專利名稱：抗豬圓環(huán)病毒2型的雙峰駝重鏈單域抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種抗體及其制備方法和用途，特別涉及以ー種抗PCV2型的雙峰駝單域重鏈抗體。此外，還涉及到該抗體的制備方法、功能鑒定和用途。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒病是近些年來流行的一種豬的病毒性傳染病，病原為豬圓環(huán)病毒2型(PCV2XPCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥的主要病原，并且還與豬繁殖障礙、豬呼吸道病綜合癥、豬皮炎與腎炎綜合癥、豬增生性壞死性肺炎、先天性振顫等疾病發(fā)生有夫。豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，該病毒無囊膜，是單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒。根據(jù)其致病性、抗原性及核苷酸序列將PCV分為PCVl和PCV2兩個血清型。PCV2為致病病原，目前沒有PCVl致病的報道。PCV2編碼有11個開放閱讀框0RF，由開放閱讀框0RF2編碼的CAP蛋白為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，還具有型特異性的表位。血清學(xué)調(diào)查表明，豬圓環(huán)病毒在世界上流行的范圍很廣，主要以混合感染和隱性感染為流行特點(diǎn)，豬群中存在大量病毒攜帯者，表現(xiàn)為血清抗體陽性的亞臨床癥狀。我國自有圓環(huán)病毒感染的報道以來，很多地區(qū)都有發(fā)病的報道，流行不斷加劇。PCV2感染會引起機(jī)體的免疫抑制，這就為其它病原的感染提供了便利。豬圓環(huán)病毒病已經(jīng)成為威脅養(yǎng)豬業(yè)的又一大傳染病。面對如此嚴(yán)峻的疫病形式，建立快速、敏感、特異的診斷方法進(jìn)行及時的診斷顯得尤為重要。重鏈抗體(HCAbs)是發(fā)現(xiàn)于駱駝和軟骨魚等體內(nèi)的ー種天然缺失輕鏈，僅有重鏈的饑體(Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, . et al. Naturally occurringantibodies devoid of light chains [J] Nature, 1993，363:446-448.)。這類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈可變區(qū)單域結(jié)構(gòu)域組成，稱為單域重鏈抗體(variable domain oftheheavy chain of HCAbs, VHH)D由于天然缺失輕鏈，單域重鏈抗體靠僅有的3個互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)就具備了特異的抗原結(jié)合能力及高親和力，而普通抗體則需要6個CDRs才具備與抗原結(jié)合的能力。VHH是目前可以得到的具有完整功能的最小抗體分子片段，分子量僅15kD，是常規(guī)抗體的1/10，單克隆抗體的1/3，其晶體結(jié)構(gòu)為直徑2. 5nm，長4nm的圓柱體，有人也稱其為納米抗體(Nanobody)。VHH的抗原結(jié)合環(huán)的結(jié)構(gòu)組成比普通抗體VH更大，⑶R3區(qū)也更長，能夠形成更多的新結(jié)構(gòu)，因而能補(bǔ)償抗原結(jié)合位點(diǎn)VL的缺乏。并且，VHH具有易表達(dá)、水溶性好、耐高溫、耐極度pH值等獨(dú)特性質(zhì)。作為ー種小分子抗體，VHH抗體有其獨(dú)特的應(yīng)用潛力?？蓱?yīng)用在制備膚類藥物、制備體內(nèi)顯影劑、構(gòu)建免疫融合物、構(gòu)建多價及多功能抗體、制備親和純化材料、作為細(xì)胞內(nèi)抗體藥物以及用于基礎(chǔ)研究當(dāng)中?？贵w做為檢測試劑的核心部分，其特異性及親和カ決定了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。目前，已有大量關(guān)于利用高特異性、高親和カ的單域重鏈抗體建立檢測方法的又獻(xiàn)報道。Deckers 等(Deckers, N. , D. Saerens, et al. Nanobodies a promisingtool for species-specific diagnosis of Taenia solium cysticercosis. [J]int Jparasitol, 2009, 39(5) :625-633.)采用單域重鏈抗體建立了檢測豬帶絳蟲囊尾蝴的ELISA檢測方法，具有良好的特異性。Perruchini 等(Perruchini, C. , F. Pecorari, et al. LlamaV(H)H antibody fragments against GFAP:better diffusion in fixed tissues thanclassical monoclonal antibody [J]. Acta Neuropathol, 2009，118 (5) :685-695.)將單域重鏈抗體用于免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)單域重鏈抗體 用于免疫組化實(shí)驗(yàn)中，具有擴(kuò)散的距離長、有利于較厚切片的免疫標(biāo)記和測定等優(yōu)點(diǎn)。利用雙峰駝制備PCV2VHH免疫抗體庫，篩選PCV2特異性的VHH抗體，研制病原快速診斷方法在國內(nèi)外尚無報道。本發(fā)明首次利用PCV2滅活疫苗免疫雙峰駝，利用噬菌體展示技術(shù)建立PCV2VHH免疫抗體庫，篩選具有良好型特異性和抗原親和性的單域抗體，對于建立敏感和特異的PCV2抗體檢測方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種抗豬圓環(huán)病毒2型的雙峰駝單域重鏈抗體；本發(fā)明的目的之ニ是提供編碼所述雙峰駝單域重鏈抗體的核苷酸序列；本發(fā)明的目的之三提供所述的雙峰駝單域重鏈抗體或其編碼序列在制備檢測或診斷PCV2病毒感染試劑中的應(yīng)用。為了達(dá)到所述的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段本發(fā)明使用PCV2滅活疫苗免疫雙峰駝并利用噬菌體展示技術(shù)建立了 PCV2VHH免疫抗體庫，經(jīng)過三次大量連接和轉(zhuǎn)化，隨機(jī)選擇15個克隆進(jìn)行測序，結(jié)果表明，15個克隆的片段均為編碼重鏈抗體的可變區(qū)的基因，計(jì)算得到庫容為I. 12X108的駱駝免疫單域抗體庫，將該抗體庫命名為NAL-PCV2，從中篩選出具有高特異性和抗原結(jié)合能力的單域重鏈抗體(VHH)。本發(fā)明的ー種抗豬圓環(huán)病毒2型的雙峰駝單域重鏈抗體，其特征在于所述的抗體具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a) SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或(b)與SEQ ID NO. I所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的與SEQ ID NO. I所示的序列同源性在95%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。進(jìn)ー步的，本發(fā)明還提供了編碼以上所述的雙峰駝單域重鏈抗體的核苷酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQID NO. 6所示的序列。再進(jìn)ー步的，本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。更進(jìn)一歩的，本發(fā)明還提供了ー種宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為含有以上所述的核苷酸序列的真核或原核細(xì)胞。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞為含有以上所述的表達(dá)載體的真核或原核細(xì)胞。本發(fā)明對得到的編碼所述雙峰駝單域重鏈抗體的基因進(jìn)行了原核表達(dá)和純化，通過結(jié)合力、特異性鑒定以及識別表位鑒定試驗(yàn)，證實(shí)獲得的3株抗體具有很好的PCV2結(jié)合活性，其中2株(clonel和clone4)具有PCV2型特異性,通過抗體疊加實(shí)驗(yàn)證實(shí)3株抗體識別CAP蛋白上的不同表位。獲得的VHH抗體能夠在pH值2. 0的情況下耐受胃蛋白酶消化 30min。 利用有型特異性的2株抗體(clonel和clone4),通過雙抗體夾心ELISA方法,對已知的PCV2陰性和陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明該方法能夠區(qū)分出血清抗體的陰陽性，并且能夠反映出血清中PCV2抗體的含量，具有高敏感性和特異性。結(jié)果表明這2株抗體能夠有效結(jié)合PCV2CAP蛋白，可以應(yīng)用于PCV2血清抗體ELISA檢測方法的建立。因此，最后，本發(fā)明提供了所述的雙峰駝單域重鏈抗體在制備檢測或診斷豬圓環(huán)病毒感染試劑中的應(yīng)用。及所述的雙峰駝單域重鏈抗體在制備檢測或診斷豬圓環(huán)病毒2型感染試劑中的應(yīng)用，其中所述的雙峰駝單域重鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 3所示。及所述的核苷酸序列在制備檢測或診斷豬圓環(huán)病毒感染試劑中的應(yīng)用。及所述的核苷酸序列在制備檢測或診斷豬圓環(huán)病毒2型感染試劑中的應(yīng)用，其中所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6所示。本發(fā)明首次利用PCV2滅活疫苗免疫雙峰駝，利用噬菌體展示技術(shù)建立PCV2VHH免疫抗體庫，篩選出具有良好型特異性和抗原親和性的單域抗體，對于建立敏感和特異的PCV2抗體檢測方法具有重要意義。


圖I為雙峰駝外周血淋巴細(xì)胞RNA提取結(jié)果；I :總 RNA ；M 入 _EcoT14 I digest 標(biāo)準(zhǔn)分子量圖2為VHH基因第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；I. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3為VHH基因第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量圖4為VHH基因第三輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量圖5為雙峰駝PCV2 VHH基因1、3和4號克隆的PCR電泳結(jié)果；M DL2000Marker ；1 clonel 基因；2 clone3 基因；3 clone4 基因
圖6為PCV2VHH抗體的原核表達(dá)；M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(SM0431) ;1，4，6分別為未誘導(dǎo)的對照；2，3，5分別為clone3、clonel、clone4 表達(dá)組；圖7 為 western bloting 鑒定結(jié)果；1，3，5為未誘導(dǎo)的空白對照；2，4，6分別為clonel、clone3、clone4誘導(dǎo)后的總蛋白”為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(SM0431)
圖8為可溶性分析和目的蛋白純化；I, 3, 5 :分別是 clonel clone3 和 clone4 純化結(jié)果;2，4，6 :分別是表達(dá) clonelclone3和clone4菌進(jìn)過超聲波破碎后，收集的上清；M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(SM0431)圖9為PCV2 VHH抗體抗原結(jié)合能力鑒定；Aclonel ；B clone3 ；C clone4注clone+CAP+serum表示包被抗體與衣 殼蛋白和陽性血清依次作用；CAP+serum表示包被的CAP蛋白與血清直接作用作為實(shí)驗(yàn)對照；Sumo+CAP+serum表示包被sumo蛋白與衣殼蛋白和陽性血清依次做用作為對照；clone+serum表示包被抗體與陽性血清直接作用作為對照！Clone+CAP+Negserum表示抗體與衣殼蛋白和PCV2陰性血清作用作為對照；圖10為PCV2 VHH抗體型特異性分析；Aclonel ；B clone3 ；C clone4注Clone PCV2表示抗體與PCV2抗原和陽性血清依次作用；Clone PCVl表示抗體與PCVl抗原和陽性血清依次作用；Clone control表示與PCVl和PCV2雙陰性血清作用；圖11為胃蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)。I :作用 40min, 2 :作用 30min, 3 :作用 20min,4 :作用 IOmin, 5 :胃蛋白酶對照，6 蛋白對照，M :蛋白marker (SMO431)
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例I抗豬圓環(huán)病毒2型的雙峰駝VHH重鏈抗體的制備I.材料與方法I. I 材料I. I. I試驗(yàn)動物、抗原、佐劑I峰雄性雙峰駝(I周歲)，I峰雌性雙峰駝(6月齡)；PCV2滅活疫苗(IngelvaccircoFLEX, Serial NO. 309-211),重組 PCV2VLPs 抗原(Shuanghui Yin, Shiqi Sun, ShunliYang,et al. Self-assembly of virus-1ike particles oi porcine circovirustype 2capsid protein expressed from Escherichia coli[J. ]Virology Journal2010，7:166)。I. I. 2菌株、輔助噬菌體和試劑大腸桿菌TGl和HB2151、輔助噬菌體M13K07、載體pHEN2購自Novagen公司；表達(dá)載體pSMK本所孫世琪博士惠贈；限制性內(nèi)切酶購自NEB ;淋巴細(xì)胞分離液(I. 077)購自上海生エ；Trizol、DNA片段回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為OMEGA產(chǎn)品；鎳親和層析樹脂購自Qiagen ;PCR相關(guān)試劑購自寶生物公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。I. 2 方法I. 2. I免疫方法、抗原接種劑量、免疫程序和血清抗體的測定在雙峰駝的頸部皮下、背部皮下、腹部皮下和后腿皮下進(jìn)行分點(diǎn)接種PCV2滅活疫苗(Ingelvac circoFLEX)。首次免疫前和每次免疫后采集靜脈血，用CAP蛋白ELISA方法檢測抗體產(chǎn)生情況(Shuang-hui YIN, Shun-Ii YANG, Hong TIAN, et al. An ELISA Based on aTruncated Soluble ORF2 Protein for the Detection of PCV2Antibodies in DomesticPigs[J]VIR0L0GICA SINICA, 2010，25 (3) : 191-198.)，第五次免疫后 5 天，靜脈采血 500ml,進(jìn)行下一歩實(shí)驗(yàn)。具體動物免疫程序和抗原接種劑量見表I。表I雙峰駝免疫程序和抗原劑量
免疫次數(shù)首免 ニ免三免四免五免 劑量(ml) I 2 2 34
間隔時間(天)0I2135 49I. 2. 2淋巴細(xì)胞分離最后一次免疫后5天，靜脈采集抗凝血，用比重為I. 077的淋巴細(xì)胞分離液，分離外周血淋巴細(xì)胞，用1640液洗滌分離的淋巴細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，液氮凍存?zhèn)溆?。I. 2. 3細(xì)胞總RNA的提取利用Trizol法抽提分離的淋巴細(xì)胞總RNA。I. 2. 4VHH基因擴(kuò)增，噬菌體展示載體的構(gòu)建和免疫庫的構(gòu)建根據(jù)參考文 獻(xiàn)(Ana Monegal, Diletta Ami, Chiara Martinelli.et al. immunological applications of single-aomam 丄lama recombinantantibodies isolated from a naive library[J]. Protein Engineering design andselection, 2009，22 (4)，273-280.)做適當(dāng)修改設(shè)計(jì)三對引物擴(kuò)增VHH基因片段，引物CH2D位于高度保守的CH2區(qū)序列，HlR位于抗體編碼區(qū)前導(dǎo)序列，H2S和H2SfiI位于可變區(qū)框架I (framework regionl, FRl), H3D 和 H3NotI 位于可變骨架 4 (framework region4, FR4)。引物見表2。表2VHH基因片段擴(kuò)增用引物
擴(kuò)增輪次引物片段(bp)
第一輪擴(kuò)增 HlR 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’兩條片段
CH2D 5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'(9()0,6()0)
丨收600
沁..輪ダ.培 H2S 5!-GCCATGGCTSAKGTBCAGCTGSTGGAGTCTGG-3'450-500
H.3D 5’-GCGGCTGAGGAGACGGTGACCWGG-3’
’免輪擴(kuò)柄 H2‘v;1 5 ATTACTGGCCCAGCCGGCCGGCTGAKGTBCAGCT 450_500
(Sfil)
GGTGG AGTCTGG RGG AGGCT-3'
H3 Noi\ 5 ^ATTATTAGTGCGGCCGCTG AGG AG ACGGTG A CC_WGGGTCC-3. _注劃線部分為引用酶切位點(diǎn)以O(shè)ligo dT為反轉(zhuǎn)錄引物，將提取的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，H1R、CH2D為上下游引物擴(kuò)增得到大小分別為600bp和900bp的2條帶，回收600bp條帶作為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，H2S、H3D為上下游引物得到約大小450bp條帶。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以H2SfiI，H3NotI為上下游引物進(jìn)行第三輪擴(kuò)增，得到約450bp條帶。將第三輪PCR產(chǎn)物經(jīng)過Sfil/Notl雙酶切后，克隆入pHEN2載體，通過電轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl中，電轉(zhuǎn)結(jié)束后，細(xì)胞立即倒入ImL SOC培養(yǎng)液中，37°C、150r/min培養(yǎng)lh，然后菌液以1:100比例后涂布于2YTG平板(2%葡萄糖、Ampr50mg/L,2XYT,2YTG)平板，另取IOul菌液做1000倍稀釋后涂板，37°C過夜培養(yǎng)，用于計(jì)算庫容。平板過夜培養(yǎng)后，用IOmL的2XYT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上長出的菌苔刮洗干凈，加入終濃度25%的甘油，分裝保存在_70°C備用，此為獲得的抗PCV2單域重鏈抗體(VHH)免疫
庫。 電轉(zhuǎn)化后的隨機(jī)挑選電轉(zhuǎn)后的克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行測序，鑒定抗體庫的多祥性，根據(jù)克隆的正確率來計(jì)算實(shí)際庫容。I. 2. 5制備噬菌體抗體庫(I)取用甘油保存的VHH文庫，接種到500ml2YT-G(2XYT，Glucose :0. 5%)培養(yǎng)基中，37° C 250rpm震搖培養(yǎng)直到菌濃度達(dá)到OD6tltl值為0. 8-0. 9。(2)加入M13K07輔助噬菌體至終濃度5X109pfu/mL，首先，在37° C靜置培養(yǎng)30min，然后在進(jìn)行200rpm震搖培養(yǎng)30min，使噬菌體充分感染。(3)2200g離心15min重新收獲菌體，然后重懸到相同體積的2YT_AK(2XYT，2%葡萄糖，50ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin)中，30° C 300rpm 過夜震搖培養(yǎng)。⑷7000g，4° C離心15min收集含有噬菌體的上清，加入到容量為IL的提前預(yù)冷的三角瓶內(nèi)。加入0. 3體積的噬菌體沉淀劑PEG/NaCl (20%PEG80002. 5mol/LNaCl)。混勻冰上靜置Ih，使噬菌體沉淀。(5)7000gl5min離心兩次，盡可能多的收集噬菌體沉淀，重懸到8ml的PBS中。(6)分裝到小離心管12000g離心IOmin確保細(xì)菌充分分離，收集上清。最后滴定噬菌體，將得到的噬菌體稀釋后感染TGl在涂到含有TGl的2TY-AG(2XYT，Ampr 100u g/mL ；Glucose :0. 5%)平板，培養(yǎng)，確定抗Amplr克隆的數(shù)量。然后4° C保存噬菌體，準(zhǔn)備進(jìn)行篩選。I. 2. 6抗體庫的淘選(I)抗原包被在96孔酶標(biāo)板中用碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)包被PCV2VLPs，三輪篩選包被濃度分別為30 u g/ml、15 u g/ml、10 u g/ml, 100 u L/孔，4°C包被過夜,制成抗體淘洗板。(2)封閉棄去孔內(nèi)液體，加入 100 u L/ 孔封閉液(TBST+5mg/ml BSA, 0. 02%NaN3),37°C 封閉 2h。(3)去封阻液，在用TBST(TBS+0. l%Tween-20)緩沖液快速洗板6次。每次均旋轉(zhuǎn)以使板或孔的底部及邊緣均被洗到，傾去緩沖液，倒置在干凈紙巾上拍甩以除去殘余溶液。(4)用IOOiU的TBST緩沖液稀釋噬菌體原始文庫，然后加到已包被好的板上，室溫溫和搖動60min。(第一輪淘洗噬菌體顆粒的數(shù)量比文庫大小高100倍)。(5)傾倒除去未結(jié)合噬菌體，倒置板在干凈的紙巾上拍甩除去殘余溶液。用TBST緩沖液洗板10次，每次換一干凈紙巾以避免交叉污染。
(6)洗脫用IOOu I的非特異性緩沖液(0. IM HCl-Glycin pH2. 2)洗脫，室溫?fù)u動30min，吸出洗脫液，用80ii L左右IM Tris-HCl (pH9. I)中和至pH等于7. 4。(7)取少量洗脫液(IOiU)進(jìn)行噬菌體滴度測定和產(chǎn)出量計(jì)算，同時將剩余洗脫的噬菌體感染20ml指數(shù)生長的TG1，37°C 300rpm擴(kuò)增培養(yǎng)5h。(8)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入ー離心管中，然后，4°C 10 OOOrpm離心lOmin。上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，再離心。將上清的上部80%轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體4°C沉淀過夜。4°C 10 OOOrpm離心15min。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清液。(9)沉淀物重懸于Iml TBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，4°C離心5min使殘余細(xì)胞沉淀。上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60min。4°C離心lOmin，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸去 殘余上清。沉淀物重懸于200 y ITBS中。離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新鮮管中。此即為擴(kuò)增后的洗脫物。分裝凍存_70°C備用。(10)根據(jù)常規(guī)M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴(kuò)增后的洗脫物。4°C貯存。按以上步驟進(jìn)行“結(jié)合-洗滌-洗脫(感染)”，反復(fù)進(jìn)行三輪。I. 2. 7噬菌體ELISA鑒定陽性克隆(I)挑取經(jīng)過三輪經(jīng)篩選后的克隆于96孔深孔板中，每孔250 ii L2X YTATG(2X YT培養(yǎng)基中添加 Amp1 ;100u g/mL ；Tetr 10u g/mL ；Glucose :0. 5%)培養(yǎng)基，37 °C 搖床培養(yǎng)至OD600約為0. 5，按照M0I=20 I加入輔助噬菌體，室溫靜置30min,37°C,150rpm/min培養(yǎng)30min，5000g離心IOmin收集沉淀，重懸于等體積2 X YTATG，30°C，搖床200rpm培養(yǎng)過夜。(2) 10000rpm/min離心IOmin收集上清,加入沉淀劑收集卩遼菌體。重懸于Iml無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(DPBS)中，反復(fù)離心確保沒有任何雜質(zhì)顆粒存在。(3)包被PCV2 VLPs 10 y g/ml，加入96孔酶標(biāo)板中，100 y L/孔，4°C包被過夜。(4)棄包被液，用DPBS溶液220 u L/孔洗5次，用封閉液(5%BSA+0. l%Tween_20)封閉，IOOii L/ 孔，37°C封閉 2h。(5)棄去封閉液，加入溶于洗液的單克隆噬菌體抗體，100 u L/孔，37°C靜置2h。(6)棄去液體，用DPBS洗6次，220 ii I/孔。(7)將鼠抗M13-HRP抗體用封閉緩沖液按1:5000稀釋，100 y L/孔，37°C作用lh。(8)棄去液體，酶標(biāo)板用DPBS洗6次。(9)棄去洗滌液，加入底物OPD顯色液，50 ii L/孔，室溫靜置顯色。用50 y L/孔2MH2SO4終止顯色。酶標(biāo)儀測定0D490值。I. 2. 8陽性克隆的測序(I)進(jìn)行噬菌斑擴(kuò)增，然后，取500 ill含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新鮮離心管。加200iilPEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置IOmin。(2)離心lOmin，棄上清液，再短暫離心，小心吸去殘余上清。(3)沉淀物徹底重懸于 100 u I 碘化物緩沖液[IOmM Tris-HCl (pH8. 0)，ImMEDTA, 4MNaI]中，加入250 u Iこ醇,室溫溫育lOmin。短時間的室溫溫育使單鏈?zhǔn)删wDNA沉淀而大多數(shù)噬菌體蛋白保持在溶液中。(4)離心lOmin，棄上清。用70%的こ醇洗沉淀，短暫真空干燥。沉淀重懸于30 ylTE[10mM Tris-HCl (pH8. 0), ImM EDTA]中。
(5) IOul的上述模板溶液送出測序，使用用通用測序引物測序。I. 2. 9篩選的PCV2VHH重鏈抗體在E. coli中表達(dá)、鑒定和純化上述實(shí)驗(yàn)共獲得陽性克隆，通過測序得到基因組序列，通過序列分析比較，該篩選序列為VHH重鏈抗體序列。利用含有BSAI和BamHI位點(diǎn)的弓I物進(jìn)行PCR將這些序列擴(kuò)増，膠回收PCR擴(kuò)增后片段，然后雙酶切酶切，酶切后的目的片段與E. coli表達(dá)載體pSMK連接，構(gòu)建VHH重鏈抗體重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到E. coli [BL21-codon-Plus (DE3) -RHstrain(Stratagene)]中進(jìn)行表達(dá)。利用SDS-PAGE鑒定表達(dá)的VHH抗體蛋白表達(dá)情況,利用抗His單抗進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),對蛋白表達(dá)進(jìn)ー步驗(yàn)證,并使用鎳柱進(jìn)行目的蛋白的純化。 I. 2. 10重組PCV2重鏈單域抗體(VHH)結(jié)合抗原能力和型特異性鑒定I. 2. 10. I雙抗體夾心ELISA鑒定PCV2 VHH抗體結(jié)合力(I)抗體包被純化VHH抗體包被酶標(biāo)板(10 ii g/ml 100 yl/孔)，設(shè)定SUMO蛋白(10 u g/ml 100iil"L)、PCV2 VPLs (10 u g/ml 100 yl/孔)做對照，4°C 過夜包被。(2)加入抗原I XPBST洗滌4次，220 U L/孔，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，拍干，按照50ug/ml 的濃度加入 PCV2 VPLs 100 yl/孔，37°C 作用 60min，洗板。(3)加入PCV2陽性多抗血清用血清稀釋液(1%BSA，10%馬血清，Ix PBST)，按照倍比稀釋加入IOOiIl/孔，37°C作用60min，洗板。(4)加酶標(biāo)ニ抗1 10000稀釋抗豬HRP標(biāo)記ニ抗，100 iil/孔，37°C作用60min，洗板。(5)顯色加入OPD底物，50iU/孔，37°C避光顯色15min。(6)終止并讀數(shù)加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50 U I/孔，OD490讀取吸光度值。I. 2. 10. 2雙抗體夾心ELISA鑒定PCV2VHH抗體型特異性(I)抗體包被對純化VHH抗體用碳酸鹽緩沖液(pH值9. 6)包被酶標(biāo)板(10 ii g/ml 100111/孔)，4で過夜包被。(2)加入抗原I XPBST洗滌4次，220 U L/孔，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，拍干，分別加入純化的 PCVl CAP 和 PCV2 VPLS (50ug/ml，100iil/孔)，37°C 作用 60min，洗板。(3)分別加入PCV2和PCVl陽性多抗血清(產(chǎn)生于免疫鼠的多抗血清)和陰性對照血清(未免疫鼠血清)，用血清稀釋液(1%BSA，10%馬血清，Ix PBST)，按照倍比稀釋加入IOOiU/孔，37°C作用 60min，洗板。(4)加酶標(biāo)ニ抗1 10000稀釋抗鼠HRP標(biāo)記ニ抗，100 iil/孔，37°C作用60min，洗板。(5)顯色加入OPD底物，50iil/孔，37°C避光顯色15min。(6)終止并讀數(shù)加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50iU/孔，OD490讀取吸光度值。1.2. 11抗體疊加實(shí)驗(yàn)對獲得的幾株抗體進(jìn)行疊加實(shí)驗(yàn)鑒定其是否結(jié)合同ー個抗原表位(I)抗體包被用碳酸鹽緩沖液(pH值9. 6)按IOii g/ml加入PCV2 VPLs抗原IOOiU/孔，4°C過夜包被。(2)加入純化抗體1 XPBST洗滌4次，220 ii L/孔，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，拍干，超量加入純化抗體(50 u g/ml),姆個抗體為選擇兩個實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔,37°C作用60min,洗板。此時取其中一個實(shí)驗(yàn)重復(fù)孔，加入不同的抗體，IOOiI I/孔，37°C作用60min。(3)非重疊孔先加入抗HIS的鼠源單抗(I :1000)，然后做重疊的孔也按照相同的比列加入，IOOiU/孔，37°C作用60min，洗板。(4)加入HRP標(biāo)記的抗鼠ニ抗，按照I 10000稀釋，100111/孔，37で作用601^11，洗板。(5)顯色加入OPD底物，50iU/孔，37°C避光顯色15min。
(6)終止并讀數(shù)加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50 U I/孔，OD490讀取吸光度值。I. 2. 12抗體胃蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)據(jù)報道VHH抗體具有很好的穩(wěn)定性，在極端的條件下也很穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)采用豬的胃蛋白酶對獲得抗體進(jìn)行消化。(I)取純化的抗體80 ii g (100 iil)，取等量的5份。(2)胃蛋白酶終濃度為0. 8mg/ml溶解于含有0. 8%體積濃鹽酸的液體中(pH約為I. 6)。(3)加入等量的胃蛋白酶(100 ill)到抗體管中，此時pH值約為2. 2，按照10min20min 30min 40min 60min 分別進(jìn)行消化。(4)終止加入2M的NaoH 10 yl，此時pH值約為6. O。(5)加入 5XSDS Ioadingbuffer 進(jìn)行 SDS-PAGE。I. 2. 13PCV2 VHH在雙抗體夾心ELISA血清抗體檢測方法建立中的應(yīng)用利用PCV2VHH抗體clonel和clone4，通過雙抗體夾心ELISA方法對15份PCV2陽性和5份陰性血清進(jìn)行抗體測定，從而對獲得PCV2VHH抗體是否可以用于臨床樣品抗體檢測進(jìn)行驗(yàn)證。(I)抗體包被用碳酸鹽緩沖液(pH值9. 6)，稀釋clonel和clone4濃度均為
10u g/ml，加到載體反應(yīng)板，50 u I/孔，4°C包被過夜。(2) 1XPBST5次洗版后，加入用稀釋液稀釋的PCV2VPLs (50ug/ml)，50 yl/孔，
37°C Ih。(3)加入倍比稀釋的樣品血清，50 iil/孔，37°C lh。(4)加入 HRP 標(biāo)記ニ抗(I :10000), 50 iil/孔，37°C lh。(5)加入TMB底物，顯色15min，加入2M H2SO4終止反應(yīng)，50 yl/孔，OD45tl讀取吸光度值。2.結(jié)果2. I完整淋巴細(xì)胞總RNA的提取提取外送免疫后雙峰駝外周血淋巴細(xì)胞的總RNA，凝結(jié)電泳分析提取的總RNA無基因組污染，大小與預(yù)期相符，見圖I所示。2. 2VHH重鏈抗體基因PCR擴(kuò)增以O(shè)ligo dT為反轉(zhuǎn)錄引物，將提取的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，H1R、CH2D為上下游引物，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，得到大小600bp和900bp左右2條帶，見圖2?；厥?00bp條帶。以第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為模板，H2S、H3D為上下游引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增得到約450bp條帶，見圖3。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以H2SfiI、H3NotI為上下游引物進(jìn)行第三輪PCR擴(kuò)增得到約450bp條帶，見圖4，此時VHH基因兩端分別引入了 Sfil/Notl限制性酶切位點(diǎn)。2. 3噬菌體展示抗體庫多多樣性的確定和庫容量經(jīng)過三次大量連接和轉(zhuǎn)化，隨機(jī)選擇15個克隆測序結(jié)果表明，15個克隆的片段均為編碼重鏈抗體的可變區(qū)的基因，計(jì)算得到庫容為I. 12X108的駱駝免疫單域抗體庫，將該抗體庫命名為NA L-PCV2。2. 4抗體庫的淘選采用噬菌體文庫NAL-PCV2淘洗能與PCV2抗原特異性結(jié)合的噬菌體顆粒，測定每輪篩選的噬菌體的回收率，經(jīng)過3輪淘選，表明選擇性吸附的噬菌體量明顯增加(表3)，能與PCV2抗原特異性結(jié)合的噬菌體的得到了富集。對每ー輪洗脫無擴(kuò)增得到的噬菌體文庫進(jìn)行phage-ELISA監(jiān)測，在抗原包被濃度相同，噬菌體投入量相同的條件下，測定的吸光度值隨著淘洗次數(shù)的增加而升高，說明能夠與目標(biāo)抗原結(jié)合的噬菌體克隆得到了富集，結(jié)果見表4。表3三輪淘選噬菌體富集結(jié)果
權(quán)利要求
1.抗豬圓環(huán)病毒2型的雙峰駝單域重鏈抗體，其特征在于所述的抗體具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列 (a)SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或 (b)與SEQID NO. I所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的雙峰駝單域重鏈抗體，其特征在于所述的與SEQID NO. I所示的序列同源性在95%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。
3.編碼權(quán)利要求I或2所述的雙峰駝單域重鏈抗體的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列具有SEQID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列的真核或原核細(xì)胞，優(yōu)選的所述的宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的真核或原核細(xì)胞。
7.權(quán)利要求I或2所述的雙峰駝單域重鏈抗體在制備檢測或診斷豬圓環(huán)病毒感染試劑中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的豬圓環(huán)病毒為豬圓環(huán)病毒2型，所述的雙峰駝單域重鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 3所示。
9.權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列在制備檢測或診斷豬圓環(huán)病毒感染試劑中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的的應(yīng)用，其特征在于所述的豬圓環(huán)病毒為豬圓環(huán)病毒2型，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗豬圓環(huán)病毒2型的雙峰駝單域重鏈抗體及其制備方法和用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次利用PCV2滅活疫苗免疫雙峰駝，利用噬菌體展示技術(shù)建立PCV 2免疫VHH抗體庫，篩選與PCV特別是PCV 2型病毒抗原具有良好親和力的高特異性單域重鏈抗體(VHH)，本發(fā)明所述的抗體具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO.1所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。本發(fā)明的PCV 2單域重鏈抗體對于研究豬圓環(huán)病毒，特別是對于研究豬圓環(huán)病毒2型的感染機(jī)理和建立高度敏感和特異的抗原快速檢測或診斷試劑具有重要意義。
文檔編號C12Q1/70GK102766207SQ20121024962
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者劉湘濤, 吳錦艷, 孫世琪, 尚佑軍, 尹雙輝, 張克山, 楊順利, 田宏, 陳妍, 靳野 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所