基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物細(xì)菌標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于量子點(diǎn)間接熒光免疫細(xì)菌標(biāo)記方法。
【背景技術(shù)】
[0002]由于工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境污染越來(lái)也嚴(yán)重，空氣中充滿各種病原體，細(xì)菌，這些病原體細(xì)菌一旦被人呼吸或者其他方式感染很容易引發(fā)多種疾病，例如，在人體的呼吸道中經(jīng)常會(huì)感染諸如病毒，細(xì)菌，支原體，衣原體，軍團(tuán)菌等微生物病菌，而引發(fā)支氣管炎，慢性支氣管炎，肺炎，支氣管擴(kuò)張等疾病。但是目前為了標(biāo)記具體病菌的類別主要采用免疫蛋白標(biāo)記方法，進(jìn)行病菌的識(shí)別標(biāo)記，但是這種標(biāo)記識(shí)別方式穩(wěn)定性差，存在壽命短，標(biāo)記效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其解決了目前病菌檢測(cè)標(biāo)記中穩(wěn)定性差，標(biāo)記效率低的技術(shù)問題。
[0004]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所提出的技術(shù)方案為:
[0005]本發(fā)明的一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其包括如下步驟:
[0006]第一步，對(duì)病原體進(jìn)行包被，并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0007]第二步，設(shè)置質(zhì)控孔，將無(wú)吸附病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陰極質(zhì)控孔中，做陰極對(duì)照，將吸附有病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陽(yáng)極質(zhì)控孔中，做陽(yáng)極對(duì)照；
[0008]第三步，用化學(xué)交聯(lián)法將量子點(diǎn)與抗人IgM的特異性抗體連接，得到量子點(diǎn)修飾抗體；
[0009]第四步，利用計(jì)算機(jī)對(duì)掃描圖片進(jìn)行鏡檢和分析。
[0010]其中，所述的第一步中病原體增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)至病原體細(xì)胞長(zhǎng)至80%單層。
[0011]其中，所述的玻片上設(shè)有凹槽，所述凹槽底部設(shè)有縱橫分布的條紋。
[0012]其中，所述的病原體包被包括以下步驟:
[0013]第一步，用體積比5%的磷壁酸溶液處理玻片；
[0014]第二步，將病原體細(xì)胞懸浮液用超聲波震蕩10至20秒，然后將細(xì)胞懸浮液滴加在玻片孔中；
[0015]第三步，將細(xì)胞懸浮液用紫外線照射10至15分鐘，然后用冷丙酮固定10分鐘；
[0016]第四步，用體積比為50 %的甘油溶液浸潤(rùn)5分鐘；
[0017]第五步，吹干后冷凍保存待用。
[0018]其中，所述的量子點(diǎn)包括單一化合物的量子點(diǎn)和核殼型量子點(diǎn)。
[0019]其中，所述的化學(xué)交聯(lián)法為EDC/NHS交聯(lián)法。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光標(biāo)記方法，其靈敏度高、自動(dòng)化強(qiáng)、細(xì)胞固定穩(wěn)固等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法的流程圖；
[0022]圖2為本發(fā)明一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法的包被方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下參考附圖，對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步地詳盡闡述。
[0024]請(qǐng)參閱圖1和附圖2，本發(fā)明的一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其包括如下步驟:
[0025]第一步SI，對(duì)病原體進(jìn)行包被，并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；
[0026]第二步S2，設(shè)置質(zhì)控孔，將無(wú)吸附病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陰極質(zhì)控孔中，做陰極對(duì)照，將吸附有病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陽(yáng)極質(zhì)控孔中，做陽(yáng)極對(duì)照；
[0027]第三步S3，用化學(xué)交聯(lián)法將量子點(diǎn)與抗人IgM的特異性抗體連接，得到量子點(diǎn)修飾抗體；
[0028]第四步S4，利用計(jì)算機(jī)對(duì)掃描圖片進(jìn)行鏡檢和分析。
[0029]其中，所述的第一步中病原體增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)至病原體細(xì)胞長(zhǎng)至80%單層。
[0030]其中，所述的玻片上設(shè)有凹槽，所述凹槽底部設(shè)有縱橫分布的條紋。
[0031]其中，請(qǐng)參閱附圖2，所述的病原體包被包括以下步驟:
[0032]第一步Tl，用體積比5%的磷壁酸溶液處理玻片；
[0033]第二步T2，將病原體細(xì)胞懸浮液用超聲波震蕩10至20秒，然后將細(xì)胞懸浮液滴加在玻片孔中；
[0034]第三步T3，將細(xì)胞懸浮液用紫外線照射10至15分鐘，然后用冷丙酮固定10分鐘；
[0035]第四步T4，將體積比為50 %的甘油溶液浸潤(rùn)5分鐘；
[0036]第五步T5，吹干后冷凍保存待用。
[0037]更具體的，所述步驟一 S1:對(duì)病原體進(jìn)行包被，首先進(jìn)行病原體的增殖培養(yǎng)。例:人流感病毒選用MDCK細(xì)胞，呼吸道合胞病毒選用HEP-2細(xì)胞等，對(duì)人流感病毒、呼吸道合胞病毒等病原體進(jìn)行增殖。首先進(jìn)行細(xì)胞株培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%單層，吸附病毒液，增殖病毒。待細(xì)胞出現(xiàn)病變，將病變細(xì)胞固定到玻片上。
[0038]以人流感病毒為例:從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37°C溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。
[0039]從37°C水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；離心棄去上清液，加入含培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37°C培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
[0040]75% -90%成片細(xì)胞準(zhǔn)備，用40X物鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，用Hank’s液清洗細(xì)胞3遍。將hank’s液吸出，并加入適量病毒液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，溫和搖動(dòng)數(shù)次。放于37°C，5%C02培養(yǎng)箱吸附l_2h。
[0041]將病毒液吸出，用hank’s液清洗細(xì)胞2遍，然后加入病毒生長(zhǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，每瓶用0.0lM PH7.4PBS吹打制備細(xì)胞懸液，滴加到玻片孔內(nèi)。紫外照射lOmin，冷丙酮固定lOmin，吹干后冷凍保存。
[0042]步驟二 S2:設(shè)置質(zhì)控孔，將無(wú)吸附病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陰性質(zhì)控孔中，作陰性對(duì)照。將吸附甲型流感病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陽(yáng)性質(zhì)控孔中，做陽(yáng)性對(duì)照。
[0043]步驟三S3:用化學(xué)交聯(lián)法將量子點(diǎn)與抗人IgM的特異性抗體連接，得到量子點(diǎn)修飾的抗體。所述量子點(diǎn)包括①單一化合物的量子點(diǎn)，包括:第III族和第V族化合物合成的量子點(diǎn)，包括GaSb，InAs, InP, InGaAs, InAlAs任意一種；第II族和第VI族組成的化合物，包括 MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe，CdTe任意一種；第1乂族和第IV族組成的化合物中的一種，包括SiC，SiGe中的任意一種；第IV族和第VI族組成的化合物中的一種核殼型量子點(diǎn)，包括ZnS包覆CdSe，ZnS包覆CdTe中的任意一種。
[0044]步驟四S4:利用計(jì)算機(jī)對(duì)掃描圖片進(jìn)行鏡檢和分析:首先掃描抗原片上行，對(duì)時(shí)間進(jìn)行記錄，逐個(gè)玻片孔進(jìn)行掃描檢測(cè)，每一孔用不同顏色標(biāo)示。將上行圖片掃描完畢，再次進(jìn)行下行掃描，記錄結(jié)果。電腦通過時(shí)間順序?qū)⑸舷滦械膾呙桧樞蚍珠_，以及顏色的區(qū)別來(lái)進(jìn)行自動(dòng)判讀。
[0045]首先:選取不同的增殖材料對(duì)病原體進(jìn)行增殖，并選用不同顏色選用(波長(zhǎng)460、500、580、610、650nm)五種波長(zhǎng)的量子點(diǎn)對(duì)二抗進(jìn)行標(biāo)記。
[0046]抗原片的制備:利用細(xì)胞或者培養(yǎng)基對(duì)病原體進(jìn)行增殖，例如流感病毒用MDCK細(xì)胞、呼吸道合胞病毒用HEP-2細(xì)胞。
[0047]設(shè)置質(zhì)控孔，將無(wú)吸附病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陰性質(zhì)控孔中，作陰性對(duì)照。將吸附甲型流感病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陽(yáng)性質(zhì)控孔中，做陽(yáng)性對(duì)照。
[0048]量子點(diǎn)與抗抗體的連接:選用(波長(zhǎng)460、500、580、610、650nm)五種波長(zhǎng)的量子點(diǎn)對(duì)二抗進(jìn)行標(biāo)記。
[0049]取8 μ mo I/ml 的 CdTe/ZnS 核殼型量子點(diǎn) 460、500、580、610 和 650 分別置于 10 μ I于EP管中，加入2ml濃度為lOmmol/L，pH = 7.2磷酸鹽緩沖液，混勻后用100K超濾管在5000r/min, 25°C條件下離心6min，回收量子點(diǎn)于EP管中。重復(fù)以上步驟三次，使最后一次量子點(diǎn)總體積不超過50 μ I。用微量pH計(jì)檢測(cè)最終pH并調(diào)節(jié)pH值至7.3。
[0050]取2mmol EDC和0.5mmol NHS迅速加入量子點(diǎn)溶液中，渦旋振蕩器震蕩均勻后置搖床上反應(yīng)60min，反應(yīng)溫度為24°C。反應(yīng)結(jié)束后加入2ml濃度為50mmol/L，pH = 8.5硼酸鹽緩沖液，混勻后用100K超濾管在5000r/min，25°C條件下離心6min，回收量子點(diǎn)于EP管中。重復(fù)以上步驟三次，使最后一次量子點(diǎn)總體積不超過200 μ I。用微量pH計(jì)檢測(cè)最終PH并調(diào)節(jié)pH值至8.5。取0.8 μ mo I的CRP抗體和PCT抗體分別置于不同EP管中，加入2ml濃度為50mmol/L，pH = 8.5硼