專利名稱：一種基于量子點(diǎn)的免疫熒光檢測鹽酸克倫特羅的方法及專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于量子點(diǎn)的免疫熒光檢測鹽酸克倫特羅的方法及專用試劑盒。
背景技術(shù)：
鹽酸克侖特羅(ClenbuteroLCL)屬于β -興奮劑，近年來被非法添加到飼料中以提高脂肪型動(dòng)物的瘦肉率和加速動(dòng)物生長，因其添加劑量是治療劑量的5-10倍，以至于在動(dòng)物體內(nèi)殘留量高而給消費(fèi)者帶來危害。目前，用于鹽酸克倫特羅殘留物定量檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是色譜/質(zhì)譜法，但其樣品前處理過程繁瑣費(fèi)時(shí)，檢測費(fèi)用高?；诟偁幮悦嘎?lián)免疫反應(yīng)原理的ELISA方法不需進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理過程，檢測時(shí)間相對短，但其精度不夠，只能用于定性篩查，無法用于定量確證。當(dāng)前畜產(chǎn)品中檢測鹽酸克倫特羅殘留及其污染狀況調(diào)查的樣品數(shù)量大，任務(wù)重，花費(fèi)高，檢測周期過長。因此，急需檢測結(jié)果穩(wěn)定、快速、經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)方法。量子點(diǎn)(Quantum Dots, QDs)標(biāo)記材料是近年來發(fā)展起來的一類新型材料，包括 II-VI族和III-V族半導(dǎo)體納米晶。由于量子點(diǎn)突出的發(fā)光和吸收特性，使其具有熒光壽命長、寬激發(fā)光譜、窄發(fā)射光譜、可精確調(diào)諧的發(fā)射波長、很高的光化學(xué)穩(wěn)定性、可進(jìn)行多色標(biāo)記等優(yōu)越特性，采用其作為標(biāo)記材料，可實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)分子的超微量檢測。由于適用于免疫診斷試劑的量子點(diǎn)標(biāo)記材料必須滿足量子產(chǎn)率高、熒光強(qiáng)、生物相容性好、高度穩(wěn)定及成本低等要求，而現(xiàn)行國外商業(yè)化的量子點(diǎn)其量子產(chǎn)率多在40%以下，其尺寸偏小，需要用激光光學(xué)儀器來照射激發(fā)，目前僅能應(yīng)用在細(xì)胞免疫熒光檢測和流式細(xì)胞檢測和分選等方面，因此國際市場上還沒有量子點(diǎn)免疫檢測試劑問世。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測鹽酸克倫特羅的免疫熒光檢測試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測鹽酸克倫特羅的免疫熒光檢測試劑盒，包括鹽酸克倫特羅包被原和量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體。上述試劑盒中，所述鹽酸克倫特羅抗體為抗體效價(jià)為IO6以上(具體為IO6)、抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M4或IO7 IOi1或IOi1的鹽酸克倫特羅單克隆抗體；具體為抗體效價(jià)為106、抗體親和常數(shù)為IO8M-1的鹽酸克倫特羅單克隆抗體，所述鹽酸克倫特羅單克隆抗體購自北京圣迪隆生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為CL-083。所述量子點(diǎn)為表面羧基含量為IX 10_3 9X 10-3mmol/mg或1 X 10_3 6X 10_3mmol/mg或5X 10_3mmol/mg的水溶性CcKe/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)；所述量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為40 70%或50 70%或60% ；所述量子點(diǎn)的激發(fā)光波長為345nm，發(fā)射波長是 620nmo上述任一所述試劑盒中，所述量子點(diǎn)的粒徑為10 20nm，所述粒徑具體為13 20nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為20nm ；其粒徑的偏差(CV)在10 30%之間，具體為10 20%
3之間，再具體為15% ；上述任一所述試劑盒中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體中，所述量子點(diǎn)上的羧基與所述鹽酸克倫特羅抗體上的氨基形成肽鍵，進(jìn)而使所述量子點(diǎn)與所述鹽酸克倫特羅抗體連接。上述任一所述試劑盒中，所述鹽酸克倫特羅包被原為鹽酸克倫特羅與載體蛋白的偶聯(lián)物，其中所述鹽酸克倫特羅與所述載體蛋白通過鹽酸克倫特羅中的羧基與載體蛋白中的氨基形成的肽鍵而連接；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、 甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白、卵清蛋白、纖維蛋白原和兔和雞的丙種球蛋白中的任一種。上述任一所述試劑盒中，所述試劑盒中還包括鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、洗滌液、含有孔的聚苯乙烯板、包被緩沖液和封閉液；所述鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品為4-氨基- α -(叔丁胺甲基)_3，5- 二氯苯甲醇鹽酸
^rt.；所述稀釋液為PBS緩沖液；具體為0. 02Μ、ρΗ7. 4的PBS緩沖液。所述洗滌液為PBST緩沖液；具體按照如下方法制備取0. 2ml TWeen20及0. Ig的 NaN3溶于所述稀釋液中，溶解后用稀釋液定容至1L。所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液；具體為0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液。所述封閉液為含有用于包被的蛋白的PBS緩沖液；所述用于包被的蛋白為BSAjP 清蛋白和血藍(lán)蛋白中的任一種。具體按照如下方法制備將IOg BSA和0. 2mlTween20溶于上述稀釋液中，溶解后用稀釋液定容至1L。上述任一所述試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)品為如下溶液形式的標(biāo)準(zhǔn)品用所述稀釋液將所述4-氨基-α -(叔丁胺甲基)_3，5- 二氯苯甲醇鹽酸鹽稀釋成如下各個(gè)濃度的溶液 0. 001、0. 005、0. 0U0. 05、0· 1、0· 5、1、5、10ug/L。上述任一所述試劑盒中，所述鹽酸克倫特羅包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法為用所述包被緩沖液稀釋所述鹽酸克倫特羅包被原得到10yg/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。上述任一所述試劑盒中，所述量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體以如下溶液形式存在于試劑盒中將每25ug所述量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體用5ml所述稀釋液稀釋得到的溶液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測樣品中鹽酸克倫特羅的方法。本發(fā)明所提供的檢測樣品中鹽酸克倫特羅的方法，包括如下步驟用上述任一所述的試劑盒對待測樣品進(jìn)行檢測，所述待測樣品為動(dòng)物肌肉組織樣本、動(dòng)物尿樣或飼料。所述待測樣品具體為豬尿。本發(fā)明檢測方法的原理采用量子點(diǎn)作為熒光信號標(biāo)記分子，將鹽酸克倫特羅抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，加入鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品或檢測樣品，以及量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體，使其形成抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物，用熒光檢測儀激發(fā)并檢測該免疫熒光復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，通過與測定形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得待測鹽酸克倫特羅的濃度?？乖?抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的形成是加入量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體后，包被的鹽酸克倫特羅抗原與檢測樣品中的鹽酸克倫特羅競爭性地結(jié)合鹽酸克倫特羅抗體，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物。抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的形成是同時(shí)加入量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體及檢測樣品后，包被在聚苯乙烯微孔中的鹽酸克倫特羅抗原與檢測樣品中的鹽酸克倫特羅競爭性地與鹽酸克倫特羅抗體結(jié)合，其中與檢測樣品結(jié)合剩余的鹽酸克倫特羅抗體與包被在微孔板中的鹽酸克倫特羅抗原發(fā)生特異結(jié)合后形成固定在微孔板中的抗原-抗體二元免疫復(fù)合物。本發(fā)明的鹽酸克倫特羅免疫熒光檢測試劑與量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫熒光檢測技術(shù)相關(guān)，是采用量子點(diǎn)作為熒光信號標(biāo)記材料，進(jìn)行免疫熒光定量測定的一類方法，該技術(shù)整合了熒光量子點(diǎn)納米材料化學(xué)合成、表面修飾及標(biāo)記技術(shù)、間接競爭式免疫檢測技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明之所以能檢測鹽酸克倫特羅，在于采用了一種基于量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫熒光定量測定的方法，即將鹽酸克倫特羅抗原直接包被在聚苯乙烯板的微孔中，基于量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭免疫熒光檢測法的測定原理，在加入鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品或檢測樣品，以及量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體后，通過檢測結(jié)合到聚苯乙烯板微孔中的抗原-抗體二元免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)對鹽酸克倫特羅的檢測結(jié)合到聚苯乙烯板微孔的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體的數(shù)量不同，所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度也不同。在一定濃度范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度值的高低與樣品中的鹽酸克倫特羅的含量成反比。通過添加不同濃度的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品可制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線查詢各檢測樣品的熒光強(qiáng)度值可得到對應(yīng)的鹽酸克倫特羅藥物的濃度值。其具體的技術(shù)步驟包括(一 )熒光量子點(diǎn)標(biāo)記探針的制備采用適合的水溶性熒光量子點(diǎn)，活化其表面的羧基后，采用化學(xué)偶聯(lián)的方式將鹽酸克倫特羅抗體定向連接到量子點(diǎn)表面。(二)包被抗原采用與牛血清白蛋白偶聯(lián)的鹽酸克倫特羅抗原作為包被抗原，通過物理吸附的方法將此抗原直接包被于聚苯乙烯板微孔中。(三)抗原-抗體熒光免疫復(fù)合物的形成于上述包被好的聚苯乙烯板微孔中加入鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品或檢測樣品，以及量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體，吸附在孔內(nèi)的鹽酸克倫特羅抗原與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中的鹽酸克倫特羅競爭性的與鹽酸克倫特羅抗體相結(jié)合， 通過抗原-抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物。(四)定量熒光檢測采用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測上述所形成的抗原-抗體熒光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度；激發(fā)波長345nm ；發(fā)射波長620nm ；通過測定系列對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過與測定形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比獲得待測鹽酸克倫特羅的濃度。所述抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的形成是加入量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體后，包被的鹽酸克倫特羅抗原與標(biāo)準(zhǔn)或樣品中的鹽酸克倫特羅競爭性地結(jié)合鹽酸克倫特羅抗體，通過抗原-抗體的特異性結(jié)合形成抗原-抗體二元免疫復(fù)合物，其上標(biāo)記的量子點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后可發(fā)熒光，本發(fā)明使用的激發(fā)光波長是345nm，發(fā)射波長是620nm，得到發(fā)紅光的抗原-抗體免疫復(fù)合物。所述熒光強(qiáng)度的檢測是用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)并檢測所形成的抗原-抗體二元發(fā)光免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，由于所采用的抗體是固定濃度的，通常待測樣品中的鹽酸克倫特羅藥物的濃度越高，被抗體捕獲的藥物量越多，與包被的鹽酸克倫特羅抗原結(jié)合的抗體越
5少，測得的熒光強(qiáng)度值越低。由于量子點(diǎn)在與抗體進(jìn)行偶聯(lián)中要用超速離心進(jìn)行分離純化，粒徑太小的量子點(diǎn)如Snm和IOnm的無法離心，偶聯(lián)后無法純化，使用效果較差；粒徑太大的量子點(diǎn)如60nm以上的比較容易聚集，用在試劑盒上均一性較差。所述量子點(diǎn)的粒徑為10 20nm，所述粒徑具體為13 20nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為20nm ；其粒徑的偏差(CV)在10 30%之間，較好為10 20%之間，優(yōu)選15%。量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率及其熒光強(qiáng)度直接決定了檢測靈敏度及其準(zhǔn)確性的高低， 傳統(tǒng)方法制備的量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率通常都低于40%，熒光強(qiáng)度較弱。為提高其靈敏度及準(zhǔn)確性，所述量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為40 70%，所述量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率具體為50 70%，所述量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)品尤其優(yōu)選為60%。為用于鹽酸克倫特羅殘留物檢測，量子點(diǎn)表面需帶有易于與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以是羧基、氨基等基團(tuán)，優(yōu)化的基團(tuán)是帶羧基的表面官能團(tuán)，通常采用化學(xué)方法連接抗體，即用EDC和NHS活化量子點(diǎn)后，再與抗體發(fā)生羧合反應(yīng)而完成偶聯(lián)反應(yīng)。在將鹽酸克倫特羅抗體和量子點(diǎn)以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體前，還包括活化所述量子點(diǎn)表面官能團(tuán)的步驟。量子點(diǎn)表面的羧基含量不同會影響到檢測的靈敏度，為提高靈敏度，所述官能團(tuán)具體為羧基，所述羧基的含量為ι χ IO-3 9 X 10-3mmol/mg,所述羧基的含量具體為IX 10_3 6X Krtimol/mg，所述羧基的含量尤其優(yōu)選為5 X lO—^mol/mg。在免疫檢測中，抗體的性能指標(biāo)對于檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，通常而言，特異性強(qiáng)、親和力高的抗體，可以顯著地提高檢測的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，為提高靈敏度，所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M4 ；所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M4 ； 所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA由于鹽酸克倫特羅是小分子物質(zhì)，其分子表面特性不利于與聚苯乙烯微孔板的直接結(jié)合，需要將其與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)后才能借助于載體蛋白的表面特性而達(dá)成與聚苯乙烯微孔板的良好結(jié)合?？捎米鬏d體蛋白的有各種動(dòng)物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白 (Bovine SerumAlbumin，BSA)、人血清白蛋白(Human SerumAlbumin，HSA)，還有鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白 (Ovalbumin,0VA)、纖維蛋白原或兔和雞的丙種球蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，BSA理化性質(zhì)穩(wěn)定，賴氨酸含量高，自由氨基多，在不同的PH和離子強(qiáng)度下均有較大的溶解度，在含有有機(jī)溶劑(如吡啶、DMF等)的情況下均可和半抗原進(jìn)行偶聯(lián)，且在偶聯(lián)后仍保持可溶狀態(tài)，是作為載體蛋白的極佳選擇，故本發(fā)明選用BSA作為偶聯(lián)蛋白。本發(fā)明通過對熒光量子點(diǎn)、鹽酸克倫特羅抗原和鹽酸克倫特羅抗體分子特性的研究，通過對各種水溶性熒光量子點(diǎn)制備、包覆及表面修飾條件的優(yōu)化，選擇適合的水溶性熒光量子點(diǎn)與特異性的抗體進(jìn)行定向共價(jià)化學(xué)偶聯(lián)，獲得功能性的熒光量子點(diǎn)標(biāo)記探針，并通過優(yōu)化競爭性免疫反應(yīng)的各種條件，達(dá)到對鹽酸克倫特羅殘留藥物的快速和高靈敏定量測定。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明試劑盒的靈敏度高、特異性好、準(zhǔn)確度高。本發(fā)明方法能實(shí)現(xiàn)對鹽酸克倫特羅殘留藥物的定量檢測，并且檢測限低、檢測靈敏度高、特異性好，還適用于多種樣品的檢測。因此，本發(fā)明在鹽酸克倫特羅的檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。CN 102262157 A
說明書
5/8頁


圖1水溶性Cdk/ZnS熒光量子點(diǎn)電鏡(TEM)照片。圖2用量子點(diǎn)標(biāo)記的間接競爭免疫熒光法檢測鹽酸克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、檢測試劑盒的組成及制備鹽酸克倫特羅購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，產(chǎn)品目錄號 302^CDCT-C11668550。其化學(xué)名稱為4-氨基-α -(叔丁胺甲基)-3，5- 二氯苯甲醇鹽酸
Τττ . ο1、鹽酸克倫特羅包被原CL-BSA抗原的合成采用重氮化法，具體步驟如下(1)取^ig鹽酸克倫特羅(CL)溶解于Iml 0. 2mol/l的HCl溶液中，充分溶解后加 A8mg NaNO2，于4°C下充分反應(yīng)池，此時(shí)溶液變?yōu)辄S色是克倫特羅的重氮苯鹽酸鹽；反應(yīng)的 PH值為1 ；(2)在 0. 02mol/l，pH 為 7. 4 的 PBS 中加入 40mg BSA 配制成 5mg/ml 的 BSA-PBS 溶液；(3)于Iml上述制備好的重氮苯鹽酸鹽溶液中加入BSA-PBS溶液8ml，用2mol/ INaOH調(diào)節(jié)至pH為8. 5，于4°C下進(jìn)行耦合反應(yīng)他，得到橘黃色溶液；(4)反應(yīng)液于0. 02mol/l,pH為7. 4的PBS中透析Mh，每6h更換一次透析液。所得產(chǎn)品用凍干機(jī)凍干后于-20°C保存，得到鹽酸克倫特羅抗原。2、鹽酸克倫特羅包被原的包被采用包被緩沖液將鹽酸克倫特羅包被原稀釋為濃度10 μ g/ml的包被液，在96孔聚苯乙烯微孔板條中每孔各加100 μ 1，于4°C冰箱放置過夜。第二天棄去包被用洗滌液沖洗各板孔3次后，各孔加入200 μ 1封閉液，于37°C封閉處理池。之后棄去封閉液、用洗滌液沖洗各板孔3次后，進(jìn)行真空抽干、用鋁箔袋密封后放置于-20°C保存。3、量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體鹽酸克倫特羅抗體為效價(jià)為106、親和常數(shù)為IO8M4的鹽酸克倫特羅單克隆抗體， 其購自北京圣迪隆生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為CL-083。量子點(diǎn)購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為TLS LumiQD 20。該量子點(diǎn)的表征如下粒徑為20nm、粒徑的CV為15%，量子產(chǎn)率為60%，表面羧基含量為 5X 10-3mmol/mg，水溶性，CdSe/SiS核殼結(jié)構(gòu)，激發(fā)光波長為345nm，發(fā)射波長是620nm ；紅色熒光量子點(diǎn)。量子點(diǎn)的掃描圖如圖2所示。所述量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體中，所述量子點(diǎn)上的羧基與所述鹽酸克倫特羅抗體上的氨基形成肽鍵，進(jìn)而使所述量子點(diǎn)與所述鹽酸克倫特羅抗體連接。量子點(diǎn)標(biāo)記方法是1)取2. 5mg的上述量子點(diǎn)用0. IM的MES緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl 溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)洗滌并用20000rpm離心富集去上清后，用Iml濃度為0. 1M、
7PH值為4. 7的MES緩沖液重懸，加入0. 96mg (終濃度為5mM)的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和1. 15mg (終濃度為IOmM) N-羥基丁二酰亞胺(NHS)于其中。反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)半小時(shí)后，得到活化后的量子點(diǎn)；2)用50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液洗滌，取0. 15mg鹽酸克倫特羅單克隆抗體和 2. 5mg活化后量子點(diǎn)混合到0. 8ml 50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液(稱取1. 9gNa2B407. IOH2O 溶于IOOml純水，調(diào)pH至8. 5)中充分混勻。室溫(25°C )下反應(yīng)3. 5小時(shí)，讓抗體和量子點(diǎn)形成穩(wěn)定的肽鍵共價(jià)結(jié)合，得到含有偶聯(lián)后量子點(diǎn)的反應(yīng)液；3)反應(yīng)結(jié)束后，向步驟2)得到的反應(yīng)液中加入終濃度為5% (質(zhì)量百分含量)的 BSA(Sigma-Aldrich,85041C)對剩余活性氨基位點(diǎn)進(jìn)行封閉，反應(yīng)在37°C下進(jìn)行0. 5小時(shí)， 得到含有封閉后量子點(diǎn)的反應(yīng)液；完成后，用pH = 7. 4的0. 02M PBS緩沖液(稱取2. 3g Na2HP04、0. 524g NaH2PO4. H20,8. 77g NaCL 溶于 IL 純水，調(diào) pH 至 7. 4)洗滌，20000rpm 離心富集去上清，重懸后4°C保存待用，得到量子點(diǎn)標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體。4、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液將鹽酸克倫特羅稀釋成如下各個(gè)濃度的溶液 0. 001、0. 005、0. 0U0. 05、0· 1、0. 5、l、5、10ug/L ；5、稀釋液0. 02M、ρΗ7· 4 的 PBS 緩沖液；配制稱取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H2O 和 8. 77g NaCL 溶于 IL 純水，調(diào) pH 至 7. 4。6、洗滌液PBST緩沖液；取0. 2ml Tween20及0. Ig的NaN3溶于上述PBS緩沖液中，溶解后用上述PBS緩沖液定容至1L。7、包被緩沖液0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液。8、封閉液將IOg BSA和OJml Tween20溶于上述PBS緩沖液中，溶解后用PBS緩沖液定容至1L。實(shí)施例2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法在制備好的鹽酸克倫特羅微孔板條中加入濃度為0、0. 001,0. 005,0. 01,0. 05、 0. 1,0. 5、l、5、10ug/L的鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液，50ul/孔，將量子點(diǎn)標(biāo)記ENR抗體用PBS-T 稀釋液1 50稀釋[即25ug標(biāo)記抗體5ml稀釋液]，每個(gè)微孔中加入50ul，室溫振蕩1 小時(shí)，洗滌液洗3次后用熒光酶標(biāo)儀檢測其熒光強(qiáng)度數(shù)值。熒光酶標(biāo)儀設(shè)置為激發(fā)波長 345nm,發(fā)射波長620nm。將競爭檢測的檢測限定為Β0/Β = 1. 2時(shí)(B0為0標(biāo)準(zhǔn)樣檢測值，B為待測樣檢測值)的競爭藥物的質(zhì)量濃度，根據(jù)曲線回歸方程確定檢測體系的靈敏度。檢測結(jié)果如下表 1所示，將檢出限定為0. 001ug/L。表1鹽酸克倫特羅不同濃度樣品的量子點(diǎn)試劑盒檢測值
權(quán)利要求
1.一種用于檢測鹽酸克倫特羅的免疫熒光檢測試劑盒，包括鹽酸克倫特羅包被原和量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述鹽酸克倫特羅抗體為抗體效價(jià)為IO6以上、抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1的鹽酸克倫特羅單克隆抗體；所述量子點(diǎn)為表面羧基含量為1 X 10_3 9X 10_3mmol/mg的水溶性Cdk/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)；所述量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率為40 70%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述量子點(diǎn)的粒徑為10 20nm，其粒徑的偏差在10 30%之間；所述鹽酸克倫特羅包被原為鹽酸克倫特羅與載體蛋白的偶聯(lián)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、洗滌液、含有孔的聚苯乙烯板、包被緩沖液和封閉液；所述鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品為4-氨基- α -(叔丁胺甲基)_3，5- 二氯苯甲醇鹽酸鹽；所述稀釋液為PBS緩沖液；所述洗滌液為PBST緩沖液；所述包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液；所述封閉液為含有用于包被的蛋白的PBS緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品為如下溶液形式的標(biāo)準(zhǔn)品用所述稀釋液將所述4-氨基- α -(叔丁胺甲基)-3，5- 二氯苯甲醇鹽酸鹽稀釋成如下各個(gè)濃度的溶液0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10ug/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述鹽酸克倫特羅包被原包被在所述含有孔的聚苯乙烯板上，包被方法為用所述包被緩沖液稀釋所述鹽酸克倫特羅包被原得到10 μ g/ml的包被液，每孔中加100 μ 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的試劑盒，其特征在于所述量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體以如下溶液形式存在于試劑盒中將每25ug所述量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體用5ml所述稀釋液稀釋得到的溶液。
8.—種檢測樣品中鹽酸克倫特羅的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1-7中任一所述的試劑盒對待測樣品進(jìn)行檢測，所述待測樣品為動(dòng)物肌肉組織樣本、動(dòng)物尿樣或飼料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于量子點(diǎn)的免疫熒光檢測鹽酸克倫特羅的方法及專用試劑盒。本發(fā)明提供的用于檢測鹽酸克倫特羅的免疫熒光檢測試劑盒，包括鹽酸克倫特羅包被原和量子點(diǎn)標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體。本發(fā)明方法能實(shí)現(xiàn)對鹽酸克倫特羅殘留藥物的定量檢測，并且檢測限低、檢測靈敏度高、特異性好，還適用于多種樣品的檢測。因此，本發(fā)明在鹽酸克倫特羅的檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/533GK102262157SQ20111018921
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者吳峰, 袁航, 馬嵐 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院