專利名稱：一種檢測cyp3a4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體外核酸檢測領域，具體涉及一種檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒。
背景技術：
CYP3A4基因的全稱叫做細胞色素P450同工酶3A4，細胞色素P450 (CytochromeP450, CYP450)是一組含有亞鐵血紅素蛋白酶系，又稱混合功能單加氧酶系統(tǒng)。它主要存在于人類肝臟，對外源物處置以及內源物代謝起重要作用。已發(fā)現與藥物代謝密切相關的CYP450主要有CYPl 4，其中以CYP3A4亞族最為重要，占人肝臟CYP450總量的30%，主要成員包括CYP3A3、3A4、3A5和3A7，成人肝臟中以3A4為主。CYP3A4參與的藥物代謝的種類很多，臨床上50%以上的藥物代謝都是通過CYP3A4,主要有多西他賽(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、依托泊苷(etoposide)、伊立替康(irino-tecan)、伊馬替尼(imatinib)、長春瑞賓(vinorelbine)、長春堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine )等等。編碼CYP3A4蛋白的CYP3A4基因位于染色體7q21.3 22. 1，它包含13個外顯子和12個內含子的編碼區(qū)域，長約27kb。自1998年以來，國外學者陸續(xù)報道CYP3A4基因存在多態(tài)性，根據近幾年中國的研究文獻報道，在中國人群中被普遍關注的是CYP3A4*4基因，在這個基因中存在一個有意義的SNP位點(A13871G，1118V)，這個點突變主要是一個單堿基突變，突變導致118為氨基酸從異亮氨酸變?yōu)轭R氨酸。這個改變使得代謝酶的活性降低，減弱了個體對依托泊苷/替尼泊苷藥物代謝能力，增強其毒副作用。根據衛(wèi)生部最新的《醫(yī)療檢測項目服務管理規(guī)范》中，在個體化醫(yī)療項目中，就明確提到了檢測CYP3A4的意義。目前醫(yī)院用于CYP3A4*4基因分型檢測的“金標準”是PCR-直接測序法，但直接測序法的敏感性不高，只能檢測出突變細胞比率在10-20%以上的腫瘤組織，對于含〈10%突變細胞的腫瘤組織以及外周血，常規(guī)PCR+直接測序法幾乎無能為力。相比于直接測序法，焦磷酸測序的靈敏性更高、成本更低。焦磷酸測序(Pyrosequencing)是一種基于聚合原理的DNA測序(確定DNA中核苷酸的順序)方法，是新一代DNA序列分析技術。它是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發(fā)光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP,繼續(xù)DNA鏈的合成。通過分析出峰情況，達到測定DNA序列的目的。目前市場上還沒有利用焦磷酸技術進行CYP3A4*4的基因多態(tài)性檢測的產品。

發(fā)明內容
本發(fā)明旨在克服現有技術的不足，提供一種特異性高、成本低、定量、準確檢測CYP3A4*4的基因分型的試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為
所述檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒中包括如下引物
正向擴增引物5’ -GTCCAGTGGGATTTATGAAAAGTG-3’ (SEQ ID NO. I)；
反向擴增引物:5，-TTCCATTCTTCATCCTCAGCTATA-3’ (SEQ ID NO. 2)；
測序引物5’ -TTCATCCTCAGCTATAGAGA-3’ (SEQ ID NO. 3)；
其中，正向擴增引物或反向擴增引物中的任意一條引物的5’端進行生物素標記。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。
進一步地，所述試劑盒中還包括質控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 4) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質控序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所示試劑盒中還包括由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，以及由5’ -磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物。進一步地,所述試劑盒中還包括尿喃唳DNA糖基化酶、Taq聚合酶。與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為
1)本發(fā)明提供的定量檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優(yōu)點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應，直接給出檢測位點頻率分析，結果直觀；
2)本發(fā)明提供的定量檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性
聞;
3)本發(fā)明提供的定量檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；
4)本發(fā)明提供的定量檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；
5)本發(fā)明提供的定量檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。由于設計了靈敏度高，特異性好的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒能夠對CYP3A4*4基因分型進行快速檢測。本發(fā)明的試劑盒可實時監(jiān)測反應進程，反應時間短，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，高通量，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。


圖I為臨床CYP3A4*4野生型的焦磷酸測序結果 圖2為臨床CYP3A4*4突變型的焦磷酸測序結果 圖3為臨床質控品control oligo的焦磷酸測序結果 圖4為臨床空白對照的焦磷酸測序結果 圖5為多組設計引物的凝膠電泳圖；圖中①、②表明非特異性條帶，③表明特異性和片段大小均比較合適，④表明目的帶片段大小不對。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例I :試劑盒的制備
1.引物和探針的設計與合成
研究表明目前針對CYP3A4*4基因突變主要集中在13871號堿基中，選擇特異的突變位點(表1)，使用PyroMark Assay Design2. O軟件,設計并確定了引物(表2),試劑盒中最主要的影響試劑盒的準確性的就是引物，包括擴增引物和測序引物，在設計的初期，我們設計了多組引物進行比較(見圖5);其中擴增引物和測序引物先經過PAGE純化，再經HPLC純化，其中SEQ ID NO. I所示正向擴增引物的5’端為生物素標記。表I突變位點與類型·
權利要求
1.一種檢測CYP3A4*4基因分型的焦磷酸測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的擴增引物，以及如SEQ ID NO. 3所示的測序引物；其中，擴增引物中的任意一條引物的5’端進行生物素標記。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括如SEQID NO. 4所示的質控品和空白對照品。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述空白對照品為水。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所示試劑盒中還包括由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，以及由5’ -磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測CYP3A4*4基因型的試劑盒，屬于體外核酸檢測領域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR擴增引物以及測序引物；本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。
文檔編號C12Q1/68GK102719555SQ201210250210
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權日2012年7月19日
發(fā)明者韓勇 申請人:韓勇