一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備
【專利摘要】本發(fā)明用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料制備，依次反應(yīng)為：其中：為4-甲基喹啉，為6-溴己酸；其中為2-(甲硫基)苯并噻唑，為對甲苯磺酸甲酯，DMF為N,N-二甲基甲酰胺，Et3N為三乙胺，HCl(conc.)為濃鹽酸，其中：為2-琥珀酰亞胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)，DIPEA為N,N-二異丙基乙胺，為牛磺酸，為產(chǎn)品。從分子結(jié)構(gòu)上做改進，容易滲透到高密集程度的高聚物中，保持核酸染料的高敏感性和高穩(wěn)定性，解決了作為核酸凝膠染料的熒光染料很難滲透進去的技術(shù)難題和通常核酸染料所具有的高毒性難題。
【專利說明】
一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及熒光染料領(lǐng)域，具體涉及一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染 料的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有的用在瓊脂糖凝膠中的安全無毒的染料，如美國b i〇 t ium公司生產(chǎn)的 gelgreen染料由于分子量過大，不能應(yīng)用在聚丙烯酰胺凝膠電泳。導(dǎo)致的原因是:聚丙烯酰 胺凝膠密是密集程度更高的三維空間的高聚物。這種高密集聚合物結(jié)構(gòu)，使得在分離不同 大小范圍、不同濃度范圍的的核酸分子時，作為核酸凝膠染料的熒光染料特別是大分子很 難滲透進去以致核酸染色效果不佳。
[0003] 用于核酸電泳常見的凝膠成像儀，一般分為兩種波段，即紫外和488nm左右的凝膠 激光掃描儀。凝膠電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質(zhì)。后者聚丙烯酰胺 凝膠密是密集程度非常高的高聚物。這種高密集結(jié)構(gòu)，作為核酸凝膠染料的熒光染料在染 色分離的核酸分子時很難滲透進去以致核酸染色效果不佳。
[0004] 聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)，對于小 片段DNA(5bp-500bp)的分離效果最好。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨 率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，而且進行高壓電泳時，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。本
【申請人】在 2014年4月份（申請?zhí)枮?01410149438.6,發(fā)明創(chuàng)造名稱為一種新型核酸染料的制備及其應(yīng) 用）的一份專利申請中，提及一種新型的核酸染料，這種染料在保持了作為優(yōu)良核酸染料的 高敏感性、高穩(wěn)定性、同現(xiàn)有檢測儀器兼容的情況下，從分子結(jié)構(gòu)上做了改進，從而可以很 容易的滲透到聚丙烯酰胺凝膠這種高密集程度的高聚物中。但是這種染料僅能用在以 254nm為基礎(chǔ)的紫外凝膠掃描儀上，不能兼容以488nm為基礎(chǔ)的紫外凝膠掃描儀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，我們提出了一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料 的制備，本發(fā)明從分子結(jié)構(gòu)上做了改進，從而可以很容易的滲透到這種高密集程度的高聚 物中。
[0006] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備，共分為下列四步反應(yīng)獲 得：
[0008] 一、第一步反應(yīng)
[0009] 1.1反應(yīng)方程式
[0010]
[0011]其中：
[0012]
[0013]
[0014]
[0015] 二、第二步反應(yīng)
[0016] 2.1反應(yīng)方程式
[0017]
[0018] 其中：
[0019]
(甲硫基)苯并噻唑
[0020]'對甲苯磺酸甲酯 〇
---------
[0021]為中間體II
I TsO
[0022] 三、第三步反應(yīng)
[0023] 3.1反應(yīng)方程式 I'sQ
[0027] DMF為N，N-二甲基甲酰胺
[0028] Et3N為三乙胺
[0029] Nal為碘化鈉 [0030] HCl(conc.)為濃鹽酸
[0031]
:為中間體III
[0032]四、第四步反應(yīng) [0033] 4.1反應(yīng)方程式
[0037]
-為2-琥珀酰亞胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)
[0034]
[0035]
[0036]
[0038] DMF 為N，N-二甲基甲
[0039] 酰胺
[0040] DIPEA為N，N-二異丙基乙胺
[0041 ]
為牛磺酸
[0042] Et3N為三乙胺
[0043] H9〇^7k
[0044]
?為產(chǎn)品化合物。
[0045] 優(yōu)選的，所述1.1步驟的反應(yīng)操作如下：在100mL雙頸瓶中加入4-甲基喹啉和6-溴 己酸，用橡膠塞封口后加熱130 °C反應(yīng)3h，隨后升溫至150 °C反應(yīng)12h; TLC跟蹤反應(yīng)，展開劑： 15 %MeOH/CH2Cl2;熱的反應(yīng)液倒入150mL乙腈中，攪拌，加入1 OOmL乙酸乙酯，有固體析出，過 濾;所得固體中加入150mL乙酸乙酯，攪拌2h;過濾，固體干燥得中間體I。
[0046] 優(yōu)選的，所述2.1步驟的反應(yīng)操作如下：在裝有機械攪拌的250mL反應(yīng)瓶中加入2-(甲硫基)苯并噻唑和對甲苯磺酸甲酯，加熱60°C反應(yīng)過夜，隨后升溫至120°C反應(yīng)2h;TLC跟 蹤反應(yīng)完成，展開劑:異丙醇：丙酮:水：乙酸:氨水=35: 25: 25:14:8;加入乙酸乙酯100mL， 回流反應(yīng)1 h，冷卻后過濾，固體干燥得中間體II。
[0047]優(yōu)選的，所述3.1步驟的反應(yīng)操作如下:在100mL圓底燒瓶中加入中間體I和DMF，滴 加入Et3N，常溫攪拌15min;在20min內(nèi)逐份加入中間體II，完畢后常溫攪拌過夜反應(yīng);TLC跟 蹤反應(yīng)完成，展開劑:20 %MeOH/CH2Cl2;反應(yīng)液倒入150mL水中，攪拌，加入Nal，隨后加入濃 鹽酸，攪拌2h;過濾，固體干燥得中間體III。
[0048]優(yōu)選的，所述4.1步驟的反應(yīng)操作如下：在50mL茄形瓶中，加入中間體III、DMF和 DIPEA，在冰浴下攪拌0.5h，分批加入TSTU，繼續(xù)冰浴條件下反應(yīng)lh; TLC跟蹤反應(yīng)完成，展開 劑:MeOH: DCM= 1:5;配制0.6g?；撬?20mL H2〇的溶液，并將其放置于冰浴中冷卻0.5h，隨 后向?；撬崛芤褐屑尤肴野凡⒕徛渭尤胍陨系姆磻?yīng)液，攪拌過夜反應(yīng)。TLC跟蹤反應(yīng)完 成，展開劑:MeOH: DCM = 1:10;過濾，水洗(20mL X 3)，凍干得產(chǎn)品化合物。
[0049] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明不僅保持了作為優(yōu)良核酸染料的高敏感性、高穩(wěn)定性、 而且解決了作為核酸凝膠染料的熒光染料很難滲透進去以致核酸染色效果不佳的技術(shù)難 題。產(chǎn)品可以用在帶有SYBR Green濾光片的紫外凝膠成像儀或者具有可見光激發(fā)器的凝膠 成像儀，如Dark Re ad er拍照系統(tǒng)或48 8nm激光器為基礎(chǔ)的凝膠掃描儀。另外本產(chǎn)品亦解決 了通常核酸染料所具有的高毒性問題。從而達到了設(shè)計新穎、反應(yīng)操作合理、且應(yīng)用效果好 的目的。
【附圖說明】
[0050] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0051] 圖1為本發(fā)明實施例所公開的一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制 備時的質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0052] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0053] 下面結(jié)合實施例和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0054] 實施例.
[0055]如圖1所示，一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料，其特征在于，共分為 下列四步反應(yīng)獲得：
[0056] 一、第一步反應(yīng) [0057] 1.1反應(yīng)方程式
[0063] 1.2反應(yīng)操作[0064] 在100mL雙頸瓶中加入4-甲基喹啉和6-溴己酸，用橡膠塞封口后加熱130°C反應(yīng)
[0058]
[0059]
[0060]
[0061]
[0062] 3h，隨后升溫至150°C反應(yīng)121UTLC跟蹤反應(yīng)，展開劑：15%MeOH/CH2Cl2。熱的反應(yīng)液倒入 150mL乙腈中，攪拌，加入lOOmL乙酸乙酯，有固體析出，過濾。所得固體中加入150mL乙酸乙 酯，攪拌2h。過濾，固體干燥得中間體I。
[0065]第一步反應(yīng)得到的實驗數(shù)據(jù)為：
[0066] 4-甲基喹啉投料量:6.8mL
[0067] 6-溴己酸投料量：10g
[0068] 中間體I的產(chǎn)量為：12.4g理論值為：13.24g
[0069] 二、第二步反應(yīng) [0070] 2.1反應(yīng)方程式
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] ! TsC)
[0076] 2.2反應(yīng)操作
[0077]在裝有機械攪拌的250mL反應(yīng)瓶中加入2_(甲硫基）苯并噻唑和對甲苯磺酸甲酯， 加熱60 °C反應(yīng)過夜，隨后升溫至120 °C反應(yīng)21UTLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑:異丙醇:丙酮:水： 乙酸:氨水=35:25:25:14:8。加入乙酸乙酯lOOmL，回流反應(yīng)lh，冷卻后過濾，固體干燥得中 間體Π 。
[0078]第二步反應(yīng)得到的實驗數(shù)據(jù)為：
[0079] 2_(甲硫基)苯并噻唑投料量:19.8g
[0080] 對甲基苯磺酸甲酯投料量:24.4g
[0081 ]中間體II的產(chǎn)量為:38 · 54g理論值為:40 · 43g
[0082] 三、第三步反應(yīng)
[0083] 3.1反應(yīng)方程式
[0084] 其中：
[0085]
[0086]
為中間體Π
[0087] DMF為Ν，Ν-二甲基甲酰胺
[0088] Et3N為三乙胺
[0089] Nal為碘化鈉
[0090] HCl(conc.)為濃鹽酸
[0091]
為中間體III
[0092] 3.2反應(yīng)操作
[0093] 在100mL圓底燒瓶中加入中間體I和DMF，滴加入Et3N，常溫攪拌15min。在20min內(nèi) 逐份加入中間體Π ，完畢后常溫攪拌過夜反應(yīng)。TLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑：20 %MeOH/ CH2C12。反應(yīng)液倒入150mL水中，攪拌，加入Nal，隨后加入濃鹽酸，攪拌2h。過濾，固體干燥得 中間體III。
[0094]第三步反應(yīng)得到的實驗數(shù)據(jù)為：
[0095]中間體I投料量:7.13g
[0096] 中間體II投料量:7.72g
[0097] DMF 投料量：50mL
[0098] 三乙胺投料量：5.85mL
[0099] 碘化鈉投料量:3.15g
[0100] 濃鹽酸投料量:3.5mL
[0101] 中間體III產(chǎn)量:9.28g理論值為：11.19g
[0102] 四、第四步反應(yīng)
[0103] 4.1反應(yīng)方程式
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
32-琥珀酰亞胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TSTU)
[0108] DMF為N，N-二甲基甲酰胺
[0109] DIPEA為N，N-二異丙基乙胺
[0110]
[為?；撬?br>[0111] Et3N為三乙胺
[0112] H20 為水
[0113]
〖產(chǎn)品化合物
[0114] 4.2反應(yīng)操作
[0115] 在5OmL茄形瓶中，加入中間體III、DMF和DITOA，在冰浴下攪拌0.5h，分批加入 TSTU，繼續(xù)冰浴條件下反應(yīng)lhJLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑:MeOH:DCM=l:5。配制0.6g?；?酸/20mL H20的溶液，并將其放置于冰浴中冷卻0.5h，隨后向牛磺酸溶液中加入三乙胺并緩 慢滴加入以上的反應(yīng)液，攪拌過夜反應(yīng)。TLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑:MeOH: DCM= 1:10。過濾， 水洗(20mL X 3)，凍干得產(chǎn)品化合物。
[0116] 第四步反應(yīng)得到的實驗數(shù)據(jù)為：
[0117] 中間體III投料量：1.6g
[0118] TSTU 投料量：lg
[0119] DIPEA 投料量：lmL
[0120] DMF 投料量:20mL
[0121] ?；撬嵬读狭?0.6g
[0122] 水投料量:20mL
[0123] 三乙胺投料量：lmL
[0124] 產(chǎn)品化合物產(chǎn)量:1.5g，理論值為：1.92g
[0125] 通過上述反應(yīng)操作過程，本發(fā)明得到的產(chǎn)品，不僅保持了作為優(yōu)良核酸染料的高 敏感性、高穩(wěn)定性，而且解決了作為核酸凝膠染料的熒光染料很難滲透進去以致核酸染色 效果不佳的技術(shù)難題。同時，產(chǎn)品可以用在帶有SYBR Green濾光片的紫外凝膠成像儀或者 具有可見光激發(fā)器的凝膠成像儀，如Dark Reader拍照系統(tǒng)或488nm激光器為基礎(chǔ)的凝膠掃 描儀。另外本產(chǎn)品亦解決了通常核酸染料所具有的高毒性問題。從而達到了設(shè)計新穎、反應(yīng) 操作合理、且應(yīng)用效果好的目的。
[0126] 以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明 的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備，其特征在于，共分為下列四 步反應(yīng)獲得： 一、第一步反應(yīng) 1.1反應(yīng)方稈式DMF為N，N-二甲基甲酰胺 Et3N為三乙胺 NaI為碘化鈉 HCl(cone.)為濃鹽酸111 (TSTU) 3-四甲基脲四氟硼酸酯DMF為N，N-二甲基甲酰胺DIPEA為N，N-二異丙基乙I 3牛磺酸 Et3N為三乙胺 H2O為水2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備，其特 征在于，所述1.1步驟的反應(yīng)操作如下： 在IOOmL雙頸瓶中加入4-甲基喹啉和6-溴己酸，用橡膠塞封口后加熱130°C反應(yīng)3h，隨 后升溫至150°C反應(yīng)12h;TLC跟蹤反應(yīng)，展開劑：15%Me0H/CH2Cl2;熱的反應(yīng)液倒入150mL乙 腈中，攪拌，加入IOOmL乙酸乙酯，有固體析出，過濾;所得固體中加入150mL乙酸乙酯，攪拌 2h;過濾，固體干燥得中間體I。3. 根據(jù)權(quán)利要求，1所述的一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備，其特 征在于，所述2.1步驟的反應(yīng)操作如下： 在裝有機械攪拌的250mL反應(yīng)瓶中加入2-(甲硫基）苯并噻唑和對甲苯磺酸甲酯，加熱 60°C反應(yīng)過夜，隨后升溫至120°C反應(yīng)2h; TLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑：異丙醇：丙酮：水：乙 酸:氨水=35:25: 25:14:8;加入乙酸乙酯IOOmL，回流反應(yīng)Ih，冷卻后過濾，固體干燥得中間 體II 〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備，其特 征在于，所述3.1步驟的反應(yīng)操作如下： 在IOOmL圓底燒瓶中加入中間體I和DMF，滴加入Et3N,常溫攪拌15min;在20min內(nèi)逐份加 入中間體II，完畢后常溫攪拌過夜反應(yīng);TLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑:20%MeOH/CH2Cl2;反應(yīng) 液倒入150mL水中，攪拌，加入NaI，隨后加入濃鹽酸，攪拌2h;過濾，固體干燥得中間體III。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的新型核酸染料的制備，其特 征在于，所述4.1步驟的反應(yīng)操作如下： 在50mL茄形瓶中，加入中間體III、DMF和DIPEA，在冰浴下攪拌0.5h，分批加入TSTU，繼 續(xù)冰浴條件下反應(yīng)Ih; TLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑:MeOH: DCM= 1: 5;配制0.6g?；撬?20mL H2O的溶液，并將其放置于冰浴中冷卻0.5h，隨后向?；撬崛芤褐屑尤肴野凡⒕徛渭尤?以上的反應(yīng)液，攪拌過夜反應(yīng)。TLC跟蹤反應(yīng)完成，展開劑：MeOH: DCM= 1:10 ;過濾，水洗 (20mL X 3)，凍干得產(chǎn)品化合物。
【文檔編號】C07D417/06GK106008495SQ201610412156
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】夏繼波, 聶承斌, 錢近春, 趙育明, 趙文俊
【申請人】蘇州宇恒生物科技有限公司