一種水稻CYP81A6基因突變體CYP81A6-m2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種水稻CYP81A6基因突變體 CYP81A6-m2及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國(guó)的核心糧食作物，雜交水稻對(duì)提高我國(guó)糧食產(chǎn)量發(fā)揮了重要作用。雜 交水稻具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象，目前我國(guó)雜交水稻累計(jì)種植面積超過(guò)45億畝，雜交水稻 種植面積已經(jīng)占到全國(guó)水稻種植面積的55 %左右。雜交水稻可分為三系法雜交稻和兩系 法雜交稻。我國(guó)雜交水稻制種效率不高，主要表現(xiàn)在勞動(dòng)強(qiáng)度大，種子產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定等 方面。因此實(shí)現(xiàn)雜交水稻制種全程機(jī)械化是進(jìn)一步提升我國(guó)雜交水稻生產(chǎn)的必由之路。目 前，已經(jīng)嘗試了下列方法：1)機(jī)械采粉-貯藏-授粉技術(shù)。利用機(jī)械采集父本花粉，直接或 經(jīng)貯藏然后對(duì)母本授粉。2)父本為雌性不育，實(shí)現(xiàn)父母本混播混收機(jī)械化。3)種子顏色標(biāo) 記法。通過(guò)選育使父母本種子顏色不同，混播群體收獲后，通過(guò)色選機(jī)將母本的雜交種與父 本的自交種子分離。4)利用除草劑清除混雜種子。這又包括兩條途徑，一是將抗除草劑基 因通過(guò)轉(zhuǎn)基因?qū)肽副静挥?，使其?duì)除草劑產(chǎn)生抗性。將母本與父本混播以產(chǎn)生雜交種 子，授粉后用母本可抗的除草劑進(jìn)行田間噴施處理，將父本選擇性殺死，收獲的種子即是雜 交后代。這一方法受轉(zhuǎn)基因法規(guī)制約，故尚未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。另一途徑是將除草劑敏感突變 基因?qū)敫副荆垢副舅緦?duì)某種除草劑敏感。將母本與父本混播以產(chǎn)生雜交種子，授粉后 用父本敏感的除草劑進(jìn)行田間處理，將父本水稻選擇性殺死。這一方法不受轉(zhuǎn)基因法規(guī)制 約，具有較好的應(yīng)用前景。
[0003] 野生型 CYP81A6 基因（GenBank:DQ 341412. 1)全長(zhǎng) 3914bp，其結(jié)構(gòu)包括 1321bp 的 啟動(dòng)子序列，53bp的5'非翻譯區(qū)（5' -UTR)，2268bp的編碼區(qū)以及272bp的3' -UTR。編碼 區(qū)包含兩個(gè)外顯子（長(zhǎng)度分別為924bp和618bp)和一個(gè)內(nèi)含子（長(zhǎng)度為726bp)，編碼513 個(gè)氨基酸，屬于細(xì)胞色素 P450基因家族。盡管目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)十個(gè)細(xì)胞色素 P450晶體結(jié)構(gòu) 顯示不同種屬間的序列差異較大，但其三維結(jié)構(gòu)高度保守（王斌，李德遠(yuǎn)（2009)細(xì)胞色 素 P450的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理.有機(jī)化學(xué)29:658-662)。細(xì)胞色素 P450的主要結(jié)構(gòu)功能域包 括：底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和亞鐵血紅素（HEM)結(jié)合及催化結(jié)構(gòu)域。其中，由于細(xì)胞色素 P450是 以硫醇鹽結(jié)合血紅素為活性中心催化氧原子轉(zhuǎn)移的氧化還原酶，故亞鐵血紅素結(jié)合及催化 結(jié)構(gòu)域在行使其活性功能時(shí)，HEM的鐵離子一側(cè)與絕對(duì)保守的半胱氨酸的硫絡(luò)合，形成硫醇 鹽離子鍵，成為鐵的一個(gè)配體；另一側(cè)可與水中的氧分子絡(luò)合，形成亞鐵P450-二氧復(fù)合物 (P-Fe (II) -02)。P-Fe (II) -02經(jīng)第二個(gè)單電子還原和質(zhì)子化，形成Fe (III)-氫過(guò)氧化復(fù)合 物（P-Fe(III)-O-OH)，進(jìn)一步自催化形成高價(jià)鐵氧中間體（P*Fe(IV) =0)，該氧鐵卟啉陽(yáng) 離子自由基，即能提供單電子，又含正電荷，提供活性氧原子，在水溶液中能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)移氧 原子，插入到惰性的C-H鍵中，實(shí)現(xiàn)溫和條件下烴的羥基化，此為單加氧方式；另外一種方 式是高價(jià)鐵氧中間體P *Fe (IV) = 0直接對(duì)底物氧化脫氫，而不是在C-H鍵上插入氧，該方 式為氧化脫氫方式。無(wú)論那種方式均依賴亞鐵血紅素（HEM)結(jié)合及催化結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜镞M(jìn)行 氧化，該結(jié)構(gòu)域核心區(qū)域如圖4中黑色方框所示（FGMGRRRCPG)(張集文，2010,水稻苯達(dá)松 敏感突變研宄進(jìn)展.中國(guó)水稻科學(xué)24:551-558)。
[0004] 苯達(dá)松為苯并噻二唑類(lèi)除草劑，可殺死多數(shù)闊類(lèi)葉雜草和莎草科雜草，而對(duì)包括 水稻在內(nèi)的禾本科和豆科植物十分安全。其作用機(jī)理是抑制植物光合作用的希爾反應(yīng)。其 選擇性是因?yàn)椴煌N類(lèi)植物分解苯達(dá)松的能力存在差異。正常水稻品種可將苯達(dá)松快速代 謝為羥基化的無(wú)毒產(chǎn)物。經(jīng)輻射誘變，在水稻品種農(nóng)林8號(hào)（N8)和W6154S上獲得了兩個(gè) 苯達(dá)松敏感的突變體，農(nóng)林8號(hào)m(N8m)和8077S。農(nóng)林8號(hào)m的致死濃度為5mg/L，8077S 的致死濃度為313mg/L，前者比后者敏感60倍，而正常水稻品種用2500mg/L苯達(dá)松處理未 表現(xiàn)明顯傷害。遺傳研宄表明農(nóng)林8號(hào)m突變位點(diǎn)和8077S突變位點(diǎn)為等位基因，其敏感 致死表型由同一個(gè)bsl基因控制。野生型的bsl是一個(gè)P450基因（CYP81A6)，其編碼區(qū)長(zhǎng) 度為2268bp，含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，編碼一個(gè)由513個(gè)氨基酸組成的酶。其在農(nóng) 林8號(hào)m中，在翻譯起始密碼ATG后第507位點(diǎn)，缺失了一個(gè)C，這一突變發(fā)生在第一外顯子 上，導(dǎo)致其編碼的蛋白大部分氨基酸缺失，因而完全喪失生化功能。在8077S中，突變發(fā)生 在翻譯起始密碼ATG后第2058位點(diǎn)，缺失了一個(gè)G，這一突變發(fā)生在第二個(gè)外顯子靠近3' 端。導(dǎo)致其編碼的酶蛋白缺失了 49個(gè)氨基酸，并使其第441~450位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域突變， 故使其基本喪失了生化功能（張集文（2010)水稻苯達(dá)松敏感突變研宄進(jìn)展.中國(guó)水稻科 學(xué)24:551-558)。但上述兩個(gè)突變體都只有Ibp的缺失，不能用實(shí)驗(yàn)室常用的瓊脂糖電泳檢 測(cè)，難以用于分子標(biāo)記輔助育種，需特殊的檢測(cè)單堿基突變的技術(shù)方法。另外，兩個(gè)突變體 中，秈稻來(lái)源的8077S對(duì)苯達(dá)松敏感性不高。因此，在水稻雜交制種實(shí)際應(yīng)用中，需要新的 對(duì)苯達(dá)松高度敏感的，易于進(jìn)行分子檢測(cè)和開(kāi)展分子標(biāo)記輔助育種的秈稻突變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供對(duì)苯達(dá)松高度敏感的水稻CYP81A6基因突變體CYP81A6-H12及 其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明首先對(duì)秈稻品種93-11種子（MO代）進(jìn)行鈷60輻射誘變處理，種植處理的 種子獲Ml代植株；Ml代植株自交產(chǎn)生種子（為M2代），種植M2代植株，對(duì)M2代植株進(jìn)行 苯達(dá)松處理，篩選敏感植株；然后對(duì)敏感植株進(jìn)行基因測(cè)序和DNA序列分析，在分子水平上 進(jìn)行驗(yàn)證。最后獲得對(duì)苯達(dá)松高度敏感純合單株，并用于雜交育種和生物技術(shù)研宄。
[0007] 本發(fā)明提供的水稻CYP81A6基因突變體CYP81A6-m2,其為水稻CYP81A6基因第二 個(gè)外顯子1747位處中缺失23個(gè)堿基，所述缺失的23個(gè)堿基為CCGAGATCGACGCATCCGTCGGC。
[0008] 進(jìn)一步地，水稻CYP81A6基因突變體CYP81A6-m2,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 不O
[0009] 本發(fā)明提供了含有本發(fā)明所述水稻CYP81A6基因突變體CYP81Α6-Π 12的表達(dá)載體。
[0010] 本發(fā)明提供了含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明提供了水稻CYP81A6基因突變體CYP8 lA6-m2在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明提供了水稻CYP81A6基因突變體CYP81A6-m2在制備對(duì)苯達(dá)松敏感的轉(zhuǎn)基 因植物中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選地，所述植物為水稻、玉米、小麥、棉花。
[0014] 本發(fā)明提供了水稻CYP81A6基因突變體CYP8lA6-m2在農(nóng)作物改良育種、制種中的 應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選地，所述農(nóng)作物為水稻、玉米、小麥、棉花。
[0016] 本發(fā)明提供了克隆水稻CYP81A6基因突變體CYP81A6-m2的方法，以水稻基因組 DNA為模板，分別以下述4對(duì)引物對(duì)進(jìn)行PCR，將4個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物依次拼接得到水稻CYP81A6 基因突變體CYP81A6-m2,所述4對(duì)引物對(duì)的核苷酸序列分別為：SEQ ID NO. 2-3和SEQ ID NO. 4-5 和 SEQ ID NO. 6-7 和 SEQ ID NO. 8-9。
[0017] 用SEQ ID NO. 2-3所示的引物對(duì)能夠擴(kuò)增出1314bp的水稻CYP81A6基因擴(kuò)增片 段，用SEQ ID NO. 4-5所示的引物能夠擴(kuò)增出1216bp的水稻CYP81A6基因擴(kuò)增片段，用 SEQ ID NO. 6-7所示的引物能夠擴(kuò)增出1377bp野生型水稻CYP81A6基因或1354bp的水稻 CYP81A6-m2基因擴(kuò)增片段，用SEQ ID NO. 8-9所示的引物能夠擴(kuò)增出796bp的水稻CYP81A6 基因擴(kuò)增片段。
[0018] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)水稻CYP81A6基因突變體CYP8 lA6-m2的分子標(biāo)記，該分子標(biāo) 記是由以下引物對(duì)擴(kuò)增得到，所述引物對(duì)的核苷酸序列為：
[0019] SEQ ID NO. 10-11 或 SEQ ID NO. 12-13 或
[0020] SEQ ID NO. 14-15 或 SEQ ID NO. 16-17。
[0021] 本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在檢測(cè)CYP81A6基因突變體CYP81A6-m2中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在制備對(duì)苯達(dá)松敏感的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。
[0024] -種水稻CYP81A6基因突變體CYP81A6-m2的分子標(biāo)記的方法，通過(guò)下述之一的引 物對(duì)擴(kuò)增待檢植物基因組DNA，并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物：
[0025] 所述引物對(duì)的核苷酸序列為：SEQ ID NO. 10-11或SEQ ID NO. 12-13或SEQ ID NO. 14-15 或 SEQ ID NO. 16-17 ;
[0026] 如果用SEQ ID NO. 10-11所示的引物對(duì)能夠擴(kuò)增出270bp的擴(kuò)增片段，或者用SEQ ID NO. 12-13所示的引物對(duì)能夠擴(kuò)增出83bp的擴(kuò)增片段，或者用SEQ ID