盆腔脫垂高表達基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及盆腔脫垂高表達基因及其應(yīng)用，更具體的涉 及CHRDL2基因在盆腔脫垂診治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，POP)是由于盆底支持結(jié)構(gòu)的缺陷、損傷 或功能障礙造成的，是影響中老年女性生活質(zhì)量的常見疾病，主要是由盆底支持結(jié)構(gòu)缺陷 或者退化、損傷及功能障礙所導(dǎo)致。關(guān)于POP的基礎(chǔ)研究較少，且涉及的領(lǐng)域局限，其病因 及發(fā)病機制不明，尤其是分子水平的基礎(chǔ)研究尚不能全面闡明盆底支持組織的損傷機制， 需更深入廣泛的探討。由于其發(fā)病機制尚不明確，目前的治療大多數(shù)只是對其癥狀進行治 療，而無法從病因上根治疾病。無論是手術(shù)治療還是保守治療，都存在并發(fā)癥以及復(fù)發(fā)等問 題，因此，要及早診斷P0P，選擇合適的治療方式并防止復(fù)發(fā)，就需要從發(fā)病機制上對POP進 行研究。
[0003] 發(fā)明人對9例盆腔脫垂病例樣本及3例對照進行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)方 法進行基因篩選，挑選出候選的CHRDL2基因。進一步，本發(fā)明進行了熒光定量實驗，結(jié)果證 實了 CHRDL2與盆腔脫垂具有很好的相關(guān)性，CHRDL2在盆腔脫垂患者組織中明顯高表達，細 胞生物學(xué)實驗結(jié)果表明，CHRDL2基因影響宮骶韌帶成纖維細胞的生長增殖活性。本發(fā)明提 供的CHRDL2基因可用于制備盆腔脫垂輔助診療制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種分子標(biāo)志物在制備盆腔脫垂診斷制劑中的應(yīng)用，所述 分子標(biāo)志物為CHRDL2基因和/或CHRDL2基因的表達產(chǎn)物。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選 基因CHRDL2基因，進而通過分子細胞生物學(xué)方法驗證了 CHRDL2基因與盆腔脫垂的關(guān)系： CHRDL2基因與盆腔脫垂具有很好的相關(guān)性，可用于制備盆腔脫垂輔助診斷制劑，具有重要 的臨床應(yīng)用價值。
[0006] 進一步的，所述的分子標(biāo)志物在盆腔脫垂組織中高表達。CHRDL2基因在盆腔脫垂 組織中的表達水平高于對照組織6倍多。
[0007] 進一步，所述的盆腔脫垂的診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片檢測盆 腔脫垂組織中CHRDL2基因的表達，優(yōu)選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含有一對特異性 擴增CHRDL2基因的引物；所述的基因芯片中包括與CHRDL2基因的核酸序列雜交的探針。 更優(yōu)選的，所述特異性擴增CHRDL2基因的引物為SEQ ID N0. 11和SEQ ID N0. 12。
[0008] 進一步，所述的盆腔脫垂的診斷制劑采用免疫方法檢測盆腔脫垂組織中CHRDL2 基因的表達產(chǎn)物，優(yōu)選的，所述免疫方法為ELISA檢測和/膠體金檢測。
[0009] 進一步，所述檢測CHRDL2蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒 中的抗體可采用市售的CHRDL2單克隆抗體。進一步，所述的試劑盒包括：包被CHRDL2單克 隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng) 終止液等。
[0010] 進一步，所述檢測CHRDL2蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用 市售的CHRDL2單克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或 膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)（T)噴點有抗 CHRDL2單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0011] 優(yōu)選的抗CHRDL2單克隆抗體選自下列抗體：Novus Biologicals公司提供的貨號 為 H00025884-D01P Chordin-like 2/CHRDL2 抗體，Abeam 公司提供的 Anti-CHRDL2 抗體 (貨號為 abl33852)。
[0012] 本發(fā)明的目的還在于提供一種分子標(biāo)志物在制備盆腔脫垂治療制劑中的應(yīng)用，所 述分子標(biāo)志物為CHRDL2基因和/或基因的表達產(chǎn)物。
[0013] 進一步，所述盆腔脫垂治療制劑抑制分子標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄和/或表達。
[0014] 本領(lǐng)域人員熟知抑制基因及其表達產(chǎn)物的表達通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N 和/或幾種：通過激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表達的蛋白、采用 RNA干擾技術(shù)抑制目的基因表達、激活促進目的基因mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進目 的基因編碼蛋白降解的分子、抑制促進目的基因表達的因子及蛋白的表達。即通過激活 CHRDL2基因的抑制基因、激活抑制CHRDL2基因表達的蛋白、導(dǎo)入抑制CHRDL2基因表達的 siRNA、激活促進CHRDL2基因mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進CHRDL2基因表達的蛋白降解 的分子、抑制促進CHRDL2基因表達的因子及蛋白的表達。
[0015] 進一步，所述抑制CHRDL2基因轉(zhuǎn)錄或表達的siRNA序列選自下列序列中的一種和 / 或幾種：SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 3、SEQ ID N0. 4、SEQ ID N0. 5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8。
[0016] RNA干擾（RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的 mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷 體內(nèi)某種特定基因的表達，促使mRNA降解，使細胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA 設(shè)計完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達載體，制備好的siRNA可以通過磷酸 ?丐共沉淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機械法、陽離子 脂質(zhì)體試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細胞。
[0017] 本發(fā)明的目的在于提供一種盆腔脫垂抑制劑，所述盆腔脫垂抑制劑抑制CHRDL2 基因的轉(zhuǎn)錄或表達，優(yōu)選的，盆腔脫垂抑制劑中含有抑制CHRD L 2基因的轉(zhuǎn)錄或表達的 siRNA〇
[0018] 本發(fā)明的目的在于提供一種盆腔脫垂診斷制劑，所述盆腔脫垂診斷制劑檢測 CHRDL2基因的轉(zhuǎn)錄或表達，優(yōu)選的，盆腔脫垂診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯 片、免疫方法檢測。
[0019] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo) 記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現(xiàn)了絕對定 量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強、結(jié)果清晰。
[0020]基因芯片又稱為DNA微陣列（DNA microarray)，可分為三種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷 酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進行檢測。基因芯片作為一種先進的、大規(guī)模、高通 量檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡便；二是可同時檢測多種疾病。
[0021] 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點。ELISA檢測試劑盒根據(jù)檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0022] 常用的免疫膠體金檢測技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進行負染?？捎糜诓《拘螒B(tài)的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠 體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時，待