萊克多巴胺檢測試紙卡及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測領(lǐng)域，尤其涉及萊克多巴胺的檢測產(chǎn)品，更具體的說是 采用一種新抗體的萊克多巴胺的膠體金檢測試紙卡與ELISA檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] "瘦肉精"是一類屬于腎上腺類神經(jīng)興奮劑藥物。其能使牲畜在代謝過程中促進蛋 白質(zhì)合成，加速脂肪的轉(zhuǎn)化和分解，繼而提高牲畜的生長速度，增加瘦肉率；同時還能減少 飼料使用、使肉品提早上市、降低成本。國務院食品安全委員會辦公室《"瘦肉精"專項整治 方案》（食安辦[2011] 14號）規(guī)定的"瘦肉精"品種目錄為：鹽酸克倫特羅（Clenbuterol Hydrochloride)、萊克多巴胺（Ractopamine，Rac)、沙丁胺醇（Salbutamol)等。其中，萊克 多巴胺（Rac)易在動物組織，特別是內(nèi)臟中積聚殘留，并通過食物鏈進入人體。繼而引起骨 骼肌收縮增強，破壞快縮肌和慢縮肌纖維間的融合現(xiàn)象，引發(fā)肌肉震顫，出現(xiàn)面色潮紅、頭 痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應，嚴重的可能危及生命。許多國家都將萊克多巴 胺列為違禁物，我國已禁止在畜禽身上使用萊克多巴胺。
[0003]目前，國內(nèi)外用于檢測萊克多巴胺的常用方法有：酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA)、 膠體金免疫層析法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、色譜法、毛細管電泳法、免疫傳 感器法等。色譜法、毛細管電泳法、免疫傳感器法檢測靈敏，但所需的儀器設備昂貴，樣品前 處理復雜，一次檢測樣品量少，檢測時間長，且不易普及，而ELISA、膠體金免疫層析法不需 要借助昂貴的儀器，且樣品前處理簡單，具有高通量等優(yōu)點。但目前已有的檢測萊克多巴胺 的酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金試紙卡的檢測靈敏度或準確度還不是十分理想，分析其原因， 主要在于所采用的抗萊克多巴胺抗體還有待提高。由于萊克多巴胺為化學小分子，其表面 位點少，因而為制備其抗體帶來了較大的困難，尤其是特異性較高的抗體，目前市用抗體的 特異性普遍較低，半數(shù)抑制濃度（IC50)較高，無法滿足應用的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供能有效的、特異性結(jié)合萊克多巴胺（Rac)的抗體，及其檢測萊克 多巴胺（Rac)在動物體內(nèi)殘留的用途。更具體地說：
[0005] 本發(fā)明第一個目的是提供一種抗體，所述抗體特異性結(jié)合萊克多巴胺（Rac)，所述 抗體包括：
[0006] 重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :2所示的 HCDR1、如序列SEQ ID NO :3所示的HCDR2和/或如序列SEQ ID NO :4所示的HCDR3 ;
[0007] 以及輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列含有以下的互補決定區(qū)：如序列SEQ ID NO :6所 示的LCDR1、如序列SEQ ID NO :7所示的LCDR2和/或如序列SEQ ID NO :8所示的LCDR3。
[0008] 優(yōu)選的是本發(fā)明中的抗體含有氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的重鏈可變區(qū)和氨 基酸序列如SEQ ID N0:5所示的輕鏈可變區(qū)。
[0009] 更優(yōu)選的本發(fā)明中抗體的編碼基因含有如SEQ ID N0:9所示的重鏈可變區(qū)和如 SEQ ID NO: 10所示的輕鏈可變區(qū)。
[0010] 本發(fā)明第二個目的是提供一種單鏈抗體，所述單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。優(yōu)選的，所述單鏈抗體中不含由六個組氨酸構(gòu)成的HIS標簽。
[0011] 本發(fā)明第三個目的是提供一種編碼上述單鏈抗體的核苷酸序列，所述核苷酸序列 如 SEQ ID NO: 12 所示。
[0012] 本發(fā)明第四個目的是提供一種含有上述核苷酸序列的表達載體。
[0013] 本發(fā)明第五個目的是提供一種含有上述表達載體的重組宿主細胞，所屬宿主細胞 可以是大腸桿菌、酵母或哺乳動物細胞，優(yōu)選為畢赤酵母。
[0014] 本發(fā)明第六個目的是提供一種生產(chǎn)上述抗體的方法，包括：
[0015] 1)在合適的條件下培養(yǎng)上述重組宿主細胞表達抗體；
[0016] 2)然后從宿主菌中純化、收集抗體。
[0017] 本發(fā)明第七個目的是提供上述抗體用于檢測萊克多巴胺（Rac)殘留的新用途。
[0018] 本發(fā)明第八個目的在于提供一種檢測萊克多巴胺的膠體金試紙卡或ELISA試劑 盒，所述膠體金試紙卡或ELISA試劑盒含有上述所述抗體。
[0019] 優(yōu)選的，上述所述ELISA試劑盒，包括：包被了抗原萊克多巴胺的載體蛋白偶聯(lián)物 的酶標板、含有上述所述抗體的抗體工作液、酶標物、萊克多巴胺標準液、顯色液、終止液、 濃縮洗滌液。更優(yōu)選的，所述載體蛋白為BSA、OVA、KLH。
[0020] 優(yōu)選的，上述所述抗體工作液是用酶稀釋液將上述抗體稀釋得到，所述酶稀釋液 是0.0 lM的PBST (pH7. 4)緩沖液，其中含有質(zhì)量體積比為0. 335%的Na2HPO4 ·12Η20、0. 02% NaH2PO4 · 2Η20、0· 8% NaCl、0· 02% KCl、0· 1% Casein、?！?05% BSA。
[0021] 優(yōu)選的，上述所述酶標物為抗His抗體-HRP、抗His抗體-AP、Protein L-HRP或 Protein L-AP0
[0022] 優(yōu)選的，上述所述顯色液為TMB顯色液或BCIP/NBT顯色液。
[0023] 優(yōu)選的，上述所述終止液為2M的H2SO4。
[0024] 優(yōu)選的，上述所述濃縮洗滌液為含0· 05% TWEEN-20的0· 2M PBS。
[0025] 本發(fā)明的第九個目的在于提供一種檢測萊克多巴胺的方法，包括以下步驟：
[0026] 1.編號：將樣本和標準品對應的微孔按序編號，每個樣本及標準品設復孔平行；
[0027] 2.加樣：按序每孔加入標準品、樣本、酶標物以及抗體工作液，于室溫避光反應；
[0028] 3.洗板：反應后，洗板并干燥處理；
[0029] 4.顯色：加入顯色液，于室溫避光反應；
[0030] 5.終止及讀數(shù)：加入終止液，測定每孔OD值。
[0031] 6.結(jié)果判定：
[0032] i).定性判定：由樣品孔的吸光率與標準品孔的吸光率的簡單對比而來判定：樣 品孔的顏色比某一標準品孔的顏色淺則樣品中萊克多巴胺的濃度比該孔所含標準品的濃 度高，樣品孔的顏色比某一標準品孔的顏色深則樣品中萊克多巴胺的濃度比該孔所含標準 品的濃度低；
[0033] ii).定量分析：以標準品的吸光度平均值與第一個標準（Oppb)的吸光度值的百 分比為縱坐標，以萊克多巴胺標準品的濃度（PPb)的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣 本的吸光度平均值與第一個標準（Oppb)的吸光度值的百分比代入標準曲線中，從而計算 出樣本中萊克多巴胺的實際濃度。
[0034] 本發(fā)明的第十個目的在于提供一種檢測萊克多巴胺的膠體金試紙卡，包括樣品墊 1、金標墊6、硝酸纖維素膜2、吸收墊3、襯板7,樣片墊1、金標墊6、硝酸纖維素膜2、吸收墊 3兩兩相鄰并部分層疊從左至右依次粘貼于襯板7上，所述硝酸纖維素膜2上有質(zhì)控帶4 (C 線）和檢測帶5 (T線），所述金標墊6內(nèi)含有經(jīng)膠體金標記的上述抗萊克多巴胺抗體。
[0035] 優(yōu)選的，質(zhì)控帶4位置包被有抗His抗體或Protein L，檢測帶5位置包被有萊克 多巴胺半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物。
[0036] 本發(fā)明所提供抗體制備的ELISA檢測試劑盒和膠體金試紙卡的靈敏度和準確度 相比市售產(chǎn)品更加理想，并且特異性很好。
【附圖說明】
[0037] 圖1.抗體K07重鏈、輕鏈可變區(qū)基因電泳圖。條帶1為標準DNA，條帶2為K07抗 體重鏈可變區(qū)DNA，Lane3為K07抗體輕鏈可變區(qū)DNA
[0038] 圖2.抗體K07結(jié)構(gòu)示意圖。Vh表示重鏈可變區(qū)序列，V肩示輕鏈可變區(qū)序列，His 標簽為六個組氨酸。
[0039] 圖3.抗體表達PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0040] 圖4.重組畢赤酵母菌株誘導表達上清培養(yǎng)液鑒定圖。圖a為SDS-PAGE電泳鑒定 圖、圖b為Western blot鑒定圖。
[0041] 圖5.抗體純化效果圖（SDS-PAGE)。條帶1-10為不同收集管所獲的抗體K07。
[0042] 圖6.抗體K07的Western Blot鑒定圖。泳道1為標準蛋白質(zhì)、泳道2為Rac-BSA、 泳道3為Rac-OVA、泳道4為Cle-BSA、泳道5為Cle-OVA、泳道6為Sal-BSA、泳道7為 Sal-OVA0
[0043] 圖7.本發(fā)明萊克多巴胺的ELISA檢測試劑盒的標準曲線。其中橫坐標為萊克多 巴胺標準品濃度對數(shù)（Ig);縱坐標為萊克多巴胺標準品百分吸光率。
[0044] 圖8.本發(fā)明萊克多巴胺膠體金檢測試紙卡結(jié)構(gòu)示意圖。
[0045] 其中1為樣品墊、2為硝酸纖維素膜、3為吸收墊、4為質(zhì)控線（C線）、5為檢測線 (T線）、6為金標墊、7為襯板 具體實施例
[0046] 定義
[0047] "抗體"又稱免疫球蛋白，是一類由B淋巴細胞分泌的大型Y形蛋白質(zhì)，能夠通過Y 形的其中兩個分叉頂端的互補位點（抗原結(jié)合位）特異性結(jié)合靶抗原的免疫球蛋白分子， 所述靶抗原如蛋白質(zhì)、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。該術(shù)語不僅包括完整的多 克隆抗體，也包括其片段（例如Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv)、單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白和任一包含抗原識別位點的其他改 變構(gòu)型的免疫球蛋白分子。抗體包括任一類或多類的抗體，如IgG、IgA、IgD、IgE或IgM(或 其亞類），并且抗體不需要為任一特定類。
[0048] "單鏈抗體"（scFv)指的是抗體的重鏈可變區(qū)（Vh)和輕鏈可變區(qū)（\)通過15~ 20個氨基酸短肽（linker)連接形成的單一鏈融合蛋白，用于連接的linker通常富含甘氨 酸和絲氨酸，以利于單鏈抗體的穩(wěn)定性與柔韌性。連接方式可將\的N端連接至V "的C末 端，或者相反。盡管去除了恒定區(qū)并引入linker，單鏈抗體依然保留了抗體對抗原的特異 性，且其具有分子量小、穿透力強和抗原性弱等特