特生物醫(yī)藥（上海）有限公司）。
[0093] 將上述獲得的K07重組融合蛋白基因工程菌株分別接種于BMGY培養(yǎng)基中，30°C， 220rpm培養(yǎng)至菌體密度到0D 6。。= 2. 0~6. 0,每隔24小時補加甲醇至終濃度為I. 0% (v/ v)。一周后，收集發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0094] c)融合蛋白純化
[0095] 主要采用組氨酸標(biāo)簽親和柱純化抗體K07融合蛋白，預(yù)裝柱子選擇為HisTrap HP，具體步驟如下：
[0096] (1)發(fā)酵液的除雜預(yù)處理：將上述表達得到抗體K07融合蛋白發(fā)酵液上清， 離心收集上清，并加入結(jié)合緩沖液，使得上清終濃度為300mM NaCl，20mM NaH2PO4, IOmM Imidazole，調(diào) ρΗ7· 5,0· 45 μ m 濾膜過濾。
[0097] (2) Hi sTrap HP親和柱純化：運用全自動智能蛋白純化系統(tǒng)（AKTA avant 150， 購自GE healcare公司）對預(yù)處理獲得的抗體K07融合蛋白發(fā)酵液進行親和純化，柱 子為 HisTrap HP(17-5248-02,購自 GE healcare 公司）。結(jié)合緩沖液為 300mM NaCl， 20mM NaH2PO4, IOmM Imidazole，ρΗ7· 5,洗脫緩沖液為 300mM NaCl，20mM NaH2P04,500mM Imidazole，pH7. 5。洗脫時進行線性洗脫，并收集各個洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳鑒定純 度，由附圖5可知，純化后的蛋白純度達到95%以上；合并符合要求的收集管，更換緩沖液 為PBS溶液并超濾濃縮（lmg/ml)，過濾除菌于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0098] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，可將雜交瘤細胞株C07的抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)之間加入 連接肽（GGGGS) 3,而不引入六個組氨酸，重組表達成不帶His標(biāo)簽的融合蛋白，此時蛋白的 純化可采用Protein L蛋白親和純化方法（具體參照GE公司親和層析介質(zhì)Capto L)。
[0099] 實施例4.抗體K07的件能鑒宙
[0100] L 抗體 K07 的 Western blot 鑒定
[0101] a.聚丙烯酰胺凝膠電泳：配置12%分離膠、5%濃縮膠，分別上樣標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)、萊克多巴胺偶聯(lián)BSA (Rac-BSA)、萊克多巴胺偶聯(lián)OVA (Rac-OVA)、鹽酸克倫特羅偶聯(lián) BSA(Cle-BSA)、鹽酸克倫特羅偶聯(lián)OVA(Cle-OVA)、沙丁胺醇偶聯(lián)BSA(Sal-BSA)、沙丁胺醇 偶聯(lián)OVA(Cle-OVA)(上述抗原均購買于上海佑隆公司），恒壓下電泳1小時；
[0102] b.轉(zhuǎn)膜：恒流（35mA/膜）條件下轉(zhuǎn)膜1小時，將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 至兩張硝酸纖維素膜上。考馬斯亮藍G250對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進行染色，觀察蛋白 的殘留情況；
[0103] c.封閉：含5%脫脂奶的TBST緩沖液封閉（封閉液），4°C過夜；封閉后洗滌液 (TBST，詳見 TaKaRa 公司 TBST buffer)洗滌一次，10 分鐘；
[0104] d.抗原抗體反應(yīng)：封閉液稀釋（按1:400體積比）辣根過氧化物酶標(biāo)記 K07 (K07-HRP，lmg/mL，本公司采用經(jīng)典過碘酸鈉法標(biāo)記），加入上述硝酸纖維素膜中，室溫 反應(yīng)1小時；TBST洗滌5次，每次10分鐘；
[0105] e.顯色及拍照：吸干硝酸纖維素膜上殘留液體，硝酸纖維素膜加入2mL穩(wěn)定型過 氧化物酶溶液（ImL)與魯米諾/增強劑溶液（ImL)的混合液（購買于Thermo公司），均勻 潤濕硝酸纖維素膜的表面，室溫避光反應(yīng)一分鐘后于凝膠成像系統(tǒng)（購買于GE公司）拍 照，留取結(jié)果。
[0106] 實驗結(jié)果（附圖6)表明，K07抗體與萊克多巴胺具有特異性反應(yīng)，未與鹽酸克倫 特羅及沙丁胺醇發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0107] 2.抗體K07在萊克多巴胺膠體金檢測平臺的性能評價
[0108] 除下表中的參數(shù)及封閉液（0. 5% Casein+0. 05% PEG2000)外，其余試紙卡的制備 步驟及參數(shù)同實施例8。分別制備含5ppb，IOppb，50ppb，IOOppb的含萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品的 陽性豬尿，與陰性豬尿一起進行檢測。
[0109] K07抗萊克多巴胺抗體與商品化萊克多巴胺抗體在相同緩沖液中的檢測結(jié)果表 明，本發(fā)明所制備抗體可用于膠體金檢測試紙卡的構(gòu)建，且尿液樣本檢測靈敏度與市售試 紙卡相當(dāng)，優(yōu)化后有望完全達到市售試紙卡的水平；本發(fā)明抗體用于構(gòu)建膠體金試紙卡， K07用量以及C線抗體用量更少，更經(jīng)濟節(jié)約。
[0111] 備注：商品化萊克多巴胺抗體購買于武漢華美生物工程有限公司
[0112] 實施例5.本發(fā)明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒的制備
[0113] 本ELISA試劑盒采用間接競爭ELISA方法。
[0114] 1.檢測板的制備：包被緩沖液（含質(zhì)量體積比為0. 3%的似20)3及0. 58%的 NaHCO3)稀釋萊克多巴胺偶聯(lián)牛血清白蛋白偶聯(lián)物（Rac-BSA)稀釋至1 μ g/mL，以IOOyL/ 孔加入96孔酶標(biāo)板中，2~8°C包被過夜；次日，用含0. 05% TWEEN-20的PBST洗板一遍； 加入200 μ L/孔的封閉液（含質(zhì)量體積比為0. 3 % Na2C03、0. 58 % NaHC03、10 %蔗糖、體積比 10%小牛血清）于室溫（25°C )封閉2小時，棄去液體，低溫干燥，封裝備用。
[0115] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，由于萊克多巴胺為小分子化合物，較難直接包被至酶標(biāo)板 上，一般會在其上偶聯(lián)載體蛋白再進一步包被到酶標(biāo)板上，因此，萊克多巴胺偶聯(lián)的牛血清 白蛋白（BSA)也完全可以用卵清白蛋白（OVA)、鑰孔血藍蛋白（KLH)等載體蛋白替代。
[0116] 2.酶稀釋液、抗體工作液，酶標(biāo)抗體的配制：
[0117] ①酶稀釋液：0. 0IM的PBST (pH7. 4)緩沖液，含有質(zhì)量體積比為0. 335 %的 Na2HPO4 · 12Η20、0· 02% NaH2PO4 · 2Η20、0· 8% NaCl、0· 02% KCl、0· 1% Casein、。· 05% BSA
[0118] ②抗體工作液的制備：用酶稀釋液將K07抗體以1/500000體積比稀釋，渦旋混勻， 分裝（IOmL/瓶）；
[0119] ③酶標(biāo)抗體的制備：用酶稀釋液將鼠抗His抗體-HRP以1/2000體積比稀釋，渦旋 混勾，分裝7mL/瓶。
[0120] 3. TMB顯色液、終止液以及萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)液：
[0121] ① TMB顯色液：TMB (購自SIGMA公司）的濃度是0. 3g/L，分裝為14mL/瓶；
[0122] ②終止液：2M的H2SO4，分裝為7mL/瓶；
[0123] ③、④、⑤、⑥、⑦、⑧萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)液：各lmL，濃度分別為0ppb，0. lppb， 0· 3ppb，0· 9ppb，2. 7ppb，8. lppb。
[0124] 4. 20 倍濃縮洗滌液：含 0. 05% TWEEN-20 的 0. 2M PBS，分裝為 40mL/ 瓶。
[0125] 5.組裝：將所有瓶裝試劑插于盒托的對應(yīng)孔內(nèi)，與酶聯(lián)板、說明書、自封袋、封板 膜一起放入紙盒，儲存于2~8°C，檢驗合格后貼檢封簽。
[0126] 根據(jù)實際需要本實施例中酶標(biāo)抗體完全可以用抗His抗體-AP、Protein L-HRP、 ProteinL-AP替代，顯色液也完全可以用BCIP/NBT顯色液替代。
[0127] 實施例6.本發(fā)明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒的伸用方法
[0128] 1.樣本前處理：
[0129] 尿液樣本：清亮尿液樣本可直接用于測定，渾濁尿液須先3000g以上離心以獲得 上清；取50uL用于樣本檢測；
[0130] 豬肉或豬肝等樣本：稱取2±0.05g勻漿樣本至50mL離心管中，加入4mL洗滌工作 液，再加入2mL 0.1 M鹽酸，渦旋30s，室溫條件下離心（彡3000g，5分鐘）；取上清液lmL， 加入30uL 0. 5M NaOH至樣本液PH值在6. 5~8. 0之間，混勻；取50uL用于樣本檢測；
[0131] 2.將所需試劑及酶標(biāo)板從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（25°C )平衡；
[0132] 3.用去離子水將20倍濃縮洗滌液按體積比1:19進行稀釋制成洗滌工作液，用于 酶標(biāo)板的洗滌，臨用前進行配制；
[0133] 4.編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的微孔按序編號，每個樣本及標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)復(fù)孔平行；
[0134] 5.加樣：在對應(yīng)的微孔中按序分別加入50 μ L/孔標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，50 μ L/孔酶標(biāo)抗 體以及50 μ L/孔抗體工作液，輕輕振蕩混勻，于室溫（25°C )避光反應(yīng)40分鐘；
[0135] 6.洗板：反應(yīng)時間達到后，將孔內(nèi)液體甩干，用300 μ L/孔的洗滌工作液洗板，充 分洗滌4~5次，每次間隔10s，甩干液體，用吸水紙拍干；
[0136] 7.顯色：加入100 μ L/孔的TMB顯色液，輕輕振蕩混勾，于室溫（25°C )避光反應(yīng) 15分鐘；
[0137] 8.終止及讀數(shù)：加入50 μ L/孔的終止液，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處， 測定每孔OD值。
[0138] 9.結(jié)果判定：
[0139] i).粗略判定：由樣品孔的吸光率與標(biāo)準(zhǔn)品孔的吸光率的簡單對比而來判定：樣 品孔的顏色比某一標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色淺則樣品中萊克多巴胺的濃度比該孔所含標(biāo)準(zhǔn)品的濃 度高，樣品孔的顏色比某一標(biāo)準(zhǔn)品孔的顏色深則樣品中萊克多巴胺的濃度比該孔所含標(biāo)準(zhǔn) 品的濃度低；
[0140] ii).定量分析：以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度平均值與第一個標(biāo)準(zhǔn)（Oppb)的吸光度值的百 分比為縱坐標(biāo)，以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（PPb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣 本的吸光度平均值與第一個標(biāo)準(zhǔn)（Oppb)的吸光度值的百分比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從而計算 出樣本中萊克多巴胺的實際濃度。
[0141] 實施例7.本發(fā)明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒的件能鑒宙
[0142] 本實施案例將本發(fā)明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒與市售同類試劑盒進行檢測 性能的比較。
[0143] 兩種試劑盒分別檢測70份新