Cyp2f1基因在骨關(guān)節(jié)炎診治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及人CYP2F1基因在骨關(guān)節(jié)炎的診斷、治療中 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨關(guān)節(jié)炎（Osterarthritis，0A)也稱(chēng)為退行性關(guān)節(jié)炎，是在老年人和肥胖者中最 普遍的疾病。0A是關(guān)節(jié)的疾病，但不同于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)，這種疾病不是系統(tǒng)性的，通 常只影響一個(gè)或數(shù)個(gè)關(guān)節(jié)。這種疾病導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的總的破壞，下方骨頭的硬化，和骨贅形 成，造成運(yùn)動(dòng)能力喪失和疼痛。最終的結(jié)果往往是需要全關(guān)節(jié)置換。
[0003] 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)趨勢(shì)表明，到2020年，受關(guān)節(jié)疾病影響的人群將增加到50%，全世界 將有5. 7億人受到骨關(guān)節(jié)炎的困擾。我國(guó)社會(huì)逐漸進(jìn)入老齡化社會(huì)，因此我們將面臨骨關(guān) 節(jié)炎發(fā)病的普遍流行時(shí)期。對(duì)該病的研究十分重要和迫切。
[0004] 骨關(guān)節(jié)炎的原發(fā)異常可以發(fā)生在關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨、韌帶或關(guān)節(jié)周?chē)纳?經(jīng)肌肉組織。關(guān)節(jié)軟骨的損害是骨關(guān)節(jié)炎最明顯的變化。關(guān)節(jié)軟骨喪失是骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵 病變。隨著蛋白聚糖含量的下降，關(guān)節(jié)軟骨逐漸緩慢降解。由于骨關(guān)節(jié)炎患者的蛋白聚糖、 膠原和透明質(zhì)酸合成速率均增加，使得組織的分解代謝活性特別高。通常認(rèn)為，蛋白溶解酶 和中性金屬蛋白酶在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨丟失中是最重要的原因。關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)沒(méi)有血管 和神經(jīng)，對(duì)創(chuàng)傷、炎癥的反應(yīng)是由關(guān)節(jié)軟骨、滑膜組織或關(guān)節(jié)液中的蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子等介 導(dǎo)的?；?duì)于維持關(guān)節(jié)的正常功能，并且在骨關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的 作用。
[0005] 目前臨床上對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的診斷主要基于影像學(xué)的檢查。X線表現(xiàn)主要為關(guān)節(jié)間 隙狹窄，軟骨下骨質(zhì)硬化及囊性變，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成，關(guān)節(jié)面萎陷、變形和關(guān)節(jié)半脫位等。 MRI可示早期軟骨、半月板等關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病變，有利于早期診斷。CT用于椎間盤(pán)病的診斷， 優(yōu)于X線。關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化，邊緣性骨刺脊椎關(guān)節(jié)連成骨橋。亦可見(jiàn)骨囊腫以 及畸形。如發(fā)現(xiàn)這些變化可作為診斷的依據(jù)和估計(jì)關(guān)節(jié)損傷的程度。0A-般在早期沒(méi)有或 很少有癥狀，只在繼發(fā)炎癥、疼痛或影響關(guān)節(jié)的活動(dòng)時(shí)，病人才找醫(yī)生。此時(shí)，關(guān)節(jié)損傷發(fā)生 已久。因?yàn)殚_(kāi)發(fā)用于早期骨關(guān)節(jié)炎診斷的方法是亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于骨關(guān)節(jié)炎 (Osterarthritis，0A)早期診斷的分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的骨關(guān)節(jié)炎的診斷方法，使用基 因標(biāo)志物來(lái)診斷骨關(guān)節(jié)炎的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就能知 曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種人CYP2F1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品中的 應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步，上面所提到的診斷產(chǎn)品包括：通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位 雜交或芯片檢測(cè)CYP2F1基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平以診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品。
[0010] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增CYP2F1基因 的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增CYP2F1基因的引 物；所述用免疫檢測(cè)診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與CYP2F1蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用 原位雜交診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：與CYP2F1基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診 斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與CYP2F1蛋白特異性 結(jié)合的抗體，基因芯片包括與CYP2F1基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒。
[0012] 本發(fā)明還提供了人CYP2F1基因在高通量測(cè)序平臺(tái)中的應(yīng)用。隨著高通量測(cè)序技 術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正 常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知 人CYP2F1基因的異常與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)也屬于人CYP2F1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù) 范圍之內(nèi)。
[0013] 本發(fā)明還提供了人CYP2F1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在制備治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng) 用。
[0014] 本發(fā)明所述的"治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物"的主要活性成分包括抑制CYP2F1基因表達(dá) 的物質(zhì)、抑制CYP2F1基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制CYP2F1基因表達(dá)產(chǎn)物活性的 物質(zhì)。
[0015] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物包括：通過(guò)干擾RNA抑制CYP2F1基因 表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于CYP2F1抗原蛋白的腫瘤疫苗、或用于抑制CYP2F1蛋白活性的 蛋白質(zhì)。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，所述藥物組合物包含 CYP2F1基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物抑制劑。所述抑制劑包括抑制CYP2F1基因表達(dá)的物質(zhì)、抑制 CYP2F1基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的物質(zhì)、和/或抑制CYP2F1基因表達(dá)產(chǎn)物活性的物質(zhì)。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述抑制劑包括：通過(guò)干擾RNA抑制CYP2F1基因表達(dá)的雙鏈核糖 核酸，或基于CYP2F1抗原蛋白的腫瘤疫苗、或用于抑制CYP2F1蛋白活性的蛋白質(zhì)。
[0018] 本發(fā)明還提供了上述CYP2F1基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物抑制劑在制備治療骨關(guān)節(jié)炎 藥物中的應(yīng)用。
[0019] 在本發(fā)明中，所述RNA干擾（RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保 守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn) 象。使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于探索基因 功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的RNAi篩選在功能基因?qū)W 研究方面具有許多優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型都能使用RNAi方法，并且相對(duì)較容易 下調(diào)或沉默任何目的基因的表達(dá)。
[0020] 為了確保CYP2F1基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)CYP2F1基因的mRNA序列設(shè)計(jì) 了siRNA特異性片段。siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則（Elbashir et. al 2001， Schwarz et.al 2003，Khvorova et. al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et. al 2004， Ui-Tei et.al 2004)，通過(guò)在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為：
[0021] siRNASelectionProgram of Whitehead Institute (BingbingYuan et. al 2004， http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和 BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sul1ivan Excellence in Research Award, https://rnaidesigner. invitrogen. com/sirna/)。為了進(jìn)一步提高 siRNA 片斷的有效性， 綜合兩個(gè)在線設(shè)計(jì)工具的優(yōu)點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)用于篩選的siRNA片斷。最后，通過(guò)同源性比對(duì)（NCBI BLAST)來(lái)過(guò)濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi干擾的脫靶效應(yīng)。
[0022] 本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，這類(lèi)載體包括（但并不限于）： 稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚 乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑季銨化合 物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和 鎂、聚乙二醇等。
[0023] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大 提到治療的成功率。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種診斷骨關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括但不限于芯片、試劑盒。
[0025] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固 定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)CYP2F1基因轉(zhuǎn)錄水平的 針對(duì)CYP2F1基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的 CYP2F1蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測(cè)包括人CYP2F1基因在內(nèi)的多個(gè)基 因（例如，與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括人 CYP2F1蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將 多個(gè)與骨關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高骨關(guān)節(jié)炎診斷的準(zhǔn)確率。
[0026] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)CYP2F1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括CYP2F1蛋 白的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或 芯片方法檢測(cè)CYP2F1基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)CYP2F1 基因的引物和/或探針。根據(jù)CYP2F1基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè) CYP2F1基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0027] 與CYP2F1基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或 其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述 探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針 長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影