專利名稱：一種從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法。
背景技術(shù)：
凝膠電泳是分離目標(biāo)核酸分子的經(jīng)典方案，其原理在電場(chǎng)牽引力作用下，不同分子量的核酸分子運(yùn)動(dòng)速度不一樣，從而將它們分離開來。凝膠電泳分為瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，前者回收相對(duì)簡(jiǎn)單，但分辨力有限，后者分辨率可達(dá)I個(gè)堿基差異，但由于PAGE膠中核酸難以溶解出來，回收較為困難。與瓊脂糖膠回收方案比較，PAGE膠回收存在的問題如下(I)膠破碎操作困難；(2)需要在較高溫度(60度左右)操作4小時(shí)以上才能將核酸從破碎的PAGE膠中將溶解出來，顯著延長(zhǎng)了操作時(shí)間，長(zhǎng)時(shí)間高溫處理也增加了核酸降解的風(fēng)險(xiǎn)；(3)成本是瓊脂糖回收的3倍左右；(4)回收效率低于瓊脂糖電 泳回收。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實(shí)施例的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種回收的操作時(shí)間短，且回收成本低的從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法，包括以下步驟(I)從聚丙烯酰胺凝膠中分離核酸；(2)切下含有目標(biāo)核酸分子的聚丙烯酰胺膠；(3)將切下的聚丙烯酰胺膠放在瓊脂糖膠孔中電泳并顯色；(4)從瓊脂糖膠中切膠并回收目標(biāo)核酸分子。本發(fā)明更優(yōu)選的技術(shù)方案一種從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法，包括以下步驟(I)聚丙烯酰胺凝膠分離核酸根據(jù)需要分離的核酸分子預(yù)期的分子量大小，配制相應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠，在不高于5V/CM的電壓下電泳3-10分鐘，使不同分子量的核酸分子分離后顯色；(2)切下含有目標(biāo)核酸分子的聚丙烯酰胺膠根據(jù)所需要的核酸分子大小范圍，切下含有目標(biāo)分子的聚丙烯酰胺膠膠塊；(3)將切下的聚丙烯酰胺膠放在瓊脂糖電泳膠孔中電泳并顯色根據(jù)切下聚丙烯酰胺膠塊中的核酸分子量的大小，配制相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠，將切下的聚丙烯酰胺膠膠塊置于瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，在不高于5V/cM的電壓下電泳3-10分鐘后顯色；(4)從瓊脂糖膠中切膠并回收目標(biāo)核酸分子在激發(fā)光照射下，切下含有核酸分子的瓊脂糖膠塊，按瓊脂糖凝膠回收方案回收目標(biāo)核酸分子。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是
(I)快捷利用PAGE膠回收，大量時(shí)間耗在膠破碎與膠溶解上，至少要4. 5小時(shí)以上，利用本發(fā)明的技術(shù)方案，省略了膠破碎與膠溶解，大約只需要0. 5小時(shí)左右；(2)便宜本發(fā)明最終采用瓊脂糖回收試劑盒，比PAGE膠回收試劑盒價(jià)格便宜3倍左右，回收成本低；(3 )方便本發(fā)明避免了破碎PAGE膠的麻煩；(4)高效本發(fā)明最終是從瓊脂糖膠中回收核酸，因此高于PAGE膠回收效率，回收效率聞;(5)安全本膠發(fā)明避免了長(zhǎng)時(shí)間高溫從破碎PAGE中溶解出核酸的程序，因而避免了核酸降解的風(fēng)險(xiǎn)，更為安全。



圖I是本發(fā)明實(shí)施例提供的從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子方法流程示意圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的從20bp Marker中回收IOObp與小RNA文庫(kù)中回收100-140bp的DNA分子的流程示意圖；圖3a和圖3b是本發(fā)明實(shí)施例提供的PAGE膠與瓊脂糖膠電泳結(jié)果圖。圖3a和圖3b中a:PAGE電泳；b:瓊脂糖電泳;1，3 20bp Marker ；2:小RNA文庫(kù)；4 :從PAGE膠20bp Marker中切取IOObp的分子后瓊脂糖電泳結(jié)果；5 :從PAGE膠小RNA文庫(kù)中切取100-140bp的分子后瓊脂糖電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。參見圖1，一種從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法，包括以下步驟(I)從聚丙烯酰胺凝膠中分離核酸根據(jù)需要分離的核酸分子預(yù)期的分子量大小，配制相應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠，在不高于5V/cM的電壓下電泳3-10分鐘，使不同分子量的核酸分子分離后PAGE膠顯色；(2)切下含有目標(biāo)核酸分子的PAGE膠膠塊根據(jù)所需要的核酸分子大小范圍，切下含有目標(biāo)分子的PAGE膠膠塊；(3)將切下的PAGE膠放在瓊脂糖電泳膠孔中電泳、顯色并切膠根據(jù)切下PAGE膠塊中的核酸分子量的大小，配制相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠，將切下的PAGE膠膠塊置于瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，在不高于5V/cM的電壓下電泳3-10分鐘后顯色；(4)從瓊脂糖膠中切膠并回收目標(biāo)核酸分子在激發(fā)光照射下，切下含有核酸分子的瓊脂糖膠塊，按瓊脂糖凝膠回收方案回收瓊脂糖膠中目標(biāo)核酸分子。本發(fā)明提供的更具體的從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法，即從20bp Marker與小RNA文庫(kù)中分別回收IOObp與100_140bp的DNA分子方法(參見圖2)(I)從聚丙烯酰胺凝膠中分離核酸(6%PAGE膠電泳分離20bp Marker和小RNA文庫(kù)，并利用SYBR Gold染料(SYBR Gold是一種染料的名字，對(duì)PAGE膠染色)配制6%的聚丙烯酰胺凝膠，取20bp Marker (貨號(hào)D512A，日本TaKaRa公司生產(chǎn))和小RNA文庫(kù)(以水稻總RNA為材料，按美國(guó)NEB公司的E6160試劑盒操作手冊(cè)構(gòu)建)各5ul，用微型電泳槽(型號(hào)DYCZ-24DN，北京六一儀器廠生產(chǎn))于IOOV的電壓下電泳50分鐘。于IOml電泳緩沖液中加入2ul SYBR Gold染料(貨號(hào)S-11494，美國(guó)Invitrigen公司生產(chǎn))染色5分鐘，254nm的紫外線下觀察并照相(參見圖3a)；(2)切下含有目標(biāo)核酸分子的PAGE膠于藍(lán)光臺(tái)下分別切取20bp Marker中IOObp的條帶和小RNA文庫(kù)中100-140bp的條帶的DNA分子的膠塊；(3)將切下的PAGE膠膠塊置于4%瓊脂糖膠點(diǎn)樣孔中電泳顯色并切膠配制相應(yīng)4%瓊脂糖凝膠，按IOOml膠加入5ul染料的比例加入GeneGreen染料(貨號(hào)9012_36_6，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，GeneGreen為一種染料的名稱。)，將切下的PAGE膠膠塊置于瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，于水平電泳槽(型號(hào)TY-SPAT，北京君意儀器廠生產(chǎn))5V/cm電泳10分鐘，于254nm紫外線下觀察并拍照(參見圖3b)。
(4)從瓊脂糖膠中回收目標(biāo)核酸分子(回收20bp Marker中IOObp的DNA和小RNA文庫(kù)中100-140bp的DNA):在藍(lán)光臺(tái)下，切下含有核酸分子的瓊脂糖膠塊，按瓊脂糖凝膠回收試劑盒(D6294-01，Omega)操作手冊(cè)回收純化目標(biāo)核酸分子，回收時(shí)洗脫離體積為15ul,取Iul于超微量分光光度計(jì)(型號(hào)Q5000，美國(guó)QuanWell公司生產(chǎn))檢測(cè)DNA濃度分別為10ng/ul 和 5ng/ul。本發(fā)明顯著縮短了 PAGE膠回收核酸分子的操作時(shí)間，降低了回收成本與核酸降解的風(fēng)險(xiǎn)，提高了回收效率，操作也更為簡(jiǎn)單。采用本發(fā)明的方法，能夠簡(jiǎn)單、方便、快捷、便宜、高效的從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)從聚丙烯酰胺凝膠中分離核酸； (2)切下含有目標(biāo)核酸分子的聚丙烯酰胺膠； (3)將切下的聚丙烯酰胺膠放在瓊脂糖膠孔中電泳并顯色； (4)從瓊脂糖膠中切膠并回收目標(biāo)核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)聚丙烯酰胺凝膠分離核酸根據(jù)需要分離的核酸分子預(yù)期的分子量大小，配制相應(yīng)濃度的聚丙烯酰胺凝膠，在不高于5V/cM的電壓下電泳3-10分鐘，使不同分子量的核酸分子分離后顯色； (2)切下含有目標(biāo)核酸分子的聚丙烯酰胺膠根據(jù)所需要的核酸分子大小范圍，切下含有目標(biāo)分子的聚丙烯酰胺膠膠塊； (3)將切下的聚丙烯酰胺膠放在瓊脂糖電泳膠孔中電泳并顯色根據(jù)切下聚丙烯酰胺膠塊中的核酸分子量的大小，配制相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠，將切下的聚丙烯酰胺膠膠塊置于瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，在不高于5V/cM的電壓下電泳3-10分鐘后顯色； (4)從瓊脂糖膠中切膠并回收目標(biāo)核酸分子在激發(fā)光照射下，切下含有核酸分子的瓊脂糖膠塊，按瓊脂糖凝膠回收方案回收目標(biāo)核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從聚丙烯酰胺凝膠中回收核酸分子的新方法，包括以下步驟從聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)中分離核酸分子；切下含有目標(biāo)分子的PAGE膠；將切下的PAGE膠放在瓊脂糖膠孔中電泳并顯色；從瓊脂糖膠中切膠回收目標(biāo)核酸分子。本發(fā)明顯著縮短了PAGE膠回收核酸分子的操作時(shí)間，降低了回收成本與核酸降解的風(fēng)險(xiǎn)，提高了回收效率，操作也更為簡(jiǎn)單。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102796730SQ201210249368
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者彭海, 張靜, 周俊飛 申請(qǐng)人:海南廣陵高科實(shí)業(yè)有限公司, 江漢大學(xué)