本發(fā)明涉及一種基于血糖儀檢測鹽酸克倫特羅殘留的方法，屬于生物檢測及免疫傳感器技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鹽酸克倫特羅(clenbuteerol hydrochloride，CLB)，俗稱瘦肉精，是一種強效選擇性β興奮劑，廣泛用于防治支氣管炎、哮喘性慢性支氣管炎等呼吸科疾病和產(chǎn)科的治療。研究發(fā)現(xiàn)，當它高于臨床應(yīng)用劑量5～10倍添加到飼料中，可導致動物體內(nèi)的脂肪分解代謝增加，蛋白質(zhì)合成增加，顯著提高胴體的廋肉率。但是，人一旦長期食用含有大量CLB殘留的肉及其制品會出現(xiàn)頭暈、惡心、戰(zhàn)栗、肌肉振顫等輕度癥狀。此外，CLB能使動物肌肉中的糖酵解不足而使機體pH過高，最終影響動物的肉質(zhì)。從2002年12月起，農(nóng)業(yè)部規(guī)定CLB在所有動物性食品中不得檢出。因此，有必要發(fā)展簡單、可靠、靈敏的鹽酸克倫特羅殘留檢測方法來保障我國肉制品市場的安全與穩(wěn)定。

目前，檢測CLB的方法主要有色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和ELISA法，其中應(yīng)用最多的是液-質(zhì)聯(lián)用法、氣-質(zhì)聯(lián)用法和化學發(fā)光酶免疫法。色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是鹽酸克倫特羅殘留痕量分析的首選確證方法，能對殘留物進行定性、定量測定，靈敏度較高，但是此類方法需要對樣品進行復雜的前處理(如采用氣相色譜測定時，需要進行甲酯化衍生化反應(yīng))，操作復雜，測試時間長，費用高，并且檢測儀器昂貴、移動性差，難以推廣普及。

申請?zhí)?01210145999.X的發(fā)明專利公開了一種可用于檢測CLB的磁性夾心納米免疫傳感器，其工作原理為：在工作電極表面修飾納米金再結(jié)合被測物一抗，并在溶液中與被測物抗原溫育結(jié)合，將標記有HRP酶的被測物二抗與工作電極表面的被測物一抗-抗原溫育結(jié)合，形成“三明治”復合物，在外加磁場作用下，包被有“夾心免疫復合物”的納米磁珠被吸附到電極表面，加入HRP酶催化底物過氧化脲，通過測定傳感器電流輸出信號定量分析CLB。但是該方法需要經(jīng)歷復雜的電極修飾過程，對操作人員的要求較高，并且電極作為固相載體屬于單一反應(yīng)界面，包被抗原的量有限，同時電化學工作站的便攜性和可操作性不強。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于血糖儀檢測鹽酸克倫特羅殘留的方法，該方法利用磁性分離技術(shù)并結(jié)合間接競爭免疫反應(yīng)，用血糖儀捕獲信號，實現(xiàn)鹽酸克倫特羅的定量分析，具有操作簡單，檢測快速準確、靈敏度高等特點。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種基于血糖儀檢測鹽酸克倫特羅殘留的方法，包括以下步驟：

1)在磁珠表面包被鹽酸克倫特羅完全抗原，封閉，得到免疫磁珠探針；

2)在膠體金溶液中加入二抗，混勻后加入轉(zhuǎn)化酶，得到酶標二抗；

3)在待測溶液中加入免疫磁珠探針和鹽酸克倫特羅抗體，免疫反應(yīng)后磁分，得到磁珠/抗原-抗體免疫復合物；再加入酶標二抗，反應(yīng)后磁分，得到磁珠/抗原-抗體/酶標二抗免疫復合物；

4)在磁珠/抗原-抗體/酶標二抗免疫復合物中加入蔗糖溶液，水解反應(yīng)后，用血糖儀檢測葡萄糖信號值，并根據(jù)標準曲線得到待測溶液中鹽酸克倫特羅的殘留量。

步驟1)中磁珠在包被抗原前先進行活化處理，操作可參見專利“一種在磁珠表面共價偶聯(lián)蛋白質(zhì)的方法”(申請?zhí)?01310226070.4，申請日2013.06.07)。包被、封閉的具體操作也可參見該專利。當采用羧基磁珠時，活化后磁珠上的羧基處于半穩(wěn)定狀態(tài)，可與抗原側(cè)鏈的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而將抗原偶聯(lián)在磁珠表面。封閉的目的是使磁珠自身未反應(yīng)的位點得到飽和，以減少非特異性吸附的發(fā)生，增加磁珠的通用性。

步驟2)中膠體金可采用檸檬酸三鈉還原法制備，參見專利“一種磁性夾心納米免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用”，也可采用專利“大氣壓空氣等離子體液相下合成膠體金納米顆粒的方法”(申請?zhí)?01610069073.5，申請日2016.02.01)中公開的方法。

步驟2)中二抗與轉(zhuǎn)化酶的質(zhì)量比為1:8～12，根據(jù)紫外全波長掃描標記前后的抗體金溶液優(yōu)選為1:10，這是因為紫外掃描標記后的膠體金溶液與標記前相比可以看到峰值發(fā)生偏移4～5nm。二抗可選擇兔抗羊抗體，具體隨一抗的變化而變化。

步驟3)中免疫磁珠探針上的完全抗原與待測溶液中的鹽酸克倫特羅競爭結(jié)合抗體，形成磁珠/抗原-抗體免疫復合物和鹽酸克倫特羅-抗體免疫復合物，磁分，棄去上清液中未結(jié)合的抗體、鹽酸克倫特羅-抗體免疫復合物等，再加入酶標二抗進行第二次免疫反應(yīng)，在磁珠上形成抗原-抗體/酶標二抗夾心免疫復合物，磁分，棄去上清液中未結(jié)合的酶標二抗。

步驟3)中免疫磁珠探針的加量為20～30mg，鹽酸克倫特羅抗體的加入濃度為1:1000～1:700，酶標二抗的加入濃度為1:800～1:400。以上參數(shù)均由單因素試驗優(yōu)化得出。

步驟4)中蔗糖為反應(yīng)底物，在轉(zhuǎn)化酶的作用下能水解生成葡萄糖，再通過血糖儀測定葡萄糖信號即可。

步驟4)中水解反應(yīng)的時間為20～40min，反應(yīng)溫度40～60℃。

步驟4)中標準曲線的制作方法為：分別在系列濃度的鹽酸克倫特羅標準品溶液(例如：0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL)中加入免疫磁珠探針、鹽酸克倫特羅抗體，免疫反應(yīng)后磁分，得到磁珠/抗原-抗體免疫復合物，再加入酶標二抗，反應(yīng)后磁分，得到磁珠/抗原-抗體/酶標二抗免疫復合物；在上述免疫復合物中加入蔗糖溶液，水解反應(yīng)后用血糖儀檢測葡萄糖信號值，以標準品溶液濃度為橫坐標，以添加標準品的血糖儀各信號值(S)與無標準品添加的血糖儀信號值(S₀)的比值為縱坐標，繪制標準曲線。進一步作回歸分析，得到線性回歸方程。

本發(fā)明的有益效果：

血糖儀是一種檢測血清中血糖含量的小型醫(yī)療設(shè)備，便攜、定量成本低，近年來受到科研工作者的研究和關(guān)注。Yu Li等人發(fā)現(xiàn)便攜式血糖儀可用于檢測非糖物質(zhì)，如藥物(可卡因)、生物因子(腺嘌呤)、疾病標志物(結(jié)核干擾素)、有毒金屬離子(鈾)等。

本發(fā)明結(jié)合分散固相萃取的高效性、免疫親和反應(yīng)的特異性和磁回收的簡便性，可有效簡化現(xiàn)有方法的前處理流程，縮短前處理時間，提高目標物富集效率和雜質(zhì)凈化效率，并利用便攜式血糖儀快速、準確地定量CLB殘留，具有操作簡單、靈敏度高、檢測成本低等優(yōu)點，可用于肉類及肉制品中CLB的定量分析。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測方法的流程示意圖；

圖2為鹽酸克倫特羅的標準曲線；

圖3為檢測方法特異性驗證結(jié)果。

具體實施方式

下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實施例1

基于血糖儀檢測鹽酸克倫特羅殘留的方法，流程示意圖見圖1，具體步驟如下：

1)免疫磁珠探針的制備

a.在2mg羧基磁珠中加入200μL含有5mg/mL EDC的MES溶液(15mM，pH6.0)，室溫下活化30min后磁分棄上清；

b.加入500μL含0.1mg CLB-BSA的MES溶液，室溫反應(yīng)過夜，磁分棄上清；

c.加入含有2％OVA的PBS(0.01M，pH6.0)溶液，37℃封閉2h，磁分棄上清，得到免疫磁珠；

d.加入含0.1％OVA的PBS溶液重懸磁珠(磁珠濃度1mg/mL)，保存于4℃冰箱中待用。

2)膠體金/轉(zhuǎn)化酶/二抗復合物(即酶標二抗)的制備

a.膠體金的制備

參照檸檬酸三鈉還原法，取1mL濃度1％的氯金酸溶液，用超純水定容至100mL，倒入250mL圓底燒瓶中，在恒溫加熱磁力攪拌條件下冷凝回流加熱，沸騰后立即加入5mL濃度1％的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱，觀察到溶液顏色漸漸由淡黃色變?yōu)樗{色，最后當溶液變?yōu)榫萍t色并保持顏色不再變化時，繼續(xù)加熱10min后停止加熱和攪拌，回流冷卻，得到膠體金溶液，4℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

b.取上述膠體金溶液，加入K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，加入1mg二抗，4℃反應(yīng)1h，10000rpm高速離心25min，棄上清，加入10mg轉(zhuǎn)化酶，4℃反應(yīng)4h，同樣條件離心，棄上清，加入2％聚乙二醇2000重懸，即得酶標二抗，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3)標準曲線的繪制

分別在0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng/mL系列濃度的鹽酸克倫特羅標準品溶液中加入25mg免疫磁珠探針、1:800稀釋倍數(shù)鹽酸克倫特羅抗體以及1:500的酶標二抗，反應(yīng)后磁分棄上清，得到磁珠/抗原-抗體/酶標二抗免疫復合物；在上述免疫復合物中加入500μL濃度0.1g/mL的蔗糖溶液，55℃溫度下水解30min后，用便攜式血糖儀檢測產(chǎn)生的葡萄糖信號值，制作標準曲線(見圖2)。

4)待測溶液的檢測

取25mg免疫磁珠，加入100μL待測溶液(含豬肉均質(zhì)樣品)、100μL 1:800的CLB抗體和100μL1:500的酶標二抗，反應(yīng)后磁分棄上清，得到磁珠/抗原-抗體-酶標二抗免疫復合物；在上述免疫復合物中加入500μL濃度0.1g/mL的蔗糖溶液，55℃水解30min后，用便攜式血糖儀檢測產(chǎn)生的葡萄糖信號值為7.8mM；對照標準曲線得到待測溶液中鹽酸克倫特羅的殘留量為10ng/mL。

試驗例

1)檢測方法的準確度驗證

取適量正常豬肉充分攪碎，每份稱取2.00g均質(zhì)樣品，制備9份樣品，分3組，每組各添加1、5、10ng/mL的鹽酸克倫特羅標準品。在豬肉均質(zhì)樣品中加入3mL 0.1mol/L的高氯酸溶液，勻漿振蕩提取10min，再加入3mL PBS，于樣品混合儀上勻漿5min，4℃、10000rpm離心30min，取全部上清二次離心，上清液用2M NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.4，再用實施例1中方法檢測，計算加標樣品的回收率、相對標準偏差和變異系數(shù)，結(jié)果見下表1。

表1加標回收試驗結(jié)果

2)檢測方法的特異性驗證

為驗證檢測方法的特異性，設(shè)計鹽酸克倫特羅結(jié)構(gòu)類似物與抗體的交叉反應(yīng)試驗，兩種類似物為萊克多巴胺(ractopamine，RAC)和沙丁胺醇(salbutamol，SAL)。鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的添加方式見圖3，濃度均為5ng/mL。結(jié)果表明：本發(fā)明中檢測方法具有較高的特異性，抗體與鹽酸克倫特羅各類似物無交叉反應(yīng)。