專利名稱：一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)物的測定與檢驗(yàn)方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
紫杉醇(Taxol)為二萜類化合物，具有較為獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制，通過影響微管蛋白的穩(wěn)定來抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。但是紫杉醇作為重要的天然抗癌藥物，藥源問題一直未得到有效解決。直到現(xiàn)在，商業(yè)用紫杉醇主要提取自紅豆杉屬植物的樹皮，紅豆杉是世界性的瀕危珍稀植物，而且紫杉醇在紅豆杉樹皮內(nèi)的含量極低，結(jié)果導(dǎo)致紫杉醇的供需矛盾突出。為了在不破會(huì)自然資源的情況下有效解決紫杉醇的藥源問題，各國學(xué)者主要從三個(gè)方面開展研究工作。 一是紫杉醇的化學(xué)合成。盡管全合成或半合成紫杉醇的研究均已經(jīng)取得積極進(jìn)展，但是合成步驟太多，合成條件難以控制，產(chǎn)物收率偏低，并不適于工業(yè)化生產(chǎn)；
二是紅豆杉的組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。期望通過生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)并最終獲取目的產(chǎn)物，但是紅豆杉細(xì)胞容易褐化、培養(yǎng)物生物量小，培養(yǎng)規(guī)模小、紫杉醇產(chǎn)率較低和生產(chǎn)穩(wěn)定性差等問題并沒有得到徹底解決，距離真正實(shí)現(xiàn)紫杉醇工業(yè)化生產(chǎn)還有距離；
第三個(gè)是真菌發(fā)酵，通過微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)紫杉醇開創(chuàng)了解決紫杉醇藥源問題的新思路。由于真菌生長迅速、容易培養(yǎng)、發(fā)酵技術(shù)相當(dāng)成熟，未來通過真菌發(fā)酵解決紫杉醇的藥源問題無疑是最誘人的辦法和途徑。目前面臨的最大問題，就是菌株的紫杉醇生產(chǎn)能力與發(fā)酵生產(chǎn)的要求還有很大距離；盡管紫杉醇產(chǎn)生菌株具有廣泛的多樣性，但是當(dāng)務(wù)之急還是從紅豆杉植物中大量篩查內(nèi)生真菌，獲得優(yōu)良的紫杉醇產(chǎn)生菌株，為紫杉醇的發(fā)酵生產(chǎn)提供豐富的真菌資源。薄層層析法是一種微量、快速而簡單的色譜方法，兼具柱色譜和紙色譜等分析方法的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)物、環(huán)境化學(xué)、高分子材料以及石油化工等技術(shù)領(lǐng)域。借助薄層層析顯色反應(yīng)，建立成熟的紫杉醇產(chǎn)生菌株的快速篩選方法、并對(duì)菌株的紫杉醇生產(chǎn)能力進(jìn)行半定量分析具有積極意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重現(xiàn)性好、靈敏度高、可以從紅豆杉內(nèi)生真菌中篩選到紫杉醇菌株并對(duì)紫杉醇菌株產(chǎn)量進(jìn)行半定量分析。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的采取的技術(shù)方案如下
(I)真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備選取若干紅豆杉植物的組織塊進(jìn)行表面消毒，分離內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物；將得到的菌株充分活化，轉(zhuǎn)接入50mL種子培養(yǎng)基，220C、130 rpm/min,恒溫振蕩培養(yǎng)3天獲得發(fā)酵種子；以20% (體積比)接種量，轉(zhuǎn)接IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基，22°C，110 rpm/min，恒溫振蕩培養(yǎng)15天后完成發(fā)酵；過濾內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物,濾液用等體積的氯仿_甲醇液(10/1，體積比)萃取2次，收集有機(jī)相，即真菌發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物；(2)紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品2mg，溶解于IOmL三氯甲烷，配制成0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(3)薄層層析與顯色反應(yīng)稱取IOg硅膠，加入無菌蒸餾水后充分?jǐn)噭?，濕法鋪板?10°C烘干活化0.5小時(shí)，制成硅膠板，置于干燥器內(nèi)備用；層析時(shí)，點(diǎn)樣于硅膠板上，使用氯仿-甲醇液(7/1，體積比)作為展開劑直立上行展開，層析完成后將層析板取出揮干，使用含有l(wèi)_3wt%香草醛的濃硫酸液噴霧顯色；
(4)紫杉醇菌株的篩選將步驟(I)得到的真菌發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物和步驟(2)的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)點(diǎn)樣于硅膠板上的不同位置，在展開缸內(nèi)進(jìn)行如步驟(3)中薄層層析和顯色反應(yīng)，萃取物在層析板上如果形成與標(biāo)準(zhǔn)溶液遷移率(R f)相同的藍(lán)色斑點(diǎn)，即確認(rèn)該內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生紫杉醇；
(5)真菌菌株紫杉醇產(chǎn)量的半定量分析將步驟(2)配制好的0.2 mg/mL紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用微量進(jìn)樣器分別吸取5、25、45、65、85 ML,點(diǎn)樣于娃膠板上,在展開缸內(nèi)進(jìn)行如步驟
(3)中薄層層析和顯色反應(yīng)，由于點(diǎn)樣的標(biāo)準(zhǔn)液中紫杉醇含量不同，顯色后形成的藍(lán)色斑點(diǎn)深淺不同；將分離的紫杉醇菌株進(jìn)行如步驟(3)中薄層層析和顯色反應(yīng)，根據(jù)藍(lán)色斑點(diǎn)的深淺變化，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)溶液形成的藍(lán)色斑點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的紫杉醇產(chǎn)量進(jìn)行半定量分析。本發(fā)明進(jìn)一步的設(shè)置如下
步驟I中所述的分離紅豆杉內(nèi)生真菌的方法為將植物組織塊連續(xù)浸入75% (體積比)乙醇中I分鐘，3. 25wt%次氯酸鈉中5分鐘，75% (體積比)乙醇中30秒鐘，然后用無菌濾紙吸干，將處理后的組織塊放在加有鏈霉素(30mg/L)的PDA (馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基)平板上，封口后25°C恒溫培養(yǎng)2個(gè)月，通過尖端菌絲挑取法將菌落轉(zhuǎn)移到PDA斜面保存。步驟I中所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為改良的馬丁氏液體培養(yǎng)基。步驟I中所述的改良的馬丁氏液體培養(yǎng)基成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L、KH2PO4 lg/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，苯丙氨酸 2.8mg/L，苯甲酸鈉 30mg/L，乙酸鈉 lg/L, pH為 5. 5-6. O。步驟3中所述的濃硫酸液中香草醛的含量為lwt%。本發(fā)明中，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，粉末狀，純度99. 99% ;香草醛為顯色劑，即3-甲氧基-4-羥基苯甲醛；遷移率(Rf)是指薄層層析時(shí)，真菌發(fā)酵液萃取物中的物質(zhì)或者標(biāo)準(zhǔn)品中的紫杉醇在層析板上沿著溶劑方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比。


圖I使用含有香草醛的濃硫酸液噴霧顯色后，不同含量的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品在硅膠板上形成的藍(lán)色特征性斑點(diǎn)；
圖2為不同菌株發(fā)酵液萃取物通過薄層層析顯色反應(yīng)形成的特征性斑點(diǎn)圖。斑點(diǎn)A-E代表的紫杉醇的含量分別為1、5、9、13、17 Mg ;1、樣品一 ；2、樣品二 ；3、樣品三；4、標(biāo)準(zhǔn)溶液；5、樣品五。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例
(I)稱取粉末狀、純度99. 99%的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品2mg，溶解于IOmL三氯甲烷，配制成0. 2 mg/mL忙液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(2)采集紅豆杉植物樣本，選取若干植物組織塊，將植物組織塊依次并連續(xù)浸入75%(體積比)乙醇中I分鐘，3. 25wt%次氯酸鈉中5分鐘，75% (體積比)乙醇中30秒鐘，表面消毒后用無菌濾紙吸干，將處理后的組織塊放在加有鏈霉素(30mg/L)的PDA (馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基)平板上，封口后25°C恒溫培養(yǎng)2個(gè)月。通過尖端菌絲挑取法將菌落轉(zhuǎn)移到PDA斜面保存，分離獲得內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物。將得到的菌株充分活化后，轉(zhuǎn)接入50mL種子培養(yǎng)基，在220C、130rpm/min條件下,恒溫振蕩培養(yǎng)3天，獲得發(fā)酵種子，以20% (體積比)接種量,轉(zhuǎn)接到IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在22°C、110rpm/min條件下，恒溫振蕩培養(yǎng)15天，完成發(fā)酵，過濾發(fā)酵液，濾液用等體積的氯仿-甲醇液(氯仿-甲醇液的體積比為10 1)萃取2次，收集有機(jī)相萃取物，低溫干燥，即獲得內(nèi)生真菌發(fā)酵物的萃取物；
其中，內(nèi)生真菌的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為改良的馬丁氏液體培養(yǎng)基，改良的馬丁氏液體培養(yǎng)基成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L、KH2PO4 lg/L, MgSO4 7H20 0. 5g/L，苯丙氨酸2.8mg/L,苯甲酸鈉30mg/L,乙酸鈉lg/L, pH為5. 5-6. 0 ;
(3)使用微量進(jìn)樣器分別吸取步驟(I)的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)液5、25、45、65、85ML，點(diǎn)樣于硅膠板上，在展開缸內(nèi)使用氯仿-甲醇液(氯仿-甲醇液的體積比為7 1)作為展開劑直立上行展開，進(jìn)行薄層層析，層析完成后取出揮干，使用含有l(wèi)wt%香草醛的濃硫酸液噴霧顯色，可以看到特征性的藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)，結(jié)果如圖I。從圖I可以看出，紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品在噴霧顯色后的硅膠板上形成的藍(lán)色斑點(diǎn)，顏色深淺表現(xiàn)出明顯差別。在硅膠板上出現(xiàn)的5個(gè)藍(lán)色斑點(diǎn)A-E，A-E的紫杉醇含量分別為I、5、9、13、17呢，其中第I個(gè)斑點(diǎn)A只有I呢的紫杉醇參與顯色反應(yīng)，由于紫杉醇含量過低，所以形成的特征性藍(lán)色斑點(diǎn)幾乎不能看到；隨著紫杉醇含量的增加，藍(lán)色斑點(diǎn)的顏色逐漸加深。可以認(rèn)為，樣品中紫杉醇的含量越高，紫杉醇的薄層層析顯色反應(yīng)效果越明顯；對(duì)比圖1，即可以對(duì)測試樣品中的紫杉醇含量進(jìn)行半定量分析。其中，硅膠板的制備方法為將硅膠加入無菌蒸餾水后充分?jǐn)噭?，濕法鋪板，然后?10°C烘干活化0.5小時(shí)后，置于干燥器內(nèi)。圖2為根據(jù)南方紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵液的萃取物的層析結(jié)果，可以判定樣品三3和樣品五5在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了紫杉醇，而且可以推斷樣品三3的紫杉醇產(chǎn)量比樣品五5更高；至于樣品一 I和樣品二 2的發(fā)酵液萃取物，雖然也在硅膠板上產(chǎn)生藍(lán)色的斑點(diǎn)，但是這兩個(gè)斑點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)溶液4相比較，遷移率(Rf)明顯不同。本發(fā)明紫杉醇菌株的篩選與半定量方法重現(xiàn)性較好，靈敏度較高，專一性較強(qiáng)；從紅豆杉植物組織中分離紫杉醇產(chǎn)生菌株時(shí)可以提高篩選效率，而且與高效液相色譜等分析方法相比較，對(duì)設(shè)備和技術(shù)的要求更低；在選育紫杉醇高產(chǎn)菌株的過程中，根據(jù)藍(lán)色斑點(diǎn)的深淺變化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌株的紫杉醇產(chǎn)量進(jìn)行半定量分析，有利于優(yōu)良菌株的確認(rèn)。
權(quán)利要求
1.一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，包括紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備，其特征在于還包括薄層層析與顯色反應(yīng)、紫杉醇菌株的篩選和菌株紫杉醇產(chǎn)量的半定量分析， (1)真菌發(fā)酵產(chǎn)物的制備選取若干紅豆杉植物的組織塊進(jìn)行表面消毒，分離內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物；將得到的菌株充分活化，轉(zhuǎn)接入50mL種子培養(yǎng)基，220C、130 rpm/min,恒溫振蕩培養(yǎng)3天獲得發(fā)酵種子；以20% (體積比)接種量，轉(zhuǎn)接IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基，22°C，110 rpm/min，恒溫振蕩培養(yǎng)15天后完成發(fā)酵；過濾內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物,濾液用等體積的氯仿_甲醇液(10/1，體積比)萃取2次，收集有機(jī)相，即真菌發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物； (2)紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品2mg，溶解于IOmL三氯甲烷，配制成0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液； (3)薄層層析與顯色反應(yīng)稱取IOg硅膠，加入無菌蒸餾水后充分?jǐn)噭?，濕法鋪板?10°C烘干活化0.5小時(shí)，制成硅膠板，置于干燥器內(nèi)備用；層析時(shí)，點(diǎn)樣于硅膠板上，使用氯仿-甲醇液(7/1，體積比)作為展開劑直立上行展開，層析完成后將層析板取出稍微揮干，使用含有l(wèi)_3wt%香草醛的濃硫酸液噴霧顯色； (4)紫杉醇菌株的篩選將步驟(I)得到的真菌發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物和步驟(2)的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)點(diǎn)樣于硅膠板，在展開缸內(nèi)進(jìn)行如步驟(3)中薄層層析和顯色反應(yīng)，萃取物在層析板上如果形成與標(biāo)準(zhǔn)溶液遷移率(Rf)相同的藍(lán)色斑點(diǎn)，即確認(rèn)為該內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生紫杉醇； (5)真菌菌株紫杉醇產(chǎn)量的半定量分析將步驟(2)配制好的0.2 mg/mL紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用微量進(jìn)樣器分別吸取5、25、45、65、85 ML,點(diǎn)樣于娃膠板上,在展開缸內(nèi)進(jìn)行如步驟(3)中薄層層析和顯色反應(yīng)，形成深淺不同的藍(lán)色斑點(diǎn)。
2.將紫杉醇菌株發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物進(jìn)行如步驟(3)中薄層層析和顯色反應(yīng)，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液形成的藍(lán)色斑點(diǎn)對(duì)比，對(duì)菌株的紫杉醇產(chǎn)量進(jìn)行半定量分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在于步驟I中，所述的分離紅豆杉內(nèi)生真菌的方法為將植物組織塊連續(xù)浸入75%こ醇中I分鐘，3.25%次氯酸鈉中5分鐘，75%こ醇中30秒鐘，然后用無菌濾紙吸干，將處理后的組織塊放在加有鏈霉素(30mg/L)的PDA (馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基)平板上，封ロ后25°C恒溫培養(yǎng)2個(gè)月，通過尖端菌絲挑取法將菌落轉(zhuǎn)移到PDA斜面保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在于步驟I中，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為改良的馬丁氏液體培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在于步驟3中，所述的濃硫酸液中香草醛的含量為lwt%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，其特征在干所述的改良的馬丁氏液體培養(yǎng)基成分為葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L、KH2PO4 lg/L，MgSO4 7H20 0. 5g/L，苯丙氨酸 2. 8mg/L，苯甲酸鈉 30mg/L,こ酸鈉 lg/L, pH 為 5. 5-6. O。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種紫杉醇菌株的篩選方法及其半定量分析，屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)物的測定與檢驗(yàn)方法技術(shù)領(lǐng)域，包括紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、真菌發(fā)酵與薄層層析、紫杉醇菌株的篩選與半定量分析方法等。稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品2mg，溶解于10mL三氯甲烷，配制成0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；分離紅豆杉內(nèi)生真菌純培養(yǎng)物進(jìn)行液體發(fā)酵；對(duì)發(fā)酵液的濾液萃取后收集有機(jī)相，獲得內(nèi)生真菌發(fā)酵液的萃取物；將標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇溶液或真菌發(fā)酵產(chǎn)物的萃取物進(jìn)行薄層層析與顯色反應(yīng)；根據(jù)顯色反應(yīng)結(jié)果可以從紅豆杉內(nèi)生真菌中篩選到紫杉醇菌株并對(duì)菌株的紫杉醇產(chǎn)量進(jìn)行半定量分析。本發(fā)明重現(xiàn)性較好，靈敏度較高，專一性較強(qiáng)，篩選效率較高，與高效液相色譜等分析方法相比較具有更低的設(shè)備和技術(shù)要求。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102796800SQ20121024981
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者臧威, 孫劍秋, 范呈浪, 尹軍霞, 沈國娟 申請(qǐng)人:紹興文理學(xué)院