載體混合，得到重組質(zhì)粒組合物乙。所述重組質(zhì)粒組合物1中，所述6個重組載體的質(zhì)量比可為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述重組質(zhì)粒組合物1中，所述6個重組載體的質(zhì)量比可為1：1：1：1：1：1。所述重組質(zhì)粒組合物1中，所述11個重組載體的質(zhì)量比可為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述重組質(zhì)粒組合物1中，所述11個重組載體的質(zhì)量比可為1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。本發(fā)明所提供的重組質(zhì)粒組合物，具體可為重組質(zhì)粒組合物2。所述重組質(zhì)粒組合物2是通過如下方法制備的：將所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17分別插入到17個載體中，得到17個重組載體；將所述17個重組載體組合，得到重組質(zhì)粒組合物2。所述重組質(zhì)粒組合物2中，所述17個重組載體的質(zhì)量比可為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述重組質(zhì)粒組合物2中，所述17個重組載體的質(zhì)量比可為1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。上述重組質(zhì)?；旌衔镏校鯠NA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17可以分別插入到同一個載體中，也可以分別插入到不同的載體中。進一步，可以插入到載體的相同位置，也可以分別插入載體的不同位置。所述載體為克隆載體。所述克隆載體可為T載體。所述T載體具體可為質(zhì)粒pMD18-T。所述重組載體具體可為將質(zhì)粒pMD18-T和DNA片段(所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16或所述DNA片段17)連接，得到重組載體。上述任一所述的DNA組合物或上述任一所述的重組質(zhì)粒組合物在a1)或a2)或a3)中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：a1)作為DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板；a2)制備DYS389基因座的等位基因分型標準物；a3)檢測DYS389基因座的等位基因分型。上述a2)中，制備DYS389基因座的等位基因分型標準物的步驟可為：以上述任一所述的DNA組合物或上述任一所述的重組質(zhì)粒組合物為模板，以5’-FAM-CTTCTGTATCCAACTCTCATCTG-3’和5’-GTTGAGGAACACAATTATCCCTGA-3’為引物進行PCR擴增，得到的PCR擴增產(chǎn)物即為DYS389基因座的等位基因分型標準物。上述a3)中，檢測DYS389基因座的等位基因分型的步驟具體可如下：(1)以上述任一所述的DNA組合物或上述任一所述的重組質(zhì)粒組合物為模板，以5’-FAM-CTTCTGTATCCAACTCTCATCTG-3’和5’-GTTGAGGAACACAATTATCCCTGA-3’為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；(2)完成步驟(1)后，向去離子甲酰胺中加入所述PCR擴增產(chǎn)物和內(nèi)標，然后用去離子甲酰胺定容，得到反應液；(3)完成步驟(2)后，取所述反應液進行變性，然后用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，得到DNA檢測圖譜。所述步驟(2)中，所述內(nèi)標可為公安部物證鑒定中心生產(chǎn)的Typer500內(nèi)標。所述步驟(3)中，所述“變性”的反應程序為：先95℃5min，然后迅速轉(zhuǎn)移至-20℃放置5min。上文中，所述DYS389基因座可分成DYS389I和DYS389II兩個基因座。上文中，所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17均含有連接序列2：5’-TCTCTTACTATCATGCCATCCTTAAGATTCTTTTCTGTAACTCATAAT-3’。所述連接序列2的核苷酸排列方式對制備DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板、制備DYS389基因座的等位基因分型標準物或檢測DYS389基因座的等位基因分型具有重要的意義。本發(fā)明將DYS389基因座內(nèi)區(qū)段一和區(qū)段二之間的連接序列1：5’-TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA-3’優(yōu)化為所述連接序列2，然后分別合成DYS389I和DYS389II的各等位基因，調(diào)整各等位基因的加入量，從而保證DYS389基因座等位基因分型標準物中各等位基因的量的平衡。實驗證明，利用本發(fā)明提供的模板可擴增獲得DYS389基因座的等位基因分型標準物，并可在多種商業(yè)試劑盒中使用，具有重要的應用價值。附圖說明圖1為DYS389I和DYS389II基因座示意圖。圖2實施例1步驟三混合液甲和混合液乙的DNA檢測圖譜。圖3為實施例1步驟三9948人類基因組DNA的DNA檢測圖譜。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。Nanodrop1000微量分光光度計為AppliedBiosystems產(chǎn)品。9948人類基因組DNA為Promaga公司產(chǎn)品。質(zhì)粒pMD18-T為TaKaRa公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為6011。內(nèi)標為Typer500內(nèi)標，公安部物證鑒定中心產(chǎn)品。去離子甲酰胺為ABI公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為4311320。ABI3130xl遺傳分析儀為ABI公司產(chǎn)品。實施例1、DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板的制備和驗證一、重組質(zhì)粒的獲得1、連接序列的優(yōu)化hg19人類基因組(hg19人類基因組的信息見網(wǎng)址http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/hg19.2bit)內(nèi)，DYS389基因座中含有連接序列1所示的DNA片段，連接序列1：5’-TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA-3’。經(jīng)過大量實驗，將連接序列1優(yōu)化為連接序列2：5’-TCTCTTACTATCATGCCATCCTTAAGATTCTTTTCTGTAACTCATAAT-3’。經(jīng)軟件OligoAnalyzer3.1評估，連接序列1和連接序列2的基本特征見表1。表1堿基數(shù)目(bp)GC含量(％)解鏈溫度(℃)連接序列14831.260.4連接序列24831.261.52、重組質(zhì)粒的獲得(1)人工合成DNA片段1－DNA片段6，DNA片段1－DNA片段6的核苷酸序列依次為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6所示。(2)根據(jù)步驟1優(yōu)化的連接序列2的核苷酸序列，人工合成DNA片段7－DNA片段17。DNA片段7－DNA片段17的核苷酸序列依次為序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16和序列17所示。(3)制備表2所示的17個重組質(zhì)粒，包含DYS389I基因座以及DYS389II基因座，共17個等位基因。根據(jù)測序結(jié)果，各重組質(zhì)粒的詳細信息如下：重組質(zhì)粒DYS389I-10：將DNA片段1和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-10；DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列1所示；重組質(zhì)粒DYS389I-11：將DNA片段2和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-11；DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列2所示；重組質(zhì)粒DYS389I-12：將DNA片段3和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-12；DNA片段3的核苷酸序列如序列表中序列3所示；重組質(zhì)粒DYS389I-13：將DNA片段4和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-13；DNA片段4的核苷酸序列如序列表中序列4所示；重組質(zhì)粒DYS389I-14：將DNA片段5和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-14；DNA片段5的核苷酸序列如序列表中序列5所示；重組質(zhì)粒DYS389I-15：將DNA片段6和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-15；DNA片段6的核苷酸序列如序列表中序列6所示；重組質(zhì)粒DYS389II-24：將DNA片段7和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-24；DNA片段7的核苷酸序列如序列表中序列7所示；重組質(zhì)粒DYS389II-25：將DNA片段8和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-25；DNA片段8的核苷酸序列如序列表中序列8所示；重組質(zhì)粒DYS389II-26：將DNA片段9和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-26；DNA片段9的核苷酸序列如序列表中序列9所示；重組質(zhì)粒DYS389II-27：將DNA片段10和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-27；DNA片段10的核苷酸序列如序列表中序列10所示；重組質(zhì)粒DYS389II-28：將DNA片段11和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-28；DNA片段11的核苷酸序列如序列表中序列11所示；重組質(zhì)粒DYS389II-29：將DNA片段12和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389I-29；DNA片段12的核苷酸序列如序列表中序列12所示；重組質(zhì)粒DYS389II-30：將DNA片段13和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389II-30；DNA片段13的核苷酸序列如序列表中序列13所示；重組質(zhì)粒DYS389II-31：將DNA片段14和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389II-31；DNA片段14的核苷酸序列如序列表中序列14所示；重組質(zhì)粒DYS389II-32：將DNA片段15和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389II-32；DNA片段15的核苷酸序列如序列表中序列15所示；重組質(zhì)粒DYS389II-33：將DNA片段16和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389II-33；DNA片段16的核苷酸序列如序列表中序列17所示；重組質(zhì)粒DYS389II-34：將DNA片段17和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒DYS389II-34；DNA片段17的核苷酸序列如序列表中序列17所示。表2編號基因座基因型重組質(zhì)粒名稱編號基因座基因型重組質(zhì)粒名稱1DYS389I10重組質(zhì)粒DYS389I-109DYS389II26重組質(zhì)粒DYS389II-262DYS389I11重組質(zhì)粒DYS389I-1110DYS389II27重組質(zhì)粒DYS389II-273DYS389I12重組質(zhì)粒DYS389I-1211DYS389II28重組質(zhì)粒DYS389II-284DYS389I13重組質(zhì)粒DYS389I-1312DYS389II29重組質(zhì)粒DYS389II-295DYS389I14重組質(zhì)粒DYS389I-1413DYS389II30重組質(zhì)粒DYS389II-306DYS389I15重組質(zhì)粒DYS389I-1514DYS389II31重組質(zhì)粒DYS389II-317DYS389II24重組質(zhì)粒DYS389II-2415DYS389II32重組質(zhì)粒DYS389II-328DYS389II25重組質(zhì)粒DYS389II-2516DYS389II33重組質(zhì)粒DYS389II-3317DYS389II34重組質(zhì)粒DYS389II-34二、DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板制備1、利用Nanodrop1000微量分光光度計分別測量并稀釋步驟一中獲得的重組質(zhì)粒DNA的濃度至1ng/μL，獲得各質(zhì)粒的稀釋液。2、完成步驟1后，取重組質(zhì)粒DYS389I-10的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389I-11的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389I-12的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389I-13的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389I-14的稀釋液和重組質(zhì)粒DYS389I-15的稀釋液各1μL，混合，然后用超純水定容至1mL，得到混合液甲?；旌弦杭字校襟E一中DYS389I基因座的各個等位基因的DNA濃度均為1pg/μL。3、完成步驟1后，取重組質(zhì)粒DYS389II-24的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-25的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-26的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-27的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-28的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-29的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-30的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-31的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-32的稀釋液、重組質(zhì)粒DYS389II-33的稀釋液和重組質(zhì)粒DYS389II-34的稀釋液各1μL，混合，然后用超純水定容至1mL，得到混合液乙?；旌弦阂抑?，步驟一中DYS389II基因座的各個等位基因的DNA濃度均為1pg/μL。DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板由混合液甲和混合液乙組成。三、DYS389基因座的等位基因分型標準物的驗證(1)以步驟二制備的混合液甲為DNA模板，以5’-FAM-CTTCTGTATCCAACTCTCATCTG-3’(5’末端進行FAM修飾)和5’-GTTGAGGAACACAATTATCCCTGA-3’為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。(2)完成步驟(1)后，向去離子甲酰胺中加入1μLPCR擴增產(chǎn)物和0.2μL內(nèi)標，然后用去離子甲酰胺定容至20μL，得到反應液。(3)完成步驟(2)后，取反應液，95℃變性5min，迅速轉(zhuǎn)移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，得到DNA檢測圖譜。電泳條件為：進樣電壓2kV，進樣時間為18s。按照上述步驟，將步驟(1)中的混合液甲替換為混合液乙，其它步驟均不變，得到相應的DNA檢測圖譜。按照上述步驟，將步驟(1)中的混合液甲替換為9948人類基因組DNA，其它步驟均不變，得到相應的DNA檢測圖譜。實驗結(jié)果見圖2和圖3(圖2中A為混合液甲，圖2中B為混合液乙，圖3為9948人類基因組DNA)。上述實驗結(jié)果表明，DYS389基因座內(nèi)各等位基因分型完整、正確，峰型尖銳清晰，無雜峰，等位基因間峰高差異小于20％，均衡性良好；9948人類基因組DNA的結(jié)果表明，經(jīng)過等位基因分型標準物校準后分型結(jié)果正確、峰型良好、無雜峰，能夠保證法醫(yī)DNA分析結(jié)果的有效性和可靠性，同時確保實驗室DNA分析結(jié)果的可比性和一致性。上述結(jié)果表明，使用步驟二制備的DYS389基因座的等位基因分型標準物的模板可進行DYS389基因座的等位基因分型檢測。當前第1頁1 2 3