專利名稱：由間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由CI-TRFIA檢測(cè)體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留的方法。
背景技術(shù)：
菌核凈(N-3，5_ 二氯苯基丁二酰胺)是一種高效、低毒的亞胺類殺菌劑。它具有廣譜、殺菌、內(nèi)吸、滲透、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，廣泛用于煙草赤星病和水稻紋枯病的防治?？紤]到菌核凈殘留對(duì)人類健康和環(huán)境存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，建立煙草中菌核凈殘留的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。然而，我國煙草中菌核凈的殘留限量尚未制定，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)也僅有煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定的氣相色譜法[煙草及煙草制品菌核凈農(nóng)藥殘留量的測(cè)定氣相色譜法.中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)· YC/T218-2007]。Liu 等[Liu H C，Li Q ff, Tang L B. Capillary gas chromatographic determination of dimethachlon residues in fresh tobacco leaves and cut-tobacco. Zhejiang Univ. Sci. B，2007，8 (4) :272 276]報(bào)道了菌核凈在鮮煙葉和煙絲中的氣相色譜法檢測(cè)方法，檢測(cè)線性范圍為0. 01 0. lmg/kg。劉蓉蓉等釆用菌核凈-2-戊二酸半酯為半抗原，制備了菌核凈多克隆抗體，并釆用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA) 檢測(cè)煙草中菌核凈殘留[劉蓉蓉，劉賢金，劉媛，方敦煌，胡秋輝.菌核凈殘留免疫分析半抗原的制備和鑒定.食品科學(xué)，2007，2 :223-226][劉蓉蓉.菌核凈的免疫檢測(cè)技術(shù)研究，南京南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007]，抗體的抑制終濃度I5tl為2830 μ g/L，檢測(cè)靈敏度偏低。時(shí)間分辨熒光免疫分析是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的非放射型免疫分析方法，它采用稀土族元素作為標(biāo)記物，克服了 ELISA的穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，也避免了放射性免疫分析 (RIA)的同位素污染等問題，具有靈敏度高、抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。建立菌核凈農(nóng)藥高靈敏度檢測(cè)的CI-TRFIA分析體系，并通過CI-TRFIA分析體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留，目前未報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前菌核凈檢測(cè)方法研究較少，且已報(bào)道的氣相色譜檢測(cè)方法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法靈敏度偏低的問題，本發(fā)明提供了一種菌核凈殘留的時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，并將其應(yīng)用于煙草中菌核凈殘留檢測(cè)，開發(fā)了簡(jiǎn)便快速、無需樣本凈化的前處理方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種由CI-TRFIA檢測(cè)體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留的方法，其特征在于所述的CI-TRFIA檢測(cè)體系中，以菌核凈-OVA作為包被抗原，以菌核凈多克隆抗體作為識(shí)別抗體，以Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，建立與菌核凈農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，方法是將菌核凈-卵清蛋白OVA連接物作為包被抗原固定于酶標(biāo)板，再加入梯度稀釋的菌核凈標(biāo)準(zhǔn)品和菌核凈多克隆抗體，讓菌核凈標(biāo)準(zhǔn)品與包被抗原共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，再采用Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，通過時(shí)間分辨檢測(cè)模式讀數(shù)后，繪制菌核凈時(shí)間分辨免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，建立線性回歸方程，計(jì)算抑制中濃度，確定最低檢測(cè)限和線性檢測(cè)范圍；所述的檢測(cè)煙草中菌核凈殘留是指對(duì)煙草樣品前處理后，通過CI-TRFIA檢測(cè)體系對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，判斷與樣品對(duì)應(yīng)的煙草中菌核凈殘留量。在本發(fā)明中所述的Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG是這樣獲得的稱取4mgEu_Nl，用 350 μ L蒸餾水溶解，備用^flmg親和純化后的羊抗兔IgG溶于150 μ L蒸餾水，加入pH 9.8 的15 μ L O. 5mol/L碳酸鹽緩沖液，混合均勻后，將溶解的Eu-Nl與羊抗兔IgG混合，4°C靜置過夜，次日將過夜的反應(yīng)物裝入截留分子量為8000Da的透析袋中，對(duì)超純水透析3天，截留物為Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG，于_20°C保存?zhèn)溆?。在本發(fā)明中對(duì)煙草樣品前處理是指將煙草樣品粉碎后，稱取Ig放入IOOmL三角瓶中，加20mL丙酮混合均勻，180rpm振蕩提取I小時(shí)，抽濾后濃縮近干，再用IOml丙酮復(fù)溶殘余物并定容，取100 μ L丙酮復(fù)溶物，用檢測(cè)緩沖液稀釋10倍后，直接用于CI-TRFIA檢測(cè)。本發(fā)明采用了菌核凈-OVA作為包被抗原、菌核凈多克隆抗體作為識(shí)別抗體和鑭系元素螯合物Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，建立了高靈敏度的菌核凈時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，并將其應(yīng)用于煙草中菌核凈殘留檢測(cè)，開發(fā)了簡(jiǎn)便快速、無需樣本凈化的前處理方法，為國內(nèi)外首次報(bào)道。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明采用了菌核凈-OVA作為包被抗原、菌核凈多克隆抗體作為識(shí)別抗體和Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，建立了高靈敏度的菌核凈時(shí)間分辨熒光免疫分析方法，并將其應(yīng)用于煙草中菌核凈殘留檢測(cè)，開發(fā)了簡(jiǎn)便快速、無需樣本凈化的 CI-TRFIA分析體系，它與傳統(tǒng)的ELISA法相比，具有檢測(cè)信號(hào)高，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的抑制中濃度(I5tl)為32. 00 μ g/L，最低檢出限Iltl為I. 981^/1，檢測(cè)線性范圍為3. 97 128. 76 μ g/L，檢測(cè)靈敏度明顯優(yōu)于現(xiàn)有報(bào)道的氣相色譜檢測(cè)方法和ELISA檢測(cè)方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還在于在煙草樣品的前處理過程中，無需樣品凈化，用丙酮提取， 再經(jīng)過檢測(cè)緩沖液稀釋后，直接用于時(shí)間分辨熒光免疫分析方法檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)間為165min， 檢測(cè)通量可達(dá)20 30樣/板(以96孔，I個(gè)樣做3個(gè)重復(fù)計(jì)算)，樣品中菌核凈的最低實(shí)際檢出濃度為lmg/L，在大量煙葉樣品中菌核凈殘留的快速篩查檢測(cè)，具有較高的應(yīng)用前
旦
-5^ O


圖Ia菌核凈CI-TRFIA分析的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。圖Ib菌核凈CI-TRFIA分析的線性回歸方程。圖2是不同濃度煙葉基質(zhì)對(duì)菌核凈CI-TRFIA分析體系的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例I. Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG制備
稱取4mg Eu-Nl (芬蘭Wallac公司提供)，用350 μ L蒸餾水溶解，備用。將Img親和純化后的羊抗兔IgG(武漢博士德公司提供)溶于150 μ L蒸餾水，加入15 μ L O. 5mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH 9. 8)，混合均勻后，將溶解的Eu-Nl與羊抗兔IgG混合，4°C靜置過夜。次日反應(yīng)物裝入透析袋中(截留分子量8000)，透析3天，截留物分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2. CI-TRFIA(Competitive indirect time-resolved fluorescence immunoassay)的建立用洗滌緩沖液預(yù)洗酶標(biāo)板I次，加入100 μ L終濃度為6. 9mg/L,檢測(cè)緩沖液(無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司)稀釋的菌核凈-OVA (實(shí)驗(yàn)室自制)，室溫下以700r/min振蕩孵育30min后，洗滌緩沖液(無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司)洗板4次；在孔板中加入50 μ L稀釋2000倍的菌核凈多克隆抗體(實(shí)驗(yàn)室自制)及50 μ L不同濃度的菌核凈標(biāo)準(zhǔn)液，室溫下以700r/min振蕩孵育Ih后，洗板4次；再加入100 μ L稀釋1000倍的Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔 IgG，室溫下以700r/min振蕩孵育Ih后，洗板4次；每孔加入熒光增強(qiáng)液(無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司UOOyLJOOr/min振蕩15min，用多功能微孔板分析儀(德國Bethold LB940 多功能微孔板分析儀)的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)模式讀數(shù)。如圖I所示，采用了 CI-TRFIA法建立了菌核凈農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。線性回歸方程為I = 33. 081ogC+0. 20 (R2 = O. 97)，其中，I為抑制率，C為樣本濃度(μ g/L)。計(jì)算得到方法的檢出限Iltl為I. 98 μ g/L,抑制終濃度I5tl為32. 00 μ g/L,檢測(cè)線性范圍(I2tl I7tl) 在 3. 97 128. 76 μ g/L ο實(shí)施例3.煙葉基質(zhì)對(duì)時(shí)間分辨熒光檢測(cè)體系的影響研究考慮到免疫學(xué)檢測(cè)方法主要用于大量樣本的快速篩查，所采用的樣品前處理方法通常不采用復(fù)雜的樣本凈化步驟，而是對(duì)樣本進(jìn)行簡(jiǎn)單提取后，再進(jìn)行稀釋，減小或去除樣本基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。但是樣本稀釋又會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)方法的實(shí)際靈敏度的降低。本實(shí)驗(yàn)通過研究煙葉在經(jīng)丙酮提取后，不同濃度的基質(zhì)對(duì)CI-TRFIA分析體系(線性范圍內(nèi))的影響， 確定了煙葉樣品前處理后對(duì)檢測(cè)方法所需的稀釋倍數(shù)。具體步驟如下稱取3組Ig煙葉(每組8份)，放入IOOmL三角瓶中，分別添加ImL稀釋2倍的菌核凈標(biāo)樣(丙酮溶解)，充分混勻，避光靜置2h ;加20mL丙酮，ISOrpm振蕩提取lh，抽濾后旋轉(zhuǎn)濃縮近干；3組殘余物分別用0. 3、I. O和IOmL丙酮溶解，再用檢測(cè)緩沖液稀釋10倍， 直接用于CI-TRFIA檢測(cè)。由于煙葉的成分復(fù)雜，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)以“抗原-抗體”結(jié)合為基礎(chǔ)的CI-TRFIA檢測(cè)反映體系干擾較大。由圖2所示，33%煙葉基質(zhì)對(duì)檢測(cè)體系干擾嚴(yán)重，抗體幾乎完全失去識(shí)別能力；10%煙葉基質(zhì)存在時(shí)，菌核凈的抑制曲線與標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線相比斜率明顯降低，曲線的平行性較差；1%煙葉基質(zhì)存在時(shí)，曲線的平行性較好，可以通過基質(zhì)影響因子(Im)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行矯正，因此確定煙葉樣品前處理的稀釋倍數(shù)為100倍。計(jì)算得到的I %煙葉基質(zhì)的基質(zhì)影響因子為17. I。菌核凈基質(zhì)影響因子計(jì)算公式Im = [ (B0-Bm0) /B0] X 100式中=Btl-TRFIA檢測(cè)方法中，O %煙葉基質(zhì)中(標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線)，零濃度的菌核凈對(duì)應(yīng)的熒光值。BmO-TRFIA檢測(cè)方法中，I %煙葉基質(zhì)中，零濃度的菌核凈對(duì)應(yīng)的熒光值。實(shí)施例4.煙草中菌核凈CI-TRFIA的添加回收實(shí)驗(yàn)
為考察本發(fā)明所建立的煙草中菌核凈CI-TRFIA分析方法的精密度和重現(xiàn)性，進(jìn)行了煙草的添加回收實(shí)驗(yàn)。具體步驟如下在CI-TRFIA檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，連續(xù)3天對(duì)空白煙葉樣本進(jìn)行1、7和24mg/L的 3個(gè)水平的添加(由于樣品在前處理中稀釋了 100倍，且在CI-TRFIA加樣時(shí)與等體積的抗體混合，因此菌核凈在CI-TRFIA檢測(cè)體系中的終濃度分別為5、35和120 μ g/L)。Ig煙葉樣品經(jīng)過20ml丙酮提取后，濃縮近干再用IOml丙酮復(fù)溶殘余物并定溶。取IOOul丙酮定容物，用檢測(cè)緩沖液稀釋10倍后用于檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過基質(zhì)影響因子進(jìn)行矯正。樣品中菌核凈濃度的實(shí)際濃度的折算公式CX = Cd[ (IOO-Im)/100]式中Cx-樣品中菌核凈的實(shí)際濃度，Cd-樣品中菌核凈的計(jì)算濃度。如表I所示，連續(xù)3天的樣品的總添加回收率為73% 128%，變異系數(shù)(CV)在 4. 3 13. 2之間。添加回收實(shí)驗(yàn)表明，該方法可以用于煙草中菌核凈農(nóng)藥的快速篩選檢測(cè)。表I煙葉中菌核凈農(nóng)藥的CI-TRFIA檢測(cè)方法的添加回收率和變異系數(shù)

權(quán)利要求
1.一種由間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留的方法，其特征在于所述的檢測(cè)體系中，以菌核凈-OVA作為包被抗原，以菌核凈多克隆抗體作為識(shí)別抗體，以Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，建立與菌核凈農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，方法是: 將菌核凈-卵清蛋白OVA連接物作為包被抗原固定于酶標(biāo)板，再加入梯度稀釋的菌核凈標(biāo)準(zhǔn)品和菌核凈多克隆抗體，讓菌核凈標(biāo)準(zhǔn)品與包被抗原共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，再采用Eu-Nl 標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，通過時(shí)間分辨檢測(cè)模式讀數(shù)后，繪制菌核凈時(shí)間分辨免疫分析的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，建立線性回歸方程，計(jì)算抑制中濃度，確定最低檢測(cè)限和線性檢測(cè)范圍；所述的檢測(cè)煙草中菌核凈殘留是指對(duì)煙草樣品前處理后，通過檢測(cè)體系對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，判斷與樣品對(duì)應(yīng)的煙草中菌核凈殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留的方法，其特征在于所述的Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG是這樣獲得的稱取4 mg Eu-Nl, 用350 μ L蒸餾水溶解，備用；將I mg親和純化后的羊抗兔IgG溶于150 μ L蒸餾水，加入 pH 9. 8的15 μ L O. 5 mo I/L碳酸鹽緩沖液，混合均勻后，將溶解的Eu-Nl與羊抗兔IgG混合，4°C靜置過夜，次日將過夜的反應(yīng)物裝入截留分子量為8000Da的透析袋中，對(duì)超純水透析3天，截留物為Eu-Nl標(biāo)記的羊抗兔IgG，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求廣2之一所述的由間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留的方法，其特征在于對(duì)煙草樣品前處理是指將煙草樣品粉碎后，稱取Ig放入 IOOmL三角瓶中，加20mL丙酮混合均勻，180rpm振蕩提取I小時(shí)，抽濾后濃縮近干，再用 IOml丙酮復(fù)溶殘余物并定容，取100 μ L丙酮復(fù)溶物，用檢測(cè)緩沖液稀釋10倍后，直接用于 CI-TRFIA 檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由間接競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間分辨熒光免疫分析體系檢測(cè)煙草中菌核凈殘留的方法，其中所述的CI-TRFIA檢測(cè)體系是以菌核凈-OVA作為包被抗原，以菌核凈多克隆抗體作為識(shí)別抗體，以Eu-N1標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，建立與菌核凈農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線；所述的檢測(cè)煙草中菌核凈殘留是指對(duì)煙草樣品前處理后，通過CI-TRFIA檢測(cè)體系對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，判斷與樣品對(duì)應(yīng)的煙草中菌核凈殘留量。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102590499SQ20121001164
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者劉媛, 劉賢金, 張霄, 王冬蘭 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院