專利名稱：湖北海棠MhSGT1a基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及湖北海棠MhSGTla基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)遭遇多種逆境條件的脅迫，通過(guò)對(duì)植物抗逆反應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)SGTl基因是植物抗病抗逆信號(hào)傳遞過(guò)程的重要調(diào)控基因。SGTl (suppressor of G2 alleleof Skpl)起先發(fā)現(xiàn)于酵母細(xì)胞，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)存在于動(dòng)物和一 些微生物中，不久前才發(fā)現(xiàn)植物中也存在與酵母同源的SGTl基因。酵母中SGTl是細(xì)胞周期抑制子Skpl的等位基因，它和Skpl 一樣，其蛋白能作用于細(xì)胞周期中G1/S和G2/S間期(Kitagawa et al.，1999)。Azevedo等(2002)發(fā)現(xiàn)在擬南芥中存在兩種不同形式的SGTl :SGTla和SGTlb，但只有SGTlb在傳導(dǎo)防衛(wèi)信號(hào)過(guò)程中有重要作用(Azevedo et al. , 2002 ；Austin et al. , 2002 ；Tor et al. , 2002) 0并且與酵母中的作用不同，擬南芥SGTlb突變體并不表現(xiàn)有絲分裂的不規(guī)則性，SGTlb突變體也可以成活，這可能是因?yàn)镾GTla能夠補(bǔ)償SGTlb的功能，在非允許生長(zhǎng)溫度下，擬南芥AtSGTla與AtSGTlb能夠彌補(bǔ)酵母溫度敏感SGTlb突變體的功能。然而對(duì)果樹(shù)中的SGTla和SGTlb卻少有報(bào)道，而蘋(píng)果中的SGTla尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)它們的相互關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。果樹(shù)生命周期長(zhǎng)，生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中常受到多種環(huán)境脅迫影響，面對(duì)不斷惡化的生態(tài)環(huán)境，為從根本上解決低溫、干旱和鹽堿等非生物脅迫對(duì)果樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的不良影響，培育抗逆性強(qiáng)的果樹(shù)品種是中國(guó)果樹(shù)育種研究的一個(gè)重要方向。但由于果樹(shù)童期長(zhǎng)、自交不親和、雜合程度高等原因，通過(guò)常規(guī)雜交育種對(duì)其改良相當(dāng)困難，而采用遺傳轉(zhuǎn)化的手段則可克服上述缺點(diǎn)，打破生殖隔離，在向現(xiàn)有品種引進(jìn)期望性狀的同時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)基因的大量重組，也避開(kāi)了童期的干擾。如轉(zhuǎn)SOD基因的葡萄和轉(zhuǎn)CBFl基因的草莓在田間試驗(yàn)中均表現(xiàn)出比未轉(zhuǎn)化植株具有更強(qiáng)的抗冷能力(Christopher OL et al.，2002),通過(guò)促進(jìn)甜菜堿或山梨醇的積累也獲得了抗鹽的轉(zhuǎn)基因柿和草莓植株(Gao M et al. , 2000,2001 ;劉鳳華等，1997)，Cervera等(2000)將酵母HAL2基因?qū)敫涕僖搏@得了抗鹽植株。柑橘在冷脅迫條件下會(huì)產(chǎn)生大量乙烯，導(dǎo)致葉片脫落，嚴(yán)重影響了植株的生長(zhǎng)和發(fā)育。香港大學(xué)的Wong等(2001)從冷誘導(dǎo)的柑橘中分離出ACC合成酶基因(CS-ACSl)并將其反義導(dǎo)入甜橙和枳，轉(zhuǎn)化植株經(jīng)冷激后產(chǎn)生大量反義RNA，與此同時(shí)ACC含量升高受到抑制，乙烯生成減少，消除了冷誘導(dǎo)乙烯對(duì)果實(shí)留樹(shù)和貯藏的不利影響?？傮w來(lái)看，中國(guó)果樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究已經(jīng)進(jìn)入國(guó)際先進(jìn)行列，在抗病、抗蟲(chóng)、抗逆性等轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，但是對(duì)于中國(guó)未來(lái)轉(zhuǎn)基因果樹(shù)研究影響最大的是中國(guó)克隆的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的功能基因較少，往往是一個(gè)基因在十幾個(gè)物種中開(kāi)展遺傳轉(zhuǎn)化；此外遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，也在一定程度上制約了中國(guó)轉(zhuǎn)基因果樹(shù)研究取得更大進(jìn)展。因此，當(dāng)前的研究重點(diǎn)應(yīng)放在利用中國(guó)豐富的果樹(shù)種質(zhì)資源克隆果樹(shù)自身重要功能基因，提高基因轉(zhuǎn)化效率以及開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因新技術(shù)上。‘湖北海棠’[Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.]是中國(guó)特有的種質(zhì)資源，由于其抗逆性較強(qiáng)，被廣泛用作蘋(píng)果砧木。從湖北海棠上克隆相關(guān)抗逆基因?qū)胩O(píng)果，因兩者具有較高同源性故可提高其轉(zhuǎn)化效率，開(kāi)發(fā)具有中國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的果樹(shù)抗逆基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)新的‘湖北海棠’ MhSGTla基因。本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)‘湖北海棠’ MhSGTla基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. I。含有所述的MhSGTla基因的重組表達(dá)載體。 所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選將所述的MhSGTla基因插入到表達(dá)載體PCAMBIA-S1300+的SpeI和KpnI切酶切位點(diǎn)之間所得。含有所述的MhSGTla基因的宿主。所述的宿主優(yōu)選農(nóng)桿菌。所述的MhSGTla基因在創(chuàng)制耐低溫新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。所述的含有MhSGTla基因的重組表達(dá)載體在創(chuàng)制耐低溫新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明首次從‘湖北海棠’克隆得到了一個(gè)新的MhSGTla基因，通過(guò)DNAMAN軟件將‘湖北海棠’ MhSGTla氨基酸序列與NCBI上登錄的其它物種進(jìn)行序列比對(duì)，MhSGTla與大麥、煙草、水稻、馬鈴薯、小麥、中間偃麥草、擬南芥的同源性分別為66. 34%,71%,63. 59%、69. 38%,61. 36%,62. 93%和62. 98%。MhSGTla在植物中過(guò)量表達(dá)；在植物受到低溫脅迫時(shí)，過(guò)量表達(dá)的MhSGTla可誘導(dǎo)NtRbohD基因、NtDREB基因在植株中高水平表達(dá)、增強(qiáng)NtPINl基因和NtSOD基因表達(dá)、短暫增強(qiáng)NtSPS的表達(dá)水平，從而共同抵御脅迫。MhSGTla轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的抵御低溫脅迫的能力，植株可在4°C低溫條件下正常生長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)24h，同時(shí)也證明了 MhSGTla基因具有提高植物抗寒能力的功能。


圖I轉(zhuǎn)MhSGTla基因煙草PCR檢測(cè)其中M表示marker，WT表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏琀2O表示陰性對(duì)照(水)，P表示陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒)，A1-A20表示MhSGTla轉(zhuǎn)基因煙草株系圖2轉(zhuǎn)MhSGTla基因煙草RT-PCR檢測(cè)其中M表示marker，WT表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?，H2O表示陰性對(duì)照(水)，P表示陽(yáng)性對(duì)照(質(zhì)粒)，A1-A7表示MhSGTla轉(zhuǎn)基因煙草株系圖3 4°C處理不同時(shí)間后煙草的表型觀察。圖4轉(zhuǎn)基因煙草中4°C處理不同時(shí)間后MhSGTla基因的表達(dá)差異。圖5野生煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(MhSGTla) 4°C處理不同時(shí)間后NtRbohD基因的表達(dá)差異其中，WT表示野生型煙草，MhSGTla表示轉(zhuǎn)MhSGTla基因煙草。圖6野生煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(MhSGTla)4°C處理不同時(shí)間后NtPINl基因的表達(dá)差異其中，WT表示野生型煙草，MhSGTla表示轉(zhuǎn)MhSGTla基因煙草。圖7野生煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(MhSGTla)4°C處理不同時(shí)間后NtDREB基因的表達(dá)差異其中，WT表示野生型煙草，MhSGTla表示轉(zhuǎn)MhSGTla基因煙草。圖8野生煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(MhSGTla) 4°C處理 不同時(shí)間后NtSPS基因的表達(dá)差異其中，WT表示野生型煙草，MhSGTla表示轉(zhuǎn)MhSGTla基因煙草。圖9野生煙草(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草(MhSGTla) 4°C處理不同時(shí)間后NtSOD基因的表達(dá)差異其中，WT表示野生型煙草，MhSGTla表示轉(zhuǎn)MhSGTla基因煙草。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I取‘湖北海棠’組培苗葉片，參考蔡斌華等改進(jìn)的CTAB法(蔡斌華，張計(jì)育，高志紅，渠慎春，佟兆國(guó)，靡林，喬玉山，章鎮(zhèn).一種改良的提取草莓屬葉片總RNA的方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24 (6) :875-877)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄以及ds DNA的合成參考SMART PCR cDNA Synthesis Kit User Manual進(jìn)行。根究已經(jīng)報(bào)道物種的序列，在SGTl最大開(kāi)放閱讀框兩端分別設(shè)計(jì)引物sgtl-F :ACTAGTATGGCTTCCGATCTCG (SEQ ID NO. 2)及引物sgtl-R CGGTACCCTAGAACTCCCATT(SEQ ID NO. 3)。反應(yīng)體系為 ds DNA 模板，I u L ；10XPCRBuffer, 2. 5 ;上游引物 sgtl-F、下游引物 sgtl-R 各 I y L，MgCl2,1. 5u L, dNTP, 2 u L, rTaq,0. 125 u L,其余用水補(bǔ)齊至 25ii L。反應(yīng)程序?yàn)?94°C，4min ;94 °C，30s，55 °C，45s，72 °C，lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin ;將擴(kuò)增得到的片段經(jīng)回收、克隆和測(cè)序。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后得到兩條不同的序列，分別編碼360或359個(gè)氨基酸殘基的蛋白，核苷酸同源性為92. 17%，氨基酸同源性為89. 17%,分別命名為MhSGTla (序列如SEQ ID NO. I所示)和MhSGTlb (Genebank登錄號(hào)⑶183101)。MhSGTla和MhSGTlb蛋白含有5個(gè)保守域，從氨基端至羧基端依次為T(mén)PR(tetratricopeptide repeat domain) > VRl (variable region I) > CS (CHORD andSGT1)、VR2 (variable region 2)和 SGS(SGT1 special sequence)。其中 TPR、CS 和 SGS 的序列較為保守，而VRl和VR2的序列保守性較差。通過(guò)DNAMAN軟件將‘湖北海棠’ MhSGTla和MhSGTlb基因編碼的氨基酸序列與NCBI上登錄的其它物種進(jìn)行序列比對(duì)，MhSGTla與大麥、煙草、水稻、馬鈴薯、小麥、中間偃麥草、擬南芥的同源性分別為66. 34%,71%,63. 59%、69. 38%,61. 36%,62. 93% 和 62. 98%。實(shí)施例2根據(jù)載體和MhSGTla基因的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含有SpeI和K印I基因特異引物，上游引物 sgtl-F :5’ -ACTAGTATGGCTTCCGATCTCG-3，(SEQ ID NO. 2);下游引物 sgtl-R 5’ -CGGTACCCTAGAACTCCCATT-3’ (SEQ ID NO. 3)。以 MhSGTla 全長(zhǎng) cDNA 文庫(kù)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.‘湖北海棠’ MhSGTla基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. I。
2.含有權(quán)利要求I所述的MhSGTla基因的重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述的重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求I所述的MhSGTla基因插入到pCAMBIA-S1300+載體的SpeI和KpnI酶切微點(diǎn)之間所得。
4.含有權(quán)利要求I所述的MhSGTla基因的宿主。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有MhSGTla基因的宿主，其特征在于所述的宿主為農(nóng)桿菌。
6.權(quán)利要求I所述的MhSGTla基因在創(chuàng)制耐低溫新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2所述的含有MhSGTla基因的重組表達(dá)載體在創(chuàng)制耐低溫新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了湖北海棠MhSGT1a基因及其應(yīng)用?！昂焙Ｌ摹盡hSGT1a基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1。所述的MhSGT1a基因在創(chuàng)制耐低溫新種質(zhì)和/或植物品種改良中的應(yīng)用。本發(fā)明首次從“湖北海棠”克隆得到了一個(gè)新的MhSGT1a基因，該基因與大麥、煙草、水稻、馬鈴薯、小麥、中間偃麥草、擬南芥的同源性分別為66.34%、71%、63.59%、69.38%、61.36%、62.93%、62.98%。MhSGT1a轉(zhuǎn)基因煙草具有較強(qiáng)的抵御低溫脅迫的能力，植株可在4℃低溫條件下正常生長(zhǎng)長(zhǎng)達(dá)24h，同時(shí)也證明了MhSGT1a基因具有提高植物抗寒能力的功能。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102787123SQ201210222829
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者喬玉山, 呂東, 張計(jì)育, 李春霞, 渠慎春, 章鎮(zhèn) 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)