一種養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米材料快速鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物材料快速鑒定的方法，具體涉及一種養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn) 基因玉米材料快速鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著植物細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，利用生物基因工程技術(shù)將能夠提高玉 米氮、磷肥利用效率的基因?qū)胗衩祝牧加衩鬃陨硇誀钜殉蔀榭赡?。?dāng)前，轉(zhuǎn)基因玉米已 經(jīng)在全世界范圍內(nèi)廣泛種植，全球種植的轉(zhuǎn)基因作物面積和比例連年增加，同時隨著轉(zhuǎn)基 因技術(shù)的快速發(fā)展，國外轉(zhuǎn)基因作物大量進(jìn)入我國。因此，轉(zhuǎn)基因植物的檢測技術(shù)成為轉(zhuǎn)基 因產(chǎn)品安全性評價的重要技術(shù)平臺，如何快速有效地鑒定轉(zhuǎn)基因植物、種子等，在轉(zhuǎn)基因植 物研制開發(fā)或?qū)D(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行篩選或安全性評價時，對于科研單位、商檢、海關(guān)和農(nóng)業(yè)執(zhí) 法部門等具有重要的實用價值。
[0003] 目前，轉(zhuǎn)基因植物的檢測技術(shù)主要有除草劑鑒定、試紙條鑒定以及PCR鑒定技術(shù)。 其中，在植物轉(zhuǎn)基因研究過程中，通常采用選擇性標(biāo)記基因提高轉(zhuǎn)化篩選效率，而草銨膦乙 酰轉(zhuǎn)移酶基因（phosphinothricin acetyl transferase gene，bar)是玉米轉(zhuǎn)基因研究 中常用的篩選標(biāo)記基因，草銨膦可以強烈抑制植株內(nèi)的谷氨酰胺合成酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞 內(nèi)氨的迅速積累，隨葉綠體結(jié)構(gòu)解體，最后整個植株中毒死亡。因此，利用篩選標(biāo)記基因的 農(nóng)藝性狀，建立快速有效的非生物鑒定方法非常必要。待玉米生長至5~6葉期時噴灑草 銨膦，8~10d之后，野生型玉米葉片逐漸變黃枯萎，有明顯中毒癥狀，當(dāng)草銨膦濃度大于 2000mg/L時，野生型植株葉片褐化直至全部死亡，而含有Bar基因的玉米葉片沒有黃化癥 狀，生長正常，表現(xiàn)出對草銨膦的良好抗性，使用該濃度的草銨膦溶液噴灑玉米葉片，即可 準(zhǔn)確、有效地鑒定轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因玉米植株。因此，該方法可用于鑒定含抗除草劑標(biāo)記基 因Bar基因的養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米植株。然而噴灑草銨膦除草劑，篩選養(yǎng)分高效利用 的轉(zhuǎn)基因玉米材料的缺點主要是假陽性高、反應(yīng)速度慢等；若草銨膦沒有完全噴灑玉米植 株，玉米植株會在受傷后繼續(xù)恢復(fù)生長，造成假陽性；同時，噴灑除草劑后通常要一周左右 才能看到植株反應(yīng)效果，鑒選時間較長不利于及時獲知結(jié)果。
[0004] 在試紙條鑒定中，草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（phosphinothricin acetyl transferase gene，bar)為抗除草劑基因，編碼蛋白一膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT)。該基因 廣泛應(yīng)用于基因工程育種中的抗除草劑基因，也是遺傳轉(zhuǎn)化中的標(biāo)記基因。養(yǎng)分高效利用 轉(zhuǎn)基因玉米使用Bar基因作為標(biāo)記基因，它使玉米抵抗以L-phosphiothricin(PPT)為活性 成分的草銨膦除草劑，通過Bar試紙條分子檢測法能夠快速鑒定轉(zhuǎn)基因材料中的Bar蛋白， 檢測時取Bar試紙條將標(biāo)有箭頭和"max"端置于玉米葉片研磨上清液中1~2cm左右，一 般等待3~5min，試紙條上端出現(xiàn)質(zhì)控線，最長反應(yīng)時間為20min，表示混合液中含有來自 于樣品的蛋白，試驗結(jié)果有效。如果樣品含有Bar蛋白，則在質(zhì)控線下方出現(xiàn)測試線；若不 出現(xiàn)測試線，則表示樣品中不含有Bar蛋白，該鑒定方法為快速有效的篩選大量轉(zhuǎn)基因材 料節(jié)約大量時間。然而Bar試紙條檢測結(jié)果呈陽性，也還只是處于"海選"階段，需要進(jìn)一 步將初步篩選出的陽性材料進(jìn)行PCR定性篩選檢測，才能最終確定是否真正含有轉(zhuǎn)基因物 質(zhì)；同時Bar試紙條檢測成本較貴，約為25元/樣品。
[0005] 在轉(zhuǎn)基因玉米研究和培育時，陽性植株的篩選、插入序列分析、安全檢測一般都 離不開分子檢測，最常用的分子檢測手段是PCR (聚合酶鏈反應(yīng)）檢測。PCR檢測的基礎(chǔ)是 提取滿足檢測需要的基因組DNA，然后以提取的待檢測轉(zhuǎn)基因玉米材料基因組DNA為模板 進(jìn)行PCR擴增，擴增后通過電泳系統(tǒng)分辨目的基因條帶，有目的片段出現(xiàn)的樣品即為轉(zhuǎn)基 因陽性植株，反之為陰性非轉(zhuǎn)基因植株。然而PCR定性篩選檢測，檢測費用為每次1000元 左右；在研究或者篩選群體較大（如轉(zhuǎn)基因植株的大批量篩選、遺傳規(guī)律分析等）時，提取 基因組DNA就會成為一項繁重的工作，并成為檢測和篩選速度的一個重要制約因素。因此， PCR鑒定成本較高、方法步驟繁瑣，做大量鑒定，運用時有一定的局限性。
[0006] 綜上，現(xiàn)有養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因植物鑒定方法鑒定手段單一，要么是苗期噴施除 草劑篩選鑒定，要么是簡單的進(jìn)行Bar試紙條檢測，要么是全材料提取基因組DNA進(jìn)行PCR 驗證，方法上太過局限和不靈活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種具有簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度和特異性 高、經(jīng)濟實用、適合于全生育期檢測等特點的養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米材料快速鑒定的方 法。
[0008] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米材料快 速鑒定的方法，包括以下步驟：
[0009] (1)除草劑首次篩選：將種植的養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米材料（優(yōu)選轉(zhuǎn)phyAO、 AMTl-l、DvASN、DvGS2、GPPAT基因玉米材料）在苗期玉米5~6葉一心，噴施濃度為1200~ 1300mg/L (優(yōu)選濃度為1250mg/L)草銨膦除草劑6~8d后篩選，玉米植株枯萎褐化直至死 亡為陰性材料即非轉(zhuǎn)基因植株，余下正常生長植株初步鑒定為養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米 植株；
[0010] (2)葉片Bar試紙條快速檢測：將苗期篩選正常生長的轉(zhuǎn)基因玉米植株葉片在喇 叭口期玉米植株9~10葉一心時，進(jìn)行Bar試紙條檢測，僅出現(xiàn)控制線的試紙條檢測結(jié)果 為陰性，即為非轉(zhuǎn)基因植株；同時出現(xiàn)控制線和測試線的試紙條檢測結(jié)果為陽性，即為養(yǎng)分 高效利用轉(zhuǎn)基因玉米植株：
[0011] (3)除草劑二次篩選和基因組的PCR檢測：將喇叭口期篩選出的轉(zhuǎn)基因玉米植株 待玉米植株生長到抽雄吐絲期，再次噴施濃度為1200~1300mg/L (優(yōu)選濃度為1250mg/L) 草銨膦除草劑6~8d篩選，玉米植株枯萎發(fā)黃直至死亡為陰性材料即非轉(zhuǎn)基因植株，余下 正常生長植株鑒定為養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米植株；同時取樣除草劑二次篩選后的轉(zhuǎn)基因 玉米葉片用于提取基因組DNA，待藥效明顯后再對正常生長的玉米材料提取基因組DNA進(jìn) 行PCR檢測。
[0012] 進(jìn)一步，步驟（2)中，所述Bar試紙條檢測是用1. 5ml離心管取管蓋大小葉片，加 入0. 5ml提取液反復(fù)研磨至勻漿，箭頭端向下插入Bar試紙條，待試紙條浸入研磨液10~ 15min后觀察結(jié)果。
[0013] 進(jìn)一步，步驟（3)，所述PCR引物為
[0014] phyAO 正向 CAGTCCCCGCCTCGAGAAAT
[0015] phyAO 反向 TGCCGTTGTACAGACCCAAA
[0016] AMT1-1 正向 TGGTCCGCTACAAGAACG
[0017] AMT1-1 反向 GCTCAGGTAAGCAATGAAAGT
[0018] DvASN 正向 CACCACGAGTTCACCTTCACAG
[0019] DvASN 反向 CATCAATCCAGTTGTAGCCCAC
[0020] DvGS2 正向 CACCCAAGCAACACTCGT
[0021] DvGS2 反向 CACAGGCAGAGGGATACG
[0022] PPAT BamH fw CGCGGATCCGCGATGGCAGCTCCGGAAGATTC
[0023] PPAT Smal rev TCCCCCGGGGGAGAGAGTTTATATATGATGAGTT。
[0024] 本發(fā)明首次為養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米材料鑒定提供了一套具有簡便、靈活、快 速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟實用、適合于全生育期檢測等特點的檢測體系，檢測者可以根據(jù)鑒定需要靈 活選擇某一時期或某一種方法或整套體系進(jìn)行養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米材料鑒定。實驗證 明，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)養(yǎng)分高效利用基因phyAO、AMT1-1、DvASN、DvGS2、GPPAT玉米檢測體系， 通過苗期和抽雄吐絲期大田除草劑篩選、喇叭口期Bar試紙條快速檢測及抽雄吐絲期基因 組DNA的PCR檢測，逐步篩選排查非轉(zhuǎn)基因植株，縮小后期精準(zhǔn)鑒定范圍，大大降低了工作 量和成本。
【附圖說明】
[0025] 圖1為AMT-I基因擴增程序。
[0026] 圖2為PPAT基因擴增程序。
[0027] 圖3為ASN基因擴增程序。
[0028] 圖4為GS2基因擴增程序。
[0029] 圖5為phyAO基因擴增程序。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。
[0031] 實施例1
[0032] (1)除草劑首次篩選：將種植的養(yǎng)分高效利用轉(zhuǎn)基因玉米材料在苗期玉米5~6 葉一