本專利申請(qǐng)要求2014年8月29日提交的美國(guó)國(guó)家專利申請(qǐng)14/473,074的權(quán)益，所述文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文。

背景技術(shù)：

種子是包封在稱為種皮的保護(hù)性外殼中的胚胎植物。在單子葉植物中，種皮與果皮融合，所述果皮由多層細(xì)胞組成，并且僅包含來(lái)自母體親本的遺傳密碼。因此，果皮組織可用于鑒定種子的母本譜系。父本譜系可進(jìn)一步衍生自與種子(胚或胚乳)基因型組合的果皮基因型，其包含來(lái)自母本和父本背景的遺傳信息。確定譜系對(duì)于確保專有親本譜系保持專有性的種質(zhì)安全性是重要的。

組織或其它粘附結(jié)構(gòu)將果皮連接到主要為胚乳組織的種子內(nèi)部部分。與大多數(shù)種子的相對(duì)較小尺寸相結(jié)合，這可使得果皮的分離和收集困難，或者至少耗時(shí)和費(fèi)力。被攜帶母本和父本遺傳信息的內(nèi)部種子組織(例如胚乳)污染的不純果皮組織的分子分析導(dǎo)致母本譜系的遺傳鑒定不確定。因此，在分子分析之前需要有效的果皮去除和純化方法。

已開(kāi)發(fā)出果皮去除方法，并且在本領(lǐng)域中用于食品加工和果皮分子分析。一些果皮去除方法涉及將玉米谷粒在化學(xué)溶液(例如氫氧化鈉(NaOH)和/或過(guò)氧化氫(H₂O₂))中浸泡相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間(例如幾小時(shí))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，此類化學(xué)浸泡使果皮基本上松散，使得可使用自動(dòng)分離方法將松散的果皮與胚乳分離。所述方法允許處理大批相當(dāng)數(shù)量的谷粒。然而，此類方法需要化學(xué)品，以及與它們相關(guān)的成本和處理。最重要的是，所用的化學(xué)品與大量浸泡時(shí)間相結(jié)合，可損害或以其它方式影響果皮中的DNA。

為了從谷粒其余部分分離果皮以用于分子分析時(shí)避免損傷DNA，當(dāng)前的常規(guī)方法學(xué)已不采用化學(xué)浸泡。相反，當(dāng)前的方法涉及嘗試通過(guò)在蒸餾水中而不是化學(xué)品浸泡谷粒過(guò)夜，而使果皮松散。此類浸泡后，手工切割或摘下果皮。水浸泡在使果皮松散方面不如化學(xué)品有效。

為了準(zhǔn)確鑒定親本譜系，需要高收率的DNA用于分子分析，諸如全基因組遺傳分析。為了使用現(xiàn)有技術(shù)方法獲得一個(gè)樣品的足夠DNA，需要多個(gè)種子(通常約10至100左右)。從足量單個(gè)種子手動(dòng)除去果皮，可能需要一、二或更多個(gè)人工小時(shí)。此外，如果不是不可能，用水浸泡方法從果皮中完全除去所有內(nèi)部種子組織如胚乳組織是困難的，這使得難以達(dá)到精確分子分析所需或所期望的純度水平。此外，來(lái)自多個(gè)種子(特別是來(lái)自商業(yè)種子)的混合DNA由于種子源的混合而帶來(lái)潛在的污染風(fēng)險(xiǎn)。為了避免此類污染并且減少勞動(dòng)力，期望一個(gè)樣品使用單個(gè)種子以供分子分析。

為了對(duì)果皮組織進(jìn)行精確的分子分析，需要改進(jìn)果皮去除、組織純化和DNA收集領(lǐng)域的技術(shù)。此外，需要果皮組織樣品包含來(lái)自較小種子組或甚至單個(gè)種子的組織。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在本專利申請(qǐng)中，可分離果皮使得其不含其它種子組織，例如胚乳和胚芽組織，以獲得純的母本DNA。父本譜系分析可源自母本基因型與種子/胚芽基因型的組合。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案允許通過(guò)從一個(gè)或多個(gè)種子收集母本種子組織來(lái)確定一個(gè)或多個(gè)種子的母本譜系；洗滌母本種子組織；解離并且均化母本種子組織以獲得勻化溶液；離心所述勻化的溶液以獲得上清液；以及使用上清液DNA進(jìn)行分子分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，母本種子組織是果皮。洗滌步驟可用1％十二烷基硫酸鈉溶液、水、乙醇或它們的混合物進(jìn)行。洗滌步驟優(yōu)選用約1％十二烷基硫酸鈉的水溶液進(jìn)行。可使用細(xì)胞解離器(諸如gentleMACS^TM，Miltenyi Biotec)進(jìn)行果皮組織的解離和勻化。所述方法還可包括在分子分析之前使用全基因組擴(kuò)增以獲得足夠的DNA收率。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案允許通過(guò)從一個(gè)或多個(gè)種子收集母本種子組織來(lái)確定一個(gè)或多個(gè)種子的母本譜系；洗滌母本種子組織；解離并且均化母本種子組織以獲得勻化溶液；從勻化溶液中包含的細(xì)胞提取DNA；以及對(duì)所提取的DNA進(jìn)行分子分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，母本種子組織是果皮。洗滌步驟可用1％十二烷基硫酸鈉溶液、水、乙醇或它們的混合物進(jìn)行。洗滌步驟優(yōu)選用約1％十二烷基硫酸鈉的水溶液進(jìn)行。解離和勻化步驟可使用細(xì)胞解離器(諸如gentleMACS^TM，Miltenyi Biotec)進(jìn)行。提取步驟可使用DNA結(jié)合磁性顆?；駿xtract-N-Amp^TM進(jìn)行。所述方法還可包括在分子分析之前使用全基因組擴(kuò)增以獲得足夠的DNA收率。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案允許通過(guò)從一個(gè)或多個(gè)種子收集母本種子組織來(lái)確定一個(gè)或多個(gè)種子的母本譜系；洗滌母本種子組織；在液氮中破壞母本種子組織；從被破壞的母本種子組織中提取DNA；以及對(duì)所提取的DNA進(jìn)行分子分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，母本種子組織是果皮。洗滌步驟可用1％十二烷基硫酸鈉溶液、水、乙醇或它們的混合物進(jìn)行。洗滌步驟優(yōu)選用約1％十二烷基硫酸鈉的水溶液進(jìn)行。提取步驟可使用DNA結(jié)合磁性顆?；駿xtract-N-Amp^TM進(jìn)行。所述方法還可包括在分子分析之前使用全基因組擴(kuò)增以獲得足夠的DNA收率。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案允許通過(guò)從一個(gè)或多個(gè)種子收集母本種子組織來(lái)確定一個(gè)或多個(gè)種子的母本譜系；洗滌母本種子組織；直接從洗滌過(guò)的母本種子組織中提取DNA；以及對(duì)所提取的DNA進(jìn)行分子分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，母本種子組織是果皮。洗滌步驟可用1％十二烷基硫酸鈉溶液、水、乙醇或它們的混合物進(jìn)行。洗滌步驟優(yōu)選用約1％十二烷基硫酸鈉的水溶液進(jìn)行。提取步驟可使用Extract-N-Amp^TM進(jìn)行。所述方法還可包括在分子分析之前使用全基因組擴(kuò)增以獲得足夠的DNA收率。

在上述任何實(shí)施方案中，分子分析可以是基因分型的。當(dāng)收集來(lái)自多于一個(gè)種子復(fù)制的母本種子組織時(shí)，可獲得共有基因型。

附圖說(shuō)明

圖1描述了涉及果皮組織剝離的步驟。

圖2比較了使用DNA的基因分型測(cè)定，所述DNA得自a)使用多個(gè)種子的常規(guī)CTAB DNA提取方法，和b)使用一個(gè)種子(組織洗滌)的DNA提取方法，隨后進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。

圖3展示了可從單個(gè)果皮獲得的優(yōu)質(zhì)熒光標(biāo)記數(shù)據(jù)。

圖4展示了從單個(gè)種子(每條線)提取的果皮組織的測(cè)量基因型和已知母本基因型之間的高度相似性。

具體實(shí)施方式

可切下玉米谷粒的一片外皮，即果皮，以進(jìn)行親本植物的分子分析。在該實(shí)施方案中，可在切割果皮之前將谷粒浸泡在水中。可用鋒利的刀片切割谷粒的背面(離胚芽最遠(yuǎn))，如圖1a中所示。優(yōu)選地，在第一切割之后，在谷粒的外邊緣可用鋒利的刀片切割之前，將刀片滅菌，從第一切割的一端開(kāi)始，圍繞谷粒的邊緣，并且向下至第一切割的另一端，如圖1b中所示?？墒褂脺缇囎訌墓攘Ｖ袆冸x果皮組織，如圖1c中所示。雖然可在谷粒的前側(cè)(最靠近胚芽)進(jìn)行切割，但是切割優(yōu)選在后側(cè)進(jìn)行，以減少果皮將被胚乳組織污染的可能性。為了進(jìn)一步降低污染的可能性，可在切除果皮組織后洗滌所述果皮組織。果皮可以放置在容器的孔中，并且可將切除果皮的種子(或來(lái)自該種子的胚芽)放置于單獨(dú)容器的相應(yīng)孔中。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，存在用于分離果皮組織的其它可比較的方法，并且在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可在不除去果皮的情況下提取果皮DNA。

待分析的組織可與其相應(yīng)的活體植物來(lái)源相關(guān)聯(lián)或相關(guān)，使得可基于組織分析的結(jié)果選擇相應(yīng)的活體植物來(lái)源。在一些實(shí)施方案中，特別是當(dāng)待分析的組織是用于母本譜系測(cè)定目的的果皮時(shí)，不需要相應(yīng)的活體植物來(lái)源。

獲得用于分子表征的遺傳物質(zhì)

在一個(gè)實(shí)施方案中，收集并且洗滌果皮組織；使用來(lái)自Miltenyi Biotec的gentleMACS^TM(或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于相同目的的任何其它方法)，將組織解離和勻化；并且將勻化溶液離心。發(fā)現(xiàn)與粒料相比，所得上清液包含大部分DNA，因此，DNA可直接用于分子分析，或進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，隨后進(jìn)行分子分析。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，收集并且洗滌果皮組織；使用來(lái)自Miltenyi Biotec的gentleMACS^TM(或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于相同目的的任何其它方法)，將組織解離和勻化；使用DNA提取方法(諸如但不限于或Extract-N-Amp^TM方法)，從包含于勻化溶液內(nèi)的細(xì)胞提取DNA；并且所述DNA可直接用于分子分析，或進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，隨后進(jìn)行分子分析。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，收集并且洗滌果皮組織；在液氮中破壞組織；使用DNA提取方法(諸如但不限于或Extract-N-Amp^TM方法)提取DNA；并且所述DNA可直接用于分子分析，或進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，隨后進(jìn)行分子分析。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，收集并且洗滌果皮組織；使用Extract-N-Amp^TM方法(或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的用于相同目的的任何其它方法)直接從洗滌組織中提取DNA；并且所述DNA可直接用于分子分析，或進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，隨后進(jìn)行分子分析。

果皮組織的洗滌減少了來(lái)自胚乳組織的潛在污染。在上文任何實(shí)施方案中，可用1％十二烷基硫酸鈉水溶液、水、乙醇或它們的混合物進(jìn)行洗滌。

在上文任何實(shí)施方案中，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何DNA提取方法。例如，如前所述，可使用(結(jié)合遺傳物質(zhì)的磁性顆粒，可從LGC Genomics購(gòu)得)或Extract-N-Amp^TM方法。在另一個(gè)示例中，可使用購(gòu)自Sigma-Aldrich Enzymatic的稱為Viscozyme L(參見(jiàn)Sigma Aldrich產(chǎn)品目錄)的酶促DNA提取方法，從組織中提取遺傳物質(zhì)。

分子表征來(lái)自果皮的遺傳物質(zhì)

全基因組擴(kuò)增是用于整個(gè)基因組的穩(wěn)健擴(kuò)增方法，從納克量的DNA開(kāi)始，并且產(chǎn)生微克量的擴(kuò)增產(chǎn)物。全基因組擴(kuò)增已成為保存珍貴儲(chǔ)備材料的有限樣品的非常有價(jià)值方法，特別是當(dāng)使用已經(jīng)開(kāi)發(fā)用于從單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增材料的全基因組擴(kuò)增方法時(shí)。在本文所述的一些實(shí)施方案中，可在分子分析之前進(jìn)行全基因組擴(kuò)增以獲得足夠的DNA收率。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法可用于分子表征來(lái)自果皮的遺傳物質(zhì)。示例包括但不限于Qiagen REPLI-g和Sigma-Aldrich SeqPlex試劑盒。

其它可用的分子表征可涉及將從種子提取的果皮的全部或部分基因組測(cè)序，或使用分子標(biāo)記和熒光探針進(jìn)行基因分型。分子分析不需要關(guān)注所提取組織的基因型，而是可測(cè)量其它性質(zhì)，諸如：表觀基因組譜、蛋白質(zhì)組譜、代謝分布、油含量、油組成、或者在組織中存在或不存在特定分子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)考慮來(lái)自多個(gè)種子的果皮組織的基因型數(shù)據(jù)(或來(lái)自相同的一個(gè)或多個(gè)種子的組織的多次提取)，產(chǎn)生母本共有基因型，每個(gè)單獨(dú)的組織樣本是平行測(cè)定的。在鑒定基因組中跨多個(gè)位置的多個(gè)核苷酸的基因分型實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于任何具體實(shí)驗(yàn)而言，無(wú)法識(shí)別一個(gè)或多個(gè)待鑒定的核苷酸并不罕見(jiàn)。因此，可為每個(gè)樣本記錄每個(gè)位置的缺失或無(wú)效的核苷酸鑒定。如果來(lái)自僅一個(gè)樣本的核苷酸鑒定可用于特定核苷酸位置，則該核苷酸鑒定被指定為該位置的共有數(shù)據(jù)。如果兩個(gè)或更多個(gè)核苷酸鑒定可用于特定核苷酸位置，則該位置的大多數(shù)核苷酸同一性被指定為該位置的共有數(shù)據(jù)。如果對(duì)于位置不存在多數(shù)識(shí)別，則將該位置指定為共有基因型的缺失數(shù)據(jù)。

盡管本文提供的示例涉及從單子葉植物(特別是玉米)獲得果皮組織并且對(duì)其進(jìn)行基因分型，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解如何將相同或相似的方法應(yīng)用于來(lái)自其它單子葉植物和雙子葉植物的母本種子組織。所述方法可適用于其種子包括母本組織的任何植物。例如，植物可包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、低芥酸菜籽、小麥、苜蓿、棉花、稻、大麥、粟、甘蔗、或柳枝稷。此外，本文公開(kāi)的基因分型方法可用于將任何植物組織進(jìn)行基因分型。共有基因分型方法也可用于對(duì)從任何來(lái)源獲得的任何遺傳物質(zhì)的多個(gè)樣品產(chǎn)生共有基因型，而不偏離所公開(kāi)的步驟。

實(shí)施例：果皮基因分型

A.果皮剝離

將玉米谷粒在去離子水中浸泡60分鐘。使用小珠滅菌器將手術(shù)刀刀片消毒。使用手術(shù)刀在尖端附近切割種子的背面(遠(yuǎn)離胚芽)，如圖1a中所示。再次使用小珠滅菌器將手術(shù)刀滅菌，并且在無(wú)菌水中冷卻。然后使用手術(shù)刀沿著谷粒的外邊緣切割，如圖1b中所示。將鑷子在小珠滅菌器中滅菌，冷卻，然后用于從谷粒剝離果皮，如圖1c中所示。然后將來(lái)自每個(gè)谷粒的果皮組織放置于微量離心管中。

B.果皮洗滌

測(cè)試三種不同的洗滌溶液。使用1％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液洗滌獲得最佳結(jié)果，然而使用水和乙醇可獲得足夠的結(jié)果。使用超聲處理的另選的洗滌方法也給出了足夠的結(jié)果。所用的洗滌方案通過(guò)向微量離心管中加入1mL洗滌溶液開(kāi)始，將其置于反相器中1分鐘。除去洗滌溶液，并且用1mL新鮮洗滌溶液替換，然后將微量離心管再次置于反相器中，這次4分鐘。然后去除果皮組織，用蒸餾水沖洗，并且置于新的微量離心管中。超聲處理方案將果皮組織在超聲波破碎儀中放置1分鐘。然后取出組織，用蒸餾水沖洗，并且置于新的微量離心管中。

C.獲得DNA

測(cè)試獲得DNA的五種方法。使用gentleMACS^TM方案，用水或TE上清液實(shí)現(xiàn)最佳結(jié)果。

gentleMACS^TM/水或TE上清液：在該方法中，將果皮組織直接放置于gentleMACS^TMM管的轉(zhuǎn)子上。將300μl水或TE緩沖液加入到管中，然后將其密閉并且置于gentleMACS^TM儀器中。運(yùn)行自動(dòng)化程序“Protein_01.01”。對(duì)于未完全解離的果皮組織，進(jìn)行進(jìn)一步混合并且運(yùn)行自動(dòng)化程序。接著，使混合物在GentleMACS^TM管中旋降，并且轉(zhuǎn)移至新的1.5ml Eppendorf管中。然后將Eppendorf管以14000rpm離心2分鐘，并且將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml Eppendorf管中用于分子分析。在該方法中不需要DNA的提取。

GentleMACS^TM在該方法中，將果皮組織直接放置于gentleMACS^TM M管的轉(zhuǎn)子上。向管中加入300μL的裂解緩沖液PN，然后將其密閉并且放置于gentleMACS^TM儀器中。運(yùn)行自動(dòng)化程序“Protein_01.01”。對(duì)于未完全解離的果皮組織，進(jìn)行進(jìn)一步混合并且運(yùn)行自動(dòng)化程序。接著，將混合物離心，并且在65℃下培養(yǎng)1小時(shí)，偶爾攪拌。將360μL粘結(jié)緩沖液PN和30μL顆粒加入到新的1.5mL Eppendorf管中。將具有果皮組織的管離心，并且將裂解物轉(zhuǎn)移到新管中。然后將這些在室溫下培養(yǎng)4分鐘，以使DNA結(jié)合到顆粒上。接著將管短暫渦旋，然后放置在磁架中以將小珠濃縮。除去裂解緩沖液，并且向每個(gè)管中加入600μL洗滌緩沖液PN1，并且使小珠重新懸浮。將管再次放置在磁架中以濃縮小珠，并且除去洗滌緩沖液PN1。使用600μL洗滌緩沖液PN2重復(fù)該洗滌過(guò)程，然后使用600μL純水再次重復(fù)。在該第三洗滌步驟后，加入40μL洗脫緩沖液PN，并且將管在55℃下培養(yǎng)20分鐘，并且每3分鐘渦旋振蕩。使用磁性板濃縮小珠，并且將洗脫液轉(zhuǎn)移到新管中，然后在-20℃下儲(chǔ)存直至分子表征。

gentleMACS^TM/Extract-N-Amp^TM：在該方法中，將果皮組織再次直接放置在gentleMACS^TMM管的轉(zhuǎn)子上。將300μL無(wú)菌水加入到管中，然后將其密閉并且放置于gentleMACS^TM儀器中。運(yùn)行自動(dòng)化程序“Protein_01.01”。對(duì)于未完全解離的果皮組織，進(jìn)行進(jìn)一步混合并且運(yùn)行自動(dòng)化程序。將勻漿轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管中，并且在10,000rpm下離心1分鐘。除去上清液，而不干擾管底部的組織粒料。加入30μL提取溶液/種子制備溶液混合物(Sigma-Aldrich Extract-N-Amp^TMSeed PCR試劑盒)，并且將所得混合物充分混合。將所述混合物轉(zhuǎn)移到用于熱循環(huán)儀上的PCR條管中，其被程序化設(shè)定為在55℃下保持10分鐘，然后在95℃下保持3分鐘，然后無(wú)限期保持在4℃下。加入30μL中和溶液B。

液氮/將1.5mL微量離心管杵放置在液氮中冷卻。將果皮組織與冷卻的管杵一起放置于微量離心管中，并且將整個(gè)管放置于液氮中。將液氮加入到管中。使用管杵將果皮組織緩慢并且充分地研磨。將管偶爾浸回到液氮中，以保持組織冷卻。研磨后，向每個(gè)管中加入90μL裂解緩沖液PN，然后將其短暫離心，接著在65℃下培養(yǎng)1小時(shí)。將120μL粘結(jié)緩沖液PN和10μL的顆粒加入到新管中，并且將來(lái)自研磨步驟的裂解物加入到新管中。然后將這些在室溫下培養(yǎng)4分鐘，以使DNA結(jié)合到顆粒上。然后將混合物短暫渦旋，并且放置在磁架中以濃縮小珠。除去裂解緩沖液，并且向每個(gè)管中加入200μL洗滌緩沖液PN1，并且使小珠重新懸浮。將管再次放置在磁架中以濃縮小珠，并且除去洗滌緩沖液PN1。使用200μL洗滌緩沖液PN2重復(fù)該洗滌過(guò)程，然后使用200μL純水再次重復(fù)。在該第三洗滌步驟后，加入20μL洗脫緩沖液PN，并且將管在55℃下培養(yǎng)10分鐘，并且每3分鐘渦旋振蕩。使用磁性板濃縮小珠，并且將洗脫液轉(zhuǎn)移到新管中，然后在-20℃下儲(chǔ)存直至分子表征。

Extract-N-Amp^TM：制備18份提取溶液和2份種子制備溶液的主混合物，并且將20μL溶液加入到0.2mL PCR條管內(nèi)的果皮組織中。將混合物在設(shè)定為55℃的熱循環(huán)儀中放置10分鐘，在95℃下放置3分鐘，然后無(wú)限期地在4℃下放置。加入20.0μL中和溶液B，并且將混合物的液體部分轉(zhuǎn)移到1.5mL的新微量離心管中。

D.分子測(cè)試

dsDNA HS檢測(cè)試劑盒：將試劑以1∶200的比率稀釋到緩沖液中以制備工作溶液。將1μL步驟2B的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至測(cè)定管和199μL工作溶液中。通過(guò)將10μL標(biāo)準(zhǔn)物加入到190μL的工作溶液中，制備標(biāo)準(zhǔn)物。將PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)物渦旋2-3秒，然后短暫離心。然后將管在室溫下培養(yǎng)2分鐘。然后將管插入2.0熒光計(jì)中，并且記錄讀數(shù)。

全基因組擴(kuò)增(Seqplex)：全基因組擴(kuò)增的優(yōu)選方法是使用Seqplex增強(qiáng)DNA擴(kuò)增試劑盒的Seqplex方法。向1μL的步驟C中產(chǎn)生的每種DNA溶液中，加入2μL文庫(kù)制備緩沖液和11μL純水。將溶液離心，渦旋，并且再次離心，在95℃熱循環(huán)儀上培養(yǎng)2分鐘，然后保持在4℃。冷卻后，加入1μL文庫(kù)制備酶。將溶液離心，渦旋并且再次離心，然后在16℃熱循環(huán)儀上培養(yǎng)20分鐘，在24℃下培養(yǎng)20分鐘，在37℃下培養(yǎng)20分鐘，在75℃下培養(yǎng)5分鐘，然后保持在4℃下。將溶液短暫離心。將15μL該溶液加入到以1∶1000稀釋的15μL的5x擴(kuò)增混合物(A5112)、1.5μL用于SeqPlex的DNA聚合酶(SP300)、42.5μL無(wú)菌水(W4502)和1μL的SYBR Green(S9403)中。將該溶液充分混合，并且將每種反應(yīng)混合物在384孔板上分成5份15μL等分試樣。擴(kuò)增熱循環(huán)開(kāi)始于94℃下初始變性2分鐘，隨后進(jìn)行足夠數(shù)目的循環(huán)以達(dá)到2-3個(gè)循環(huán)進(jìn)入平臺(tái)(通常約24個(gè)循環(huán))：94℃下變性15秒，70℃下退火/延伸5分鐘，讀取熒光，重復(fù)。循環(huán)后，將反應(yīng)混合物在70℃下保持30分鐘，然后保持在4℃。冷卻后，通過(guò)QIAquick PCR純化來(lái)純化樣品。

全基因組擴(kuò)增(REPLI-g單細(xì)胞試劑盒)：通過(guò)加入3.5μL重構(gòu)緩沖液DLB和12.5μL無(wú)核酸酶的水，制備變性緩沖液D1。通過(guò)加入4.5μL終止溶液和25.5μL不含核酸酶的水，制備中和緩沖液N1。將2.5μL變性緩沖液加入到步驟C中制得的各2.5μL的DNA溶液等分試樣中。將該溶液在室溫下培養(yǎng)3分鐘。加入5.0μL中和緩沖液N1，并且渦旋該溶液，然后短暫離心。用每份反應(yīng)9.0μL無(wú)核酸酶的水、29.0μL的REPLI-g反應(yīng)緩沖液和2.0μL的REPLI-g DNA聚合酶，制備主混合物。將40.0μL該主混合物加入到各溶液中，然后將其在30℃熱循環(huán)儀上運(yùn)行8小時(shí)，然后冷卻至4℃。

使用檢測(cè)來(lái)評(píng)估全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物，以確定DNA的收率。

基因分型測(cè)定。成功使用高密度標(biāo)記(3072X芯片)和Taqman標(biāo)記分析，對(duì)本實(shí)施例中描述的遺傳材料進(jìn)行基因分型。展示前述技術(shù)有效性的數(shù)據(jù)示于圖2-4中。圖2比較了使用DNA提取方法獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量與使用全基因組擴(kuò)增獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量。雖然兩種方法均給出可接受的結(jié)果，但是全基因組擴(kuò)增方法給出了優(yōu)選的結(jié)果，其中三個(gè)單倍型中的每一個(gè)均被充分解析。圖3是熒光標(biāo)記散布圖，展示可從單個(gè)果皮組織樣品獲得優(yōu)質(zhì)熒光標(biāo)記數(shù)據(jù)。事實(shí)上，本發(fā)明的方法允許使用許多標(biāo)記(數(shù)十或潛在的數(shù)百種)，使用從單個(gè)種子提取的果皮組織進(jìn)行基因分型。由于從單個(gè)種子提取的果皮組織的測(cè)量基因型(每條線)和已知母本基因型之間的高度相似性，圖4展示了本發(fā)明方法的可靠性。