Stac2基因及其編碼蛋白在抑制盆腔脫垂中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及STAC2基因及其編碼蛋白在抑制盆腔脫垂中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 盆腔器官脫垂（pelvic organ prolapse，P0P)是由環(huán)境和遺傳因素共同作用所致 的復(fù)雜多因素疾病。除陰道分娩、妊娠損傷、激素水平改變、衰老、肥胖、長期腹壓增加等環(huán) 境因素可以增加POP的易感性外，個(gè)體遺傳因素也在POP的發(fā)生中扮演著重要角色。目前 認(rèn)為POP是由于盆底支持組織因退化、損傷所致松弛，而引發(fā)的一種盆底肌肉退行性疾病。 但關(guān)于POP的基礎(chǔ)研究較少，且涉及的領(lǐng)域局限，其病因及發(fā)病機(jī)制不明，尤其是分子水平 的基礎(chǔ)研究尚不能全面闡明盆底支持組織的損傷機(jī)制，需更深入廣泛的探討。
[0003] 發(fā)明人對(duì)9例盆腔脫垂病例樣本及3例對(duì)照進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)方 法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選的STAC2基因。進(jìn)一步，本發(fā)明進(jìn)行了分子細(xì)胞生物學(xué)方法證 實(shí)了候選基因與盆腔脫垂的關(guān)系：候選基因與盆腔脫垂具有很好的相關(guān)性，候選基因在盆 腔脫垂患者組織中明顯低表達(dá)，可用于制備盆腔脫垂輔助診療制劑，具有重要的臨床應(yīng)用 價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種分子標(biāo)志物在制備盆腔脫垂診斷制劑中的應(yīng)用，所述 分子標(biāo)志物為STAC2基因和/或STAC2基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因STAC2基因，進(jìn)而通過分子細(xì)胞生物學(xué)方法驗(yàn)證了 STAC2基因與盆腔脫垂的關(guān)系：STAC2 基因與盆腔脫垂具有很好的相關(guān)性，可用于制備盆腔脫垂輔助診斷制劑，具有重要的臨床 應(yīng)用價(jià)值。
[0006] 進(jìn)一步的，所述的分子標(biāo)志物在盆腔脫垂組織中低表達(dá)。
[0007] 進(jìn)一步，所述的盆腔脫垂的診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片檢測(cè)盆 腔脫垂組織中STAC2基因的表達(dá)，優(yōu)選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含有一對(duì)特異性擴(kuò) 增STAC2基因的引物；所述的基因芯片中包括與STAC2基因的核酸序列雜交的探針。更優(yōu) 選的，所述特異性擴(kuò)增STAC2基因的引物為SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2。
[0008] 進(jìn)一步，所述的盆腔脫垂的診斷制劑采用免疫方法檢測(cè)盆腔脫垂組織中STAC2基 因的表達(dá)產(chǎn)物，優(yōu)選的，所述免疫方法為ELISA檢測(cè)和/膠體金檢測(cè)。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)STAC2蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑盒 中的抗體可采用市售的STAC2單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括：包被STAC2單克隆 抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終 止液等。
[0010] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)STAC2蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采用 市售的STAC2單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或 膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)（T)噴點(diǎn)有抗 STAC2單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)（C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0011] 本發(fā)明的目的還在于提供一種分子標(biāo)志物在制備盆腔脫垂治療制劑中的應(yīng)用，所 述分子標(biāo)志物為STAC2基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0012] 進(jìn)一步，所述盆腔脫垂治療制劑促進(jìn)STAC2基因的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。
[0013] 本領(lǐng)域人員熟知促進(jìn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N 和/或幾種：激活分子標(biāo)志物的啟動(dòng)子、激活分子標(biāo)志物表達(dá)的蛋白或因子、導(dǎo)入促進(jìn)分子 標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體。
[0014] 本發(fā)明的目的在于提供一種盆腔脫垂抑制劑，所述盆腔脫垂抑制劑促進(jìn)STAC2基 因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，優(yōu)選的，盆腔脫垂抑制劑中含有促進(jìn)STAC2基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的載體和/ 或激活STAC2基因的啟動(dòng)子和/或激活STAC2基因表達(dá)的蛋白或因子。
[0015] 本發(fā)明的目的在于提供一種盆腔脫垂診斷制劑，所述盆腔脫垂診斷制劑檢測(cè) STAC2基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，優(yōu)選的，盆腔脫垂診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、 免疫方法檢測(cè)。
[0016] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測(cè)的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定 量。多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、 重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0017] 基因芯片又稱為DNA微陣列（DNA microarray)，可分為三種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記 的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷 酸探針陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)?；蛐酒鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通 量檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面：一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性；二 是快速簡便；二是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0018] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo) 記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測(cè)大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。ELISA檢測(cè)試劑盒根據(jù)檢測(cè)目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點(diǎn)一步法、捕獲法測(cè)IgM抗體、應(yīng)用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測(cè)試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0019] 常用的免疫膠體金檢測(cè)技術(shù)：（1)免疫膠體金光鏡染色法細(xì)胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行染色，也可在膠體金標(biāo)記的基礎(chǔ)上，以銀顯影液增強(qiáng)標(biāo)記， 使被還原的銀原子沉積于已標(biāo)記的金顆粒表面，可明顯增強(qiáng)膠體金標(biāo)記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標(biāo)記的抗體或抗抗體與負(fù)染病毒樣本或組織超薄切片結(jié)合， 然后進(jìn)行負(fù)染。可用于病毒形態(tài)的觀察和病毒檢測(cè)。（3)斑點(diǎn)免疫金滲濾法應(yīng)用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點(diǎn)于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標(biāo)記的抗體檢測(cè)相 應(yīng)的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠 體金標(biāo)記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，當(dāng)移動(dòng)至固 定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留， 聚集在檢測(cè)帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0020] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)盆腔脫垂的基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒檢測(cè)基 因STAC2,采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ IDN0.1，下游引物序列為 SEQ IDN0.2。
[0021] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀， 靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0022] 進(jìn)一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括：特異性引物、內(nèi)參引物、熒光定量PCR 反應(yīng)液。所述內(nèi)參為GAPDH。
[0023] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[0024] 本發(fā)明還檢測(cè)了本試劑盒靈敏性，結(jié)果顯示本試劑盒檢測(cè)范圍為106-102c〇pieS/ y1，最小檢出濃度為lOOcopies/ y1。
[0025] 本發(fā)明目的是提供了一種盆腔脫垂蛋白檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè) STAC2蛋白。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[0026] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)盆腔脫垂的基因芯片，所述的基因芯片包括與 STAC2基因的核酸序列雜交的探針。
【附圖說明】
[0027] 圖1宮骶韌帶成纖維細(xì)胞的生長曲線
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可 以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限 定。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條 件實(shí)施檢測(cè)。
[0029] 實(shí)施例1病例的收集
[0030] 取2012年9月到2013年12月期間在協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的POP患者，共收集9 例，對(duì)照來源于同時(shí)期婦產(chǎn)科住院的其他婦科疾?。ǔ┌Y患者）患者以及體檢人群，以 年齡、居住地為匹配因素，收集共3例。獲取所有研究對(duì)象的子宮骶韌帶組織樣本，編號(hào)后 置-80°C低溫冰箱保存。
[0031] POP組入選標(biāo)準(zhǔn)：a.經(jīng)婦科檢查后P0P-Q評(píng)分彡II度；
[0032] b.連續(xù)居住北京地區(qū)；
[0033] c?至少一次分娩史。
[0034] 排除標(biāo)準(zhǔn)：a.近3個(gè)月行激素替代治療患者；
[0035] b?結(jié)締組織疾病患者（風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑
[0036] 狼瘡、多發(fā)性肌炎、馬方綜合征、愛唐綜合征）；
[0037] c?妊娠患者；
[0038] d?患者拒絕加入；
[0039] e.惡性腫瘤患者。
[0040] 對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：a. P0P-Q評(píng)分< I度；
[0041] b?至少一次分娩史；
[0042] c?年齡、居住地與病例組匹配
[0043] d?無 POP 病史。
[0044