紅棗中鏈格孢菌的多重pcr檢測(cè)引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體涉及紅棗中鏈格孢菌的多重PCR快速檢測(cè)方法與應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]率(Zizyphus jujuba Mill)屬鼠李科率屬植物，是一種藥食同源的食品。但紅率在自然條件下貯藏容易發(fā)生真菌病害侵染引起的霉變，在霉變過程中，真菌產(chǎn)生的真菌毒素具有很強(qiáng)的毒性，會(huì)給食用者帶來危害，鏈格孢菌是紅棗霉變中的主要真菌之一，因此，對(duì)其進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，對(duì)控制紅棗產(chǎn)品的安全性具有重要意義。
[0003]傳統(tǒng)的，鏈格孢菌常用分離培養(yǎng)和血清學(xué)方法，分別采用不同的檢驗(yàn)程序、方法，分別報(bào)告，確診檢驗(yàn)結(jié)果至少需5?7d，檢驗(yàn)方法繁瑣、時(shí)間長、特異性低等，因此，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的鏈格孢菌檢測(cè)方法將是發(fā)展的方向。建立一種快速檢測(cè)霉變紅棗中鏈格孢菌的檢測(cè)方法具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是采用棗中鏈格孢菌特菌Alt-FURl擴(kuò)增片段和Alt_F2，R2擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)引物，采用多重PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在為棗產(chǎn)品的檢測(cè)鏈格孢菌檢測(cè)提供一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便新方法
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種棗中鏈格孢菌特菌多重PCR檢測(cè)方法，采取如下步驟:
[0006](I)將霉變紅棗上刮下的菌絲刮下、洗滌干燥，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板；
[0007](2)從紅棗真菌菌絲中提取基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板，分別用Alt_Fl、Rl擴(kuò)增片段和Alt-F2，R2擴(kuò)增片段設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為50 μ L:DNA模板2 μ L ; 10 X 緩沖液 5 μ L ；dNTP (每種 2.5mmol/L) 2 μ L ;引物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L ;無菌水補(bǔ)足至50 μ Lo PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min，然后94°C變性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后取5yL PCR產(chǎn)物加I yL6X溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上IlOV電泳35min。根據(jù)條帶有無和大小判定結(jié)果。本發(fā)明的有益效果是:鏈格孢菌是影響紅棗霉變的重要因素，霉變紅棗對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成危害，而傳統(tǒng)的鏈格孢菌細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)、生化鑒定等檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(需4?7d)，操作繁瑣復(fù)雜，特異性、敏感度低，不能起到有效地監(jiān)測(cè)和預(yù)防作用。本發(fā)明提供的多重PCR檢測(cè)方法可以彌補(bǔ)以上不足，提供一種鏈格孢菌快速高效的檢測(cè)方法。多重PCR擴(kuò)增結(jié)果表明:采用本發(fā)明特異引物檢測(cè)的方法靈敏度高和特異性好，為紅棗霉變的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和快速診斷提供了有效手段，可以推廣應(yīng)用于果蔬加工、食品安全等領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0008]圖1 為 Alt-Fl，Rl 引物特異性，M:DL 1000 DNA Marker ；1:XZJ1 ；2:XZJ2 ；3:擴(kuò)展青霉；4:皮落青霉；5:根霉；6:毛霉；7:黑曲霉；8:鏈孢霉；9:長梗木霉；
[0009]圖 2 為 Alt-F2，R2 引物特異性，M:DL 1000 DNA Marker ；1:XZJ1 ；2:XZJ2 ；3:擴(kuò)展青霉；4:皮落青霉；5:根霉；6:毛霉；7:黑曲霉；8:鏈孢霉；9:長梗木霉。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1
[0011 ] 一種鏈格孢霉多重PCR快速檢測(cè)方法，采用多重PCR技術(shù)一次性擴(kuò)增沙門菌和大腸桿菌078的特異基因以及細(xì)菌16s rDNA的部分序列，然后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0012]本實(shí)施例所用主要試劑:
[0013]Tap酶、dNTP:均購自TaKaRa公司。真菌DNA提取試劑盒，Omega公司。
[0014]本實(shí)施例所用主要儀器:
[0015]5311 型 PCR 儀，德國 eppendorf 公司；
[0016]DYCP-31DN水平電泳儀(北京六一儀器廠)；
[0017]Tanon-2500R全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。
[0018]上述鏈格孢霉多重PCR快速檢測(cè)方法具體包括以下步驟:
[0019](I)合成引物
[0020]根據(jù)鏈格孢霉特異基因設(shè)計(jì)特異引物Alt-Fl/Alt-Rl，上述引物的核苷酸序列為:
[0021]Alt-Fl 5-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3
[0022]Alt-Rl 5-CGACTTGTGCTGCGCTC-3
[0023](2)將霉變紅棗上刮下的菌絲刮下、洗滌干燥，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板；
[0024](3)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立
[0025]用Alt-Fl/Rl引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為50yL:DNA模板2yL;10X緩沖液 5 μ L ；dNTP (每種 2.5mmol/L) 2 μ L ;弓I 物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0.4yL ;無菌水補(bǔ)足至50 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后取5 yLPCR產(chǎn)物加I yL 6X溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上IlOV電泳35min。根據(jù)條帶有無和大小判定結(jié)果。
[0026]實(shí)施例2
[0027]本實(shí)施例所用主要試劑和儀器同實(shí)施例1。
[0028]上述鏈格孢霉多重PCR快速檢測(cè)方法具體包括以下步驟:
[0029](I)合成引物
[0030]根據(jù)鏈格孢霉特異基因設(shè)計(jì)特異引物Alt-F2/Alt-R2，上述引物的核苷酸序列為:
[0031]Alt-F2 5-CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCC-3
[0032]Alt-R2 5-CAGGCATGCCCTTTGGATAC-3，
[0033](2)將霉變紅棗上刮下的菌絲刮下、洗滌干燥，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板；
[0034](3)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立
[0035]用Alt-F2/R2引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為50 μ L:DNA模板2 yL ;10X緩沖液 5 μ L ；dNTP (每種 2.5mmol/L) 2 μ L ;弓I 物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0.4yL ;無菌水補(bǔ)足至50 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95 °C預(yù)變性5min，然后94°C變性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸40sec，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后取5 yLPCR產(chǎn)物加I yL 6X溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上IlOV電泳35min。根據(jù)條帶有無和大小判定結(jié)果。
[0036]實(shí)施例3
[0037]本實(shí)施例所用主要試劑和儀器同實(shí)施例1。
[0038]上述鏈格孢霉多重PCR快速檢測(cè)方法具體包括以下步驟:
[0039](I)合成引物
[0040]根據(jù)例I和例2分別合成引物Alt-Fl/Alt-Rl和Alt_F2/Alt_R2，將2對(duì)引物按Alt-Fl/Alt-Rl:Alt-F2/Alt-R2 體積比比 3:1 的比例混合。
[0041](2)將霉變紅棗上刮下的菌絲刮下、洗滌干燥，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板；
[0042](3)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立
[0043]用混合引物進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為50 μ L:DNA模板2 μ L ; 10 X緩沖液5 μ L ;dNTP (每種 2.5mmol/L) 2 μ L ;引物(10 μ M/L)各 2 μ L ；Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L ;無菌水補(bǔ)足至50 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5