一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，屬于生物檢疫的【技術領域】。該方法用MDBK細胞系繁殖BVDV，再用間接免疫熒光方法檢測病毒，具體包括S1.MDBK細胞的培養(yǎng)；S2.BVDV的接種；S3.間接免疫熒光檢測牛病毒性腹瀉病毒：洗滌、丙酮固定、一抗孵育、二抗孵育和結果判定。本發(fā)明方法能夠快速、準確檢測出BVDV粒子的活性，穩(wěn)定檢測出豬瘟活疫苗中污染的BVDV，應用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的檢測，為制備純凈的豬瘟弱毒活疫苗提供更有效的檢測方法。
【專利說明】一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢疫的【技術領域】，具體涉及一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法。

【背景技術】
[0002]牛病毒性腹?寫病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV),又稱牛病毒性腹?寫-粘膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus, BVD-MDV),屬于黃病毒科(Flavivixidae)、痕病毒屬(Pestivirus)的成員。該病毒與豬痕病毒(Classical swinefever virus, CSFV)為同一個屬。牛血清、冷凍胚胎、牛精液等牛源產品都可能污染BVDV,造成BVDV的傳播。在獸用疫苗生產中，常使用牛血清、牛睪丸細胞、胰酶等牛源材料作為原材料。因此，一旦這些原材料中若有BVDV病原，會導致疫苗污染，尤其是豬用疫苗污染后，會導致免疫豬感染BVDV，造成自身類似豬瘟的臨床癥狀給豬瘟的診斷帶來困難外，還會成為BVDV的污染源。
[0003]目前，為了預防BVDV的傳播和流行，國內研究人員建立的檢測方法主要有病毒分離、電鏡觀察、瓊脂擴散法、微量血清中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、RT-PCR技術等。常規(guī)的檢測方法費時費力，靈敏度低等缺點。常規(guī)的檢測方法存在費時費力，靈敏度低等缺點。隨著生物技術水平的發(fā)展，熒光定量RT-PCR方法的出現(xiàn)，為BVDV的檢測提供了一種有力的工具。而熒光定量RT-PCR與普通RT-PCR相比具有靈敏性更強、特異性更好、污染幾率小、自動化高、高通量等優(yōu)勢，因而成為一種越來越重要的檢測技術。雖然BVDV的熒光定量RT-PCR方法具備上述優(yōu)點，但是只能檢測到BVDV的核酸，不能判斷BVDV粒子是否具有感染性。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點，提供一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，該方法能夠快速、準確檢測出BVDV粒子的活性，穩(wěn)定檢測出豬瘟活疫苗中污染的BVDV，應用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的檢測，為制備純凈的豬瘟弱毒活疫苗提供更有效的檢測方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn):一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，它包括以下步驟:
51.MDBK細胞的培養(yǎng)
將長滿單層的MDBK細胞，用胰酶消化后，加入生長液制成細胞懸液以2?4X 15個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)，24h后細胞貼壁鋪滿孔底；其中，所述生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基；
52.BVDV的接種
用步驟SI培養(yǎng)的MDBK細胞接種BVDV，添加含2%的馬血清至每孔200 μ 1，培養(yǎng)72h，同時設不接種BVDV的MDBK細胞作為陰性對照；
53.間接免疫熒光檢測牛病毒性腹瀉病毒 531.洗滌:將滅菌預冷的PBS洗去96孔板細胞殘留的生長液，洗滌2?3次，每次4 ?6min ；
532.丙酮固定:用丙酮固定30?60min，PBS沖洗洗漆2?3次，每次4?6min；
533.一抗孵育:用PBS稀釋羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，濕盒37°C孵育45?90min，PBS沖洗洗滌2?3次，每次4?6min ；
534.二抗孵育:再用PBS稀釋兔抗羊IgG FITC 二抗，濕盒37°C孵育45?90min，PBS沖洗洗漆2?3次，每次4?6min ；
535.結果判定:將96孔板放在倒置顯微鏡上觀察，判定結果。
[0006]進一步地，步驟SI中所述長滿單層MDBK細胞的培養(yǎng)方法為:MDBK細胞在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基，在37°C 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2?3天傳代一次，長滿單層MDBK細胞。
[0007]進一步地，步驟S32中所述丙酮溫度為O?10°C，濃度為50%?80%。
[0008]進一步地，步驟S33中所述羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀釋倍數(shù)為50?400倍。
[0009]進一步地，步驟S34中所述兔抗羊IgG FITC 二抗的稀釋倍數(shù)為為50?800倍。
[0010]本發(fā)明中結果判定:觀察到陽性細胞的細胞核或細胞質內有特異性亮綠色熒光，而陰性對照、空白對照無特異性綠色熒光，如圖1所示。由熒光強弱，其結果判定有如下的幾種情況:沒有出現(xiàn)或見微弱熒光為“陰性”，弱熒光且少于5%為“弱陽性”，出現(xiàn)明亮綠色熒光且比例為5%?50% 為“中等陽性”，出現(xiàn)耀眼綠色熒光且分布比例大于50%為“強陽性”。
[0011]本發(fā)明的方法不能用于診斷，用于臨床檢測和科研領域，主要包括對豬瘟兔化弱毒活疫苗中BVDV污染的檢測。
[0012]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明的一種牛病毒性腹瀉病毒的檢測方法能夠快速、準確檢測出BVDV粒子的活性，穩(wěn)定檢測出豬瘟活疫苗中污染的BVDV，應用于疫苗中牛源原材料污染BVDV的檢測，為制備純凈的豬瘟弱毒活疫苗提供更有效的檢測方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為牛病毒性腹瀉病毒在MDBK細胞上的特異性熒光斑及陰性對照圖。

【具體實施方式】
[0014]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。
[0015]實施例1:一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，它包括以下步驟:
S1.MDBK細胞的培養(yǎng)
MDBK細胞在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基，在37°C 5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天傳代一次，長滿單層MDBK細胞。用胰酶消化后，加入生長液制成細胞懸液以2X 15個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)，24h后細胞貼壁鋪滿孔底；其中，所述生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基； 52.BVDV的接種
用步驟SI培養(yǎng)的MDBK細胞接種BVDV，添加含2%的馬血清至每孔200 μ 1，培養(yǎng)72h，同時設不接種BVDV的MDBK細胞作為陰性對照；
53.間接免疫熒光檢測牛病毒性腹瀉病毒
531.洗滌:將滅菌預冷的PBS洗去96孔板細胞殘留的生長液，洗滌2次，每次4min；
532.丙酮固定:用溫度為0°C，濃度為50%的丙酮固定30min，PBS沖洗洗滌2次，每次4min ；
533.一抗孵育:用PBS稀釋羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀釋倍數(shù)為50倍，濕盒37°C孵育45min，PBS沖洗洗滌2次，每次4min ；
534.二抗孵育:再用PBS稀釋兔抗羊IgG FITC 二抗，兔抗羊IgG FITC 二抗的稀釋倍數(shù)為50倍，濕盒37°C孵育45min，PBS沖洗洗滌2次，每次4min ；
535.結果判定:將96孔板放在倒置顯微鏡上觀察，判定結果。
[0016]實施例2:—種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，它包括以下步驟:
51.MDBK細胞的培養(yǎng)
MDBK細胞在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基，在37°C 5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天傳代一次，長滿單層MDBK細胞。用胰酶消化后，加入生長液制成細胞懸液以4X 15個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)，24h后細胞貼壁鋪滿孔底；其中，所述生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基；
52.BVDV的接種
用步驟SI培養(yǎng)的MDBK細胞接種BVDV，添加含2%的馬血清至每孔200 μ 1，培養(yǎng)72h，同時設不接種BVDV的MDBK細胞作為陰性對照；
53.間接免疫熒光檢測牛病毒性腹瀉病毒
531.洗滌:將滅菌預冷的PBS洗去96孔板細胞殘留的生長液，洗滌3次，每次6min；
532.丙酮固定:用溫度為10°C，濃度為80%的丙酮固定60min，PBS沖洗洗滌3次，每次6min ；
533.一抗孵育:用PBS稀釋羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀釋倍數(shù)為400倍，濕盒37°C孵育90min，PBS沖洗洗滌3次，每次6min ；
534.二抗孵育:再用PBS稀釋兔抗羊IgG FITC 二抗，兔抗羊IgG FITC 二抗的稀釋倍數(shù)為800倍，濕盒37°C孵育90min，PBS沖洗洗滌3次，每次6min ；
535.結果判定:將96孔板放在倒置顯微鏡上觀察，判定結果。
[0017]實施例3:—種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，它包括以下步驟:
51.MDBK細胞的培養(yǎng)
MDBK細胞在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基，在37°C 5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2.5天傳代一次，長滿單層MDBK細胞。用胰酶消化后，加入生長液制成細胞懸液以3X 15個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)，24h后細胞貼壁鋪滿孔底；其中，所述生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基；
52.BVDV的接種用步驟SI培養(yǎng)的MDBK細胞接種BVDV，添加含2%的馬血清至每孔200 μ 1，培養(yǎng)72h，同時設不接種BVDV的MDBK細胞作為陰性對照；
S3.間接免疫熒光檢測牛病毒性腹瀉病毒
531.洗滌:將滅菌預冷的PBS洗去96孔板細胞殘留的生長液，洗滌3次，每次5min；
532.丙酮固定:用溫度為5°C，濃度為65%的丙酮固定48min，PBS沖洗洗滌2次，每次6min ；
533.一抗孵育:用PBS稀釋羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀釋倍數(shù)為200倍，濕盒37°C孵育600min，PBS沖洗洗滌3次，每次5min ；
534.二抗孵育:再用PBS稀釋兔抗羊IgG FITC 二抗，兔抗羊IgG FITC 二抗的稀釋倍數(shù)為450倍，濕盒37°C孵育60min，PBS沖洗洗滌2次，每次5min ；
535.結果判定:將96孔板放在倒置顯微鏡上觀察，判定結果。
[0018]實施例4:
1.實驗方法
一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，它包括以下步驟:
S1.MDBK細胞系的培養(yǎng)
MDBK細胞復蘇后接種于生長液(含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基)中，在37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)，每2?3天傳代一次。將狀態(tài)良好的MDBK細胞用0.25%的胰酶消化后制備成細胞懸液，然后以2X 15個/ml的密度接種于96孔板，100 μ I/孔，置于37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)，24h后細胞貼壁鋪滿孔底。
[0019]S2.BVDV樣品的制備與接種
將自繁的BVDV種毒(病毒滴度:106_ 5TCID5tlAiL)用無血清的MEM液在無菌的EP管中進行10倍倍比稀釋，從KT1?10_7，充分混勻后，每個稀釋度均分成兩份，一份在70°C，30min滅活，另一份不滅活。同時，將同樣的BVDV種毒用豬瘟弱毒活疫苗成品作為稀釋液在EP管中進行10倍倍比稀釋，從KT1?10_7，樣品后續(xù)處理同上述方法。將每個稀釋度的樣品加入96孔單層MDBK細胞中，未滅活和滅活的樣每個稀釋度均為3個孔，100 μ I/孔，再加維持液(含2%的血清)至200 μ I/孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h，同時設不接種病毒的正常MDBK細胞作為陰性對照。
[0020]S3.間接免疫熒光檢測牛病毒性腹瀉病毒
531.洗滌:將滅菌預冷的PBS洗去96孔板細胞殘留的生長液，洗滌2?3次，每次4?6min ；
532.丙酮固定:用丙酮固定30?60min，PBS沖洗洗漆2?3次，每次4?6min；
533.一抗孵育:用PBS稀釋羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，濕盒37°C孵育45?90min，PBS沖洗洗滌2?3次，每次4?6min ；
534.二抗孵育:再用PBS稀釋兔抗羊IgG FITC 二抗，濕盒37°C孵育45?90min，PBS沖洗洗漆2?3次，每次4?6min ；
535.結果判定:將96孔板放在倒置顯微鏡上觀察，判定結果。
[0021]2.實驗結果
對上述樣品進行間接免疫熒光檢測，結果表明不論稀釋液中是否含有CSFV，滅活的BVDV均不能觀察到BVDV的特異性熒光，用MEM作為稀釋液和豬瘟苗成品毒液稀釋的BVDV均能檢測到3.3TCID50o因此，建立的牛病毒性腹瀉病毒檢測方法能夠檢測到具有感染性的BVDV0
【權利要求】
1.一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于，它包括以下步驟: 51.MDBK細胞的培養(yǎng) 將長滿單層的MDBK細胞，用胰酶消化后，加入生長液制成細胞懸液以2?4X 15個/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μ 1，置于37°C 5% CO2的條件下培養(yǎng)，24h后細胞貼壁鋪滿孔底；其中，所述生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基； 52.BVDV的接種 用步驟SI培養(yǎng)的MDBK細胞接種BVDV，添加含2%的馬血清至每孔200 μ 1，培養(yǎng)72h，同時設不接種BVDV的MDBK細胞作為陰性對照； 53.間接免疫熒光檢測牛病毒性腹瀉病毒 531.洗滌:將滅菌預冷的PBS洗去96孔板細胞殘留的生長液，洗滌2?3次，每次4 ?6min ； 532.丙酮固定:用丙酮固定30?60min，PBS沖洗洗漆2?3次，每次4?6min； 533.一抗孵育:用PBS稀釋羊抗牛BVDV多克隆血清一抗，濕盒37°C孵育45?90min，PBS沖洗洗滌2?3次，每次4?6min ； 534.二抗孵育:再用PBS稀釋兔抗羊IgG FITC 二抗，濕盒37°C孵育45?90min，PBS沖洗洗漆2?3次，每次4?6min ； 535.結果判定:將96孔板放在倒置顯微鏡上觀察，判定結果。
2.如權利要求1所述的一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于，步驟SI中所述長滿單層MDBK細胞的培養(yǎng)方法為:MDBK細胞在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，生長液為含有10%馬血清的MEM培養(yǎng)基，在37°C 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2?3天傳代一次，長滿單層MDBK細胞。
3.如權利要求1所述的一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于，步驟S32中所述丙酮溫度為O?10°C，濃度為50%?80%。
4.如權利要求1所述的一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于，步驟S33中所述羊抗牛BVDV多克隆血清一抗的稀釋倍數(shù)為50?400倍。
5.如權利要求1所述的一種利用間接免疫熒光法檢測牛病毒性腹瀉病毒的方法，其特征在于，步驟S34中所述兔抗羊IgG FITC 二抗的稀釋倍數(shù)為為50?800倍。
【文檔編號】G01N33/569GK104330561SQ201410651378
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權日:2014年11月17日
【發(fā)明者】徐宏軍, 黃杰, 岳豐雄, 張奕強, 柏菊, 王潔清, 胡來根, 王家福 申請人:成都天邦生物制品有限公司