專利名稱：與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種受體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-受體激動劑是一種有害物質(zhì)，如果在動物飼料中含有該類物質(zhì)，會直接影響到動物肉類產(chǎn)品的品質(zhì)，從而影響到人類的生命健康。動物體內(nèi)的某些受體能夠與β-受體激動劑特異性結(jié)合，同時受體蛋白已經(jīng)被證實是一個脅迫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子，可以啟動相關(guān)基因的表達以達到促進動物生長的效果。
在外界環(huán)境刺激下，動物體內(nèi)會發(fā)生生理生化特性的變化。動物先是通過多種途徑感受外界環(huán)境的變化，并將細胞外的信號轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)部，然后經(jīng)過一系列磷酸化級鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將信號傳遞給某些轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子，轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子再通過其特異性功能蛋白與β-受體激動劑特異性結(jié)合相互作用，啟動對環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)答的目的基因的表達來提高動物的應(yīng)激反應(yīng)能力。
畜產(chǎn)品作為人類食用物質(zhì)的重要來源，監(jiān)督檢測動物飼料中的有害成分，保證產(chǎn)品的品質(zhì)是飼料檢測工作者的重要任務(wù)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合受體蛋白的編碼基因來源于倉鼠(Golden Hamster)，命名為GhβAR。
能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合受體蛋白的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由792個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第1到第792位堿基，能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由254個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明基因的表達載體及細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達載體，如pGEX-4T-1βAR(圖譜如圖1所示)。
本發(fā)明的受體蛋白能夠與β-受體激動劑類藥物特異性結(jié)合，在檢測β-受體激動劑類藥物，特別是檢測動物飼料及畜產(chǎn)品中的β-受體激動劑類藥物中將得到廣泛應(yīng)用，具有重要的理論及實踐意義。


圖1為GhβAR融合表達基因載體的基因圖譜。
圖2為不同處理的凝膠電泳圖。
具體實施例方式
實施例1、倉鼠GhβAR cDNA的克隆與序列結(jié)構(gòu)分析生長5個月的金色中倉鼠肺經(jīng)洗凈后收集于液氮中研磨至精細程度，置于4mol/L異硫氰酸胍中，再用酸性苯酚/氯仿抽提混合物，取上清液，用異丙醇沉淀總RNA，再重復(fù)上述步驟一次，將RNA溶于DEPC水，保存于-80℃(Davis等編1994，分子生物學(xué)的基本方法[Basic Methods in Molecular Biology]，pp.777)。取1μg總RNA通過一對特異性簡并性引物進行各自獨立的一步逆轉(zhuǎn)錄鏈?zhǔn)綌U增反應(yīng)(RT-PCR)(Takara kit DR2409A)。一對對應(yīng)于金色中倉鼠β-受體蛋白保守域N-端的正向引物(Forward primers)MaARF5’-CAAAGAATTCATGGGGCCACCCGGGAACGAC-3’和對應(yīng)于C-端的反向引物(Reverse Primer)MaARR15’-GCAACTCGAGGAACTTGGAGGACCTTCGGAG-3’，PCR條件為4℃，3分；94℃30秒，60℃30秒，72℃1.5分-30循環(huán)；72℃10分；4℃保存。PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上用于測序。結(jié)果表明該基因與體外包裝序列完全一致，cDNA功能片段長度為792bp，命名為GhβAR，具有序列表中序列1的核苷酸序列。
該基因片段編碼264個氨基酸，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。該蛋白質(zhì)含有一個疏水氨基酸結(jié)構(gòu)保守域，該保守區(qū)具有與β-受體激動劑特異結(jié)合的核心序列與結(jié)合機制，可由此判斷目的化合物的存在。
實施例2、融合表達基因pGEX-4T-1βAR的構(gòu)建利用金色中倉鼠肺新鮮組織，提取總RNA，并依據(jù)序列1設(shè)計一對特異性引物，通過RT-PCR擴增得到一個長度為792bp的包含疏水結(jié)構(gòu)保守域cDNA片段，然后通過EcoRI與XhoI限制性內(nèi)切酶消化該基因片段，經(jīng)純化后熔解于水用于連接。取1μgcDNA片段經(jīng)EcoRI和XhoI酶切消化后的pGEX-4T-1載體，利用DNA連接酶，在16℃溫度下連接12小時以上。連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌，經(jīng)37℃培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再進行酶切與測序確定該基因片段的大小與結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)驗證后的pGEX-4T-1βAR(如圖1所示)轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，以備純化融合蛋白。
實施例3、融合表達基因pGEX-4T-1βMa在大場桿菌中的體外表達鑒定將上述構(gòu)建好的融合表達載體轉(zhuǎn)化于大腸桿菌后，在37℃下培養(yǎng)，經(jīng)IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測表明該基因能夠在大腸桿菌中進行體外翻譯表達。而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株卻沒有蛋白條帶出現(xiàn)，表明該融合表達基因可以純化后做為檢測飼料以及蓄產(chǎn)品中β-受體激動劑的存在與否，結(jié)果如圖2所示，其中M道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，1道為未被誘導(dǎo)的大腸桿菌，2道為經(jīng)誘導(dǎo)的空載體(GST)，3為未經(jīng)誘導(dǎo)的融合載體，4為經(jīng)誘導(dǎo)的融合載體(表達融合分子量為54.8kD).
實施例4、融合表達的pGEX-4T-1βAR基因在大場桿菌中的體外表達產(chǎn)物配體親和力鑒定將上述構(gòu)建好的融合表達載體轉(zhuǎn)化于大腸桿菌后，在37℃下培養(yǎng)。經(jīng)IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)，使該基因能夠在大腸桿菌中進行體外翻譯表達。其產(chǎn)物經(jīng)蛋白質(zhì)粗提及親和柱分離提純后，以3H標(biāo)記的鹽酸克倫特羅(典型的β2-受體激動劑，CBL，瘦肉精)檢驗與配體結(jié)合的親和力，并與未改變的MaβAR比較。單位體積GhβAR結(jié)合的3H CBL毫摩爾數(shù)為MaβAR的142％，達到最大結(jié)合濃度的時間前者為后者的51％。
序列表<160>2<210>1<211>792<212>DNA<213>中倉鼠屬金色中倉鼠(Mesocricetus auratus)<400>1atggggccac ccgggaacga cagtgacttc ttgctgacaa ccaacggaag ccatgtgcca 60gaccacgatg tcactgagga acgggacgaa gcatgggtgg taggcatggc catccttatg 120tcggttatcg tcctggccat cgtgtttggc aacgtgctgg tcatcacagc cattgccaag 180ttcgagaggc tacagactgt caccaactac ttcataacct ccttggcgtg tgctgatcta 240gtcatgggcc tagcggtggt gccgtttggg gccagtcaca tccttatgaa aatgtggaat 300tttggcaact tctggtgcga gttctggact tccattgatg tgttatgcgt cacagccagc 360attgagaccc tgtgcgtgat agcagtggat cgctacattg ctatcacatc gccattcaag 420taccagagcc tgctgaccaa gaataaggcc cgaatggtca tcctaatggt gtggattgta 480tccggcctta cctccttctt gcccattcag atgcactggt accgtgccac ccaccagaaa 540gccatcgact gctatcacaa ggagacttgc tgcgacttct tcacgaacca ggcctacgcc 600attgcttcct ccattgtatc tttctacgtg cctctagtgg tcatggtctt tgtctattcc 660agggtcttcc aggtggccaa aaggcagctc cagaagatag acaaatctga gggaagattc 720cactccccaa acctcggcca ggtggagcag gatgggcgga gtgggcacgg actccgaagg 780tcctccaagt tc 792<210>2<211>264<212>PRT<213>中倉鼠屬金色中倉鼠(Mesocricetus auratus)<400>2Met Gly Pro Pro Gly Asn Asp Ser Asp Phe Leu Leu Thr Thr Asn1 5 10 15Gly Ser His Val Pro Asp His Asp Val Thr Glu Glu Arg Asp Glu20 25 30Ala Trp Val Val Gly Met Ala Ile Leu Met Ser Val Ile Val Leu35 40 45Ala Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Lys50 55 60
Phe Glu Arg Leu Gln Thr Val Thr Asn Tyr Phe Ile Thr Ser Leu65 70 75Ala Cys Ala Asp Leu Val Met Gly Leu Ala Val Val Pro Phe Gly80 85 90Ala Ser His Ile Leu Met Lys Met Trp Asn Phe Gly Asn Phe Trp95 100 105Cys Glu Phe Trp Thr Ser Ile Asp Val Leu Cys Val Thr Ala Ser110 115 120Ile Glu Thr Leu Cys Val Ile Ala Val Asp Arg Tyr Ile Ala Ile125 130 135Thr Ser Pro Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Leu Thr Lys Asn Lys Ala140 145 150Arg Met Val Ile Leu Met Val Trp Ile Val Ser Gly Leu Thr Ser155 160 165Phe Leu Pro Ile Gln Met His Trp Tyr Arg Ala Thr His Gln Lys170 175 180Ala Ile Asp Cys Tyr His Lys Glu Thr Cys Cys Asp Phe Phe Thr185 190 195Asn Gln Ala Tyr Ala Ile Ala Ser Ser Ile Val Ser Phe Tyr Val200 205 210Pro Leu Val Val Met Val Phe Val Tyr Ser Arg Val Phe Gln Val215 220 225Ala Lys Arg Gln Leu Gln Lys Ile Asp Lys Ser Glu Gly Arg Phe230 235 240His Ser Pro Asn Leu Gly Gln Val Glu Gln Asp Gly Arg Ser Gly245 250 255His Gly Leu Arg Arg Ser Ser Lys Phe260 26權(quán)利要求
1.能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合受體蛋白的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于所述能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合受體蛋白的編碼基因是序列表中的SEQ ID №1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述SEQ ID №1的編碼框是自5’端第1位核苷酸到第792位核苷酸。
4.能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的能夠與β-受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白，其特征在于它具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的表達載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體，其特征在于所述載體為pGEX-4T-1βAR。
8.含有權(quán)利要求1所述基因的細胞系。
9.權(quán)利要求4所述的受體蛋白在檢測β-受體激動劑類藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求4所述的受體蛋白在檢測動物飼料及畜產(chǎn)品中β-受體激動劑類藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與β－受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，目的是提供一種能夠與β－受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的能夠與β－受體激動劑類藥物特異結(jié)合受體蛋白的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID№1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。能夠與β－受體激動劑類藥物特異結(jié)合的受體蛋白，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID№2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
文檔編號G01N33/68GK1504570SQ02153850
公開日2004年6月16日 申請日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者楊曙明, 程憲國, 宋榮, 許雷 申請人:國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京)