專利名稱：鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑條及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑條及其制造方法，特別是涉及一種檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條及其制造方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(CBL)俗稱“瘦肉精”，是一種β-興奮劑類藥物，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高畜禽瘦肉比的作用。鹽酸克倫特羅進(jìn)入豬體后，代謝時(shí)間長(zhǎng)，性質(zhì)穩(wěn)定，易在動(dòng)物組織中形成殘留，主要?dú)埓嬖诟闻K、肺、眼球等部位。當(dāng)人們食用含“瘦肉精”超標(biāo)的動(dòng)物性食品一定量后，會(huì)出現(xiàn)不同程度的震顫、心慌、頭痛、惡心、嘔吐、代謝紊亂等中毒癥狀。鹽酸克倫特羅本身及其代謝物殘留的特殊毒性及其致癌、致畸胎、致突變作用，已被大量的試驗(yàn)研究和追蹤調(diào)查所證明，引起了世界各國(guó)的高度警惕。我國(guó)飼料中非法使用這些激素類藥物的問題也很嚴(yán)重。我國(guó)政府已明令禁止用鹽酸克倫特羅作為飼料添加劑。我國(guó)在2001年制定了“飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法”、“動(dòng)物組織中鹽酸克倫特羅的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法”等農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，在分析技術(shù)上為我國(guó)對(duì)鹽酸克倫特羅的管理提供了技術(shù)保證。但是，這些檢測(cè)方法需要大型精密儀器，而且分析程序需要30個(gè)小時(shí)左右。即使是快速的檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)，也需要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行分析，完成一次檢測(cè)需要2小時(shí)，無法做到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，成本也高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅是否存在的試劑條。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條，它包括設(shè)有凹槽的吸附板，在所述吸附板的凹槽內(nèi)吸附有帶固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜，所述載體膜上放置有帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊；所述試劑條還包括一個(gè)裝有底物和顯色劑的遮光容器。
為了方便比色，所述試劑條還包括比色卡。
所述載體膜優(yōu)選為偏二氟乙烯膜；所述過氧化物酶優(yōu)選為辣根過氧化物酶；所述釋放墊優(yōu)選為玻璃纖維膜。所述遮光容器優(yōu)選為棕色毛細(xì)管。
所述底物優(yōu)選為過氧化氫；所述顯色劑優(yōu)選為四甲基聯(lián)苯胺。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條的方法。
一種生產(chǎn)檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條的方法，包括以下步驟
1)獲得抗鹽酸克倫特羅的抗體；2)制備帶有固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜；3)制備帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊；4)將載體膜貼附在用常規(guī)方法生產(chǎn)的吸附板上；5)吸附板、釋放墊及裝有底物和顯色劑的遮光容器共同包裝。
在上述生產(chǎn)過程中，所述獲得抗鹽酸克倫特羅的抗體的步驟為將鹽酸克倫特羅重氮化后與BSA偶聯(lián)，偶聯(lián)的比例為12∶1；用該偶聯(lián)物免疫動(dòng)物，并自動(dòng)物的血清中獲得抗體。
所述制備帶有固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜的步驟是1)以100％甲醇浸潤(rùn)偏二氟乙烯膜10-30秒，50∶50甲醇/PBS混合液浸潤(rùn)5-10分鐘，0.2mol的PBS緩沖液(pH為7.4)平衡30分鐘；2)鹽酸克倫特羅抗體的貯備液加蔗糖和PVP保護(hù)液后稀釋至2ng/ul；3)將抗體液點(diǎn)加到偏二氟乙烯膜上；4)待膜徹底干后放入含4％戊二醛的固定液中，38℃浸泡10-20分鐘；5)在含3％脫脂乳的PBS緩沖液中浸泡10分鐘，取出后用PBS沖洗2次，置于室溫下晾干。
所述制備帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊的步驟是1)鹽酸克倫特羅重氮化后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，偶聯(lián)的比例為7∶1；2)用0.2％土溫20、0.2％PVA等釋放促進(jìn)劑噴涂、或浸潤(rùn)10-20分鐘表面經(jīng)聚丙乙烯處理的玻璃纖維膜載體；3)鹽酸克倫特羅辣根過氧化物酶偶聯(lián)物的貯備液加4％蔗糖和5％PVP保護(hù)液后稀釋至3ng/ul，點(diǎn)加到玻璃纖維膜上，室溫下晾干得到釋放墊。
本發(fā)明巧妙地利用ELISA的原理，并創(chuàng)造性地將抗體和競(jìng)爭(zhēng)物均固相化，使半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅的過程大大簡(jiǎn)化，檢測(cè)過程只需17分鐘，而且在檢測(cè)過程中不需要任何儀器設(shè)備，使鹽酸克倫特羅的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)成為了可能。
用本發(fā)明的方法制造的試劑條，固相化的CBL抗體活性可保存4個(gè)月，酶標(biāo)記CBL在50秒內(nèi)釋放率達(dá)于85％，干燥情況下，酶標(biāo)記CBL的活性保存期達(dá)到3個(gè)月，既確保了反應(yīng)的靈敏快速，又方便了使用者，可以做到一次購(gòu)買，較長(zhǎng)時(shí)間地使用，節(jié)約開支降低成本，符合市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的需要。
本發(fā)明的產(chǎn)品為一次性用檢測(cè)工具，屬于快速微量檢測(cè)，CBL的檢測(cè)限為1ng/ml，對(duì)于控制瘦肉精等違禁藥物的非法使用具有重要的價(jià)值。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的產(chǎn)品及制造方法做進(jìn)一步說明。


圖1為本發(fā)明試劑條的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明試劑條載體膜在不同樣品作用下的反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、檢測(cè)鹽酸克倫特羅試劑條的結(jié)構(gòu)如圖1所示，本發(fā)明檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條包括設(shè)有凹槽2的塑料吸附板1，在吸附板1的凹槽2內(nèi)吸附固定有帶固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的偏二氟乙烯載體膜3，載體膜3上放置有帶有鹽酸克倫特羅與辣根過氧化物酶偶聯(lián)物的玻璃纖維膜釋放墊4；一個(gè)裝有過氧化氫底物和顯色劑四甲基聯(lián)苯胺的棕色毛細(xì)管6；在塑料吸附板1上粘貼有比色卡5。
在本實(shí)施例中，吸附板1也可以是其它材料制成的，如樹脂、玻璃等。
本發(fā)明試劑條的工作原理是，樣品滴加在釋放墊4上，釋放墊中的鹽酸克倫特羅與辣根過氧化物酶偶聯(lián)物及樣品中的標(biāo)的物與抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，樣品中含CBL越多，與抗體結(jié)合的鹽酸克倫特羅-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物越少，反之亦然。洗膜后，與抗體復(fù)合的辣根過氧化物酶促使過氧化氫底物還原，并與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)。觀察載體膜的顏色變化，便可知樣品中是否含有CBL。如圖2所示，C的樣品不含CBL，呈現(xiàn)藍(lán)色，為陰性；B的樣品中含有少于1ng/ml的CBL，呈現(xiàn)藍(lán)色，但顏色稍淡，也為陰性；A的樣品中含有多于1ng/ml的CBL，不顯色，為陽(yáng)性。
實(shí)施例2、檢測(cè)鹽酸克倫特羅試劑條的制備一、CBL抗體的獲得和純化1、CBL重氮化后與BSA偶聯(lián)，偶聯(lián)的比例為12∶1；2、偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過透析去除游離的小分子CBL、經(jīng)過親和柱分離出沒有結(jié)合CBL的游離BSA，獲得純化的CBL-BSA產(chǎn)物，該產(chǎn)物中的CBL濃度為原濃度的10倍；3、用該偶聯(lián)產(chǎn)物，經(jīng)免疫程序(一次全免疫、三次強(qiáng)化)從兔中獲得抗血清，該抗血清經(jīng)CBL的ELISA試劑盒(CBL濃度為1ng/ml)檢驗(yàn)，效價(jià)為1∶10000；4、抗血清經(jīng)親和凈化后，獲得純化抗體備用。
二、CBL抗體固相化的構(gòu)建1、選擇用強(qiáng)疏水的偏二氟乙烯膜(簡(jiǎn)稱為PVDF，孔徑為0.45um)為載體，使用前分別以100％甲醇浸潤(rùn)10-30秒、50∶50甲醇/PBS混合液浸潤(rùn)5-10分鐘、0.2mol的PBS緩沖液(pH為7.4)平衡30分鐘；2、CBL抗體的貯備液加3-5％的蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)保護(hù)液后稀釋至2ng/ul，用移液槍將2ul該抗體液分次點(diǎn)加到直徑為3-4mm的PVDF膜上；
3、待膜徹底干后放入含4％戊二醛的固定液，38℃浸泡10-20分鐘，后在含3％脫脂乳的PBS緩沖液中浸泡10分鐘，取出后移PBS沖洗2次，置于室溫下晾干待用。
三、辣根過氧化物酶偶聯(lián)CBL的獲得和純化1、CBL重氮化后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，偶聯(lián)的比例為7∶1；2、偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)過透析去除游離的小分子CBL、經(jīng)過親和柱分離出沒有結(jié)合CBL的游離辣根過氧化物酶，獲得純化的CBL-辣根過氧化物酶產(chǎn)物，該產(chǎn)物中的CBL濃度經(jīng)ELISA試劑盒檢測(cè)，為原濃度的5倍。
四、辣根過氧化物酶偶聯(lián)CBL固相載體的構(gòu)建1、選擇用表面經(jīng)聚乙烯醇(PVA)處理的玻璃纖維膜為載體。該載體在使用前分別用0.2％土溫20、0.2％PVA等釋放促進(jìn)劑噴涂、或浸潤(rùn)10-20分鐘；2、CBL辣根過氧化物酶的貯備液加4％蔗糖和5％PVP等的保護(hù)液后稀釋至3ng/ul，用移液槍將3ul該抗體液分次點(diǎn)加到直徑為3-4mm的玻璃纖維膜上，置于室溫下晾干即為CBL與辣根過氧化酶偶聯(lián)物的釋放墊，待用。
五、制備試劑條1、將載體膜貼附在用常規(guī)方法生產(chǎn)的塑料吸附板上，為了方便比色，在塑料吸附板上還應(yīng)粘貼上陰性及陽(yáng)性對(duì)照比色卡；2、釋放墊放置在載體膜上，過氧化氫底物及顯色劑四甲基聯(lián)苯胺封裝在棕色毛細(xì)管內(nèi)。
3、吸附板、釋放墊及毛細(xì)管共同包裝得到試劑條產(chǎn)品。
實(shí)施例3、用本發(fā)明的試劑條檢測(cè)尿樣中是否含有CBL1、試劑條撕去封口膜待用。
2、取尿液30ul，緩慢滴加在釋放墊上，輕輕晃動(dòng)后用鑷子將釋放墊去掉，反應(yīng)10分鐘。
3、用100ul水分別洗載體膜3次，每次1分鐘。
4、打開毛細(xì)管，加底物和顯色劑10ul，4分鐘后判斷出現(xiàn)的色斑。
5、結(jié)果判定藍(lán)色為陰性(即低于1ppb)，淺藍(lán)色或無色為陽(yáng)性(即高于1ppb)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條，它包括設(shè)有凹槽的吸附板，其特征在于在所述吸附板的凹槽內(nèi)吸附有帶固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜，所述載體膜上放置有帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊；所述試劑條還包括一個(gè)裝有底物和顯色劑的遮光容器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑條，其特征在于所述試劑條還包括比色卡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑條，其特征在于所述載體膜為偏二氟乙烯膜；所述過氧化物酶為辣根過氧化物酶；所述釋放墊為玻璃纖維膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑條，其特征在于所述遮光容器為棕色毛細(xì)管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑條，其特征在于所述底物為過氧化氫；所述顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺。
6.一種生產(chǎn)檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條的方法，包括以下步驟1)獲得抗鹽酸克倫特羅的抗體；2)制備帶有固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜；3)制備帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊；4)將載體膜貼附在用常規(guī)方法生產(chǎn)的吸附板上；5)吸附板、釋放墊及裝有底物和顯色劑的遮光容器共同包裝。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述獲得抗鹽酸克倫特羅的抗體的步驟為將鹽酸克倫特羅重氮化后與BSA偶聯(lián)，偶聯(lián)的比例為12∶1；用該偶聯(lián)物免疫動(dòng)物，并自動(dòng)物的血清中獲得抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述制備帶有固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜的步驟是1)以100％甲醇浸潤(rùn)偏二氟乙烯膜10-30秒，50∶50甲醇/PBS混合液浸潤(rùn)5-10分鐘，0.2mol的PBS緩沖液(pH為7.4)平衡30分鐘；2)鹽酸克倫特羅抗體的貯備液加蔗糖和PVP保護(hù)液后稀釋至2ng/ul；3)將抗體液點(diǎn)加到偏二氟乙烯膜上；4)待膜徹底干后放入含4％戊二醛的固定液中，38浸泡10-20分鐘；5)在含3％脫脂乳的PBS緩沖液中浸泡10分鐘，取出后用PBS沖洗2次，置于室溫下晾干。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述過氧化物酶為辣根過氧化物酶；所述制備帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊的步驟是1)鹽酸克倫特羅重氮化后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，偶聯(lián)的比例為7∶1；2)用0.2％土溫20、0.2％PVA等釋放促進(jìn)劑噴涂、或浸潤(rùn)10-20分鐘表面經(jīng)聚丙乙烯處理的玻璃纖維膜載體；3)鹽酸克倫特羅辣根過氧化物酶偶聯(lián)物的貯備液加4％蔗糖和5％PVP保護(hù)液后稀釋至3ng/ul，點(diǎn)加到玻璃纖維膜上，室溫下晾干得到釋放墊。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8或9所述的方法，其特征在于所述底物為過氧化氫；所述顯色劑為四甲基聯(lián)苯胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了鹽酸克倫特羅檢測(cè)試劑條及其制造方法，目的是提供一種能夠快速半定量檢測(cè)鹽酸克倫特羅是否存在的試劑條及其制造方法。檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試劑條，包括設(shè)有凹槽的吸附板，在所述吸附板的凹槽內(nèi)吸附有帶固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜，所述載體膜上放置有帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊；所述試劑條還包括一個(gè)裝有底物和顯色劑的遮光容器。本發(fā)明的產(chǎn)品為一次性用檢測(cè)工具，屬于快速微量檢測(cè)，CBL的檢測(cè)限為1ng/ml，對(duì)于控制瘦肉精等違禁藥物的非法使用具有重要的價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1504750SQ0215385
公開日2004年6月16日 申請(qǐng)日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者楊曙明, 宋榮, 許雷 申請(qǐng)人:國(guó)家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(北京)