專利名稱：利用間接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生化檢測方法，特別是涉及一種雄性哺乳動物生精細(xì)胞核蛋白的檢測方法。
背景技術(shù)：
目前不育癥的發(fā)病率已高達(dá)15% 20%，其中男方因素約占二分之一。男性不育作為男性生殖健康的主要問題，關(guān)系到國民整體素質(zhì)和未來人口健康發(fā)展，已經(jīng)成為迫切需要社會關(guān)注和亟待解決的焦點(diǎn)問題。進(jìn)行男性生殖健康基礎(chǔ)研究，揭示精子發(fā)生和成熟的分子機(jī)制可以為闡明男性不育的發(fā)病機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，有助于臨床男性不育癥診斷技術(shù)的發(fā)展。哺乳動物精子的發(fā)生是一個復(fù)雜而特異的細(xì)胞分化過程，分為有絲分裂期、減數(shù)分裂期和變態(tài)成形期三個階段。其中，減數(shù)分裂和精子細(xì)胞的變態(tài)成形是兩個獨(dú)特而關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其特殊的細(xì)胞分化方式是機(jī)體內(nèi)其它任何細(xì)胞所不具備的，其中必定蘊(yùn)藏著某些特異的機(jī)制在內(nèi)。倘若相關(guān)基因缺陷、突變或表達(dá)異常，都可能使精子生成障礙，導(dǎo)致男性不育。發(fā)現(xiàn)并分析這類基因的表達(dá)特征，可以為進(jìn)一步認(rèn)識哺乳類精子發(fā)生的分子機(jī)制提供有價值的研究線索。基因只是遺傳信息的攜帶者，蛋白質(zhì)才是細(xì)胞功能的最終執(zhí)行者。因此，后基因組時代的基因功能研究主要集中在蛋白質(zhì)水平，而明確蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞中的精確定位是研究蛋白質(zhì)功能的必要基礎(chǔ)。精子發(fā)生過程不同階段出現(xiàn)的生精細(xì)胞形態(tài)各異、功能不同，其細(xì)胞核的形態(tài)也會發(fā)生顯著改變，如魚精蛋白會逐漸取代組蛋白，與染色質(zhì)緊密結(jié)合，使染色質(zhì)高度濃縮，細(xì)胞核的體積才會顯著縮??；微管蛋白大量合成，引導(dǎo)細(xì)胞核從圓形變?yōu)殚L形，才能具備成熟精子的基本形態(tài)。這些變化都需要一系列新的蛋白分子不斷合成并發(fā)揮正常功能才能順利完成。為了深入研究生精細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)的種類與功能，首先需要明確蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。而存在于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)有細(xì)胞膜與核膜的雙重保護(hù)并與核染色質(zhì)有著密切的關(guān)系，在進(jìn)行蛋白質(zhì)定位研究時必須保證抗體分子能與目標(biāo)蛋白緊密結(jié)合，同時避免染色質(zhì)對目標(biāo)蛋白與抗體的干擾。目前，絕大多數(shù)研究者均采用免疫組織化學(xué)或間接免疫熒光染色的方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行定位研究。由于熒光染色結(jié)果色彩鮮明、陽性著色明顯可辨，同時可以借助數(shù)種不同熒光進(jìn)行多種蛋白質(zhì)的共定位，還可以利用激光共聚焦進(jìn)行圖像疊加和立體圖像分析，使得間接免疫熒光染色技術(shù)在研究蛋白質(zhì)定位工作中具有無法比擬的優(yōu)勢。但要想取得理想的熒光染色結(jié)果，也需注意運(yùn)用恰當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。首先，免疫熒光染色需要具備特異性?qiáng)的一抗和熒光標(biāo)記二抗，其次，樣品材料的準(zhǔn)備和處理也是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。如果研究的目標(biāo)蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，還要保證抗體能夠穿過細(xì)胞膜與核膜進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)的蛋白質(zhì)充分結(jié)合。為了提高細(xì)胞膜及細(xì)胞核膜對抗體的通透性，需要使用化學(xué)試劑對細(xì)胞進(jìn)行通透處理。目前，一般實(shí)驗(yàn)均用TitonX-1OO處理來增加生物膜的通透能 力。Triton X-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑，能與生物膜中的磷脂結(jié)合形成可溶性復(fù)合物，其疏水端也能與膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合形成復(fù)合物，因此能夠使磷脂雙分子層松散，對大分子抗體的通透性增強(qiáng)，在免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)中經(jīng)常作為細(xì)胞通透劑。但高濃度的TitonX-1OO對生物膜有較大的破壞性，并能使細(xì)胞及其內(nèi)部的細(xì)胞器溶解，有可能造成核內(nèi)蛋白質(zhì)的丟失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種以睪丸組織為材料，利用低滲液制備生精細(xì)胞，通過間接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白的方法。本發(fā)明利用間接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白的方法是從動物的睪丸組織中分離曲精小管，利用低滲液處理生精細(xì)胞，采用間接免疫熒光染色方法檢測生精細(xì)胞核蛋白。其中，所述的低滲液中包括有17mM檸檬酸鈉、50mM蔗糖、5mM EDTA、0.5mM DTT,
0.5mM PMSF, 30mM Tris，低滲液的 pH 值為 8.2。本發(fā)明利用間 接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白的方法具體包括以下步驟:
1)取置于預(yù)冷的PBS溶液中的動物睪丸組織，剝?nèi)ゲG丸組織的白膜，將曲精小管充分分離，用預(yù)冷的PBS溶液充分洗滌曲精小管；
2)以低滲液覆蓋曲精小管，37°C處理IOmin；
3)吸取含細(xì)胞的低滲液加到預(yù)先經(jīng)賴氨酸處理的載玻片上，室溫晾干后，P/oBSA室溫封閉 30min ；
4)滴加一抗，37°C濕盒內(nèi)放置2h，PBS洗滌3次，每次5min；
5)滴加二抗，37°C濕盒內(nèi)放置lh，PBS洗滌3次，每次5min；
6)DAPI復(fù)染lmin, PBS洗滌3次，每次5min ；
7 )抗褪色封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，攝片。低滲液是一種滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的溶液，憑借反滲透作用，當(dāng)細(xì)胞處于低滲環(huán)境時，水分會迅速進(jìn)入細(xì)胞，使其膨脹，甚至破裂，同時可使粘附于染色體的物質(zhì)分散開，充分展示染色體的形態(tài)。常見的低滲液主要成分有4.4g/L檸檬酸鈉、
0.65M甘油磷酸鉀、0.075M氯化鉀等。本發(fā)明借助上述低滲原理，配制出一種改良的低滲液，以其處理生精細(xì)胞，使細(xì)胞自然膨脹，染色體鋪展，與染色質(zhì)結(jié)合的核蛋白得以松解，充分暴露出抗原位點(diǎn)，從而有利于抗體分子進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與目標(biāo)蛋白緊密結(jié)合，增強(qiáng)熒光顯色。這是本發(fā)明方法得以實(shí)施的重要依據(jù)，且低滲的效果主要取決于低滲液的化學(xué)組成和處理時間。本發(fā)明低滲液的組成成分中，檸檬酸鈉是一種弱酸強(qiáng)堿鹽，與檸檬酸配伍可組成較強(qiáng)的PH緩沖劑，用于低滲液中能夠維持細(xì)胞處于最適宜的pH緩沖體系中；其次，檸檬酸鈉還可以螯合二價陽離子，對單層細(xì)胞之間的細(xì)胞連接有一定解離作用，可以起到解離組織的目的。蔗糖是一種天然成分，無毒無害，具有很好的水溶性和滲透作用。EDTA是一種鈣螯合劑，用于低滲液中能夠促進(jìn)細(xì)胞膜對物質(zhì)的通透并排除金屬離子的干擾。DTT具有抗氧化作用，常用作還原劑；在低滲液中添加DTT的用途之一是穩(wěn)定染色質(zhì)，降低染色質(zhì)之間的聚集；另外，DTT也能有效保護(hù)蛋白質(zhì)分子中二硫鍵處于還原狀態(tài)，阻止由于半胱氨酸之間形成二硫鍵造成蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)改變。有文獻(xiàn)報(bào)道，DTT在合適的條件下能將細(xì)胞核蛋白從細(xì)胞染色質(zhì)中溶解出來，本發(fā)明方法中利用DTT能夠很好地保護(hù)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并促進(jìn)核蛋白的釋放。PMSF是一種蛋白酶抑制劑，可以有效抑制蛋白酶對蛋白的降解作用，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性。Tris常用作生物緩沖液，在pH8.2的環(huán)境中，Tris緩沖液為弱堿性溶液，有助于DNA和蛋白質(zhì)去質(zhì)子化，促進(jìn)二者的解離。Tris緩沖液中加入EDTA還常用于DNA的穩(wěn)定和儲存。上述各種成分的生理作用也是本發(fā)明方法得以實(shí)施的重要依據(jù)。本發(fā)明使用低滲液對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，使細(xì)胞快速膨脹，染色質(zhì)散開，核內(nèi)蛋白質(zhì)充分釋放，使生精細(xì)胞能夠更好地與一抗結(jié)合，繼而增強(qiáng)二抗的結(jié)合效率，使熒光著色更加完全充分，從而可以成功制備生精細(xì)胞染色體并進(jìn)行核型分析。同時，本發(fā)明低滲液的組成成分安全無毒，能夠很好地保護(hù)核內(nèi)蛋白質(zhì)維持原有結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式以下以小鼠為例，詳細(xì)說明本發(fā)明利用間接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白方法的操作步驟。但是本發(fā)明方法并不僅局限于小鼠，其他雄性哺乳動物的生精細(xì)胞同樣可以利用本發(fā)明方法進(jìn)行核蛋白的間接免疫熒光染色。1.斷頸處死適當(dāng)周齡的雄性小鼠，75%乙醇浸泡，無菌操作取出小鼠睪丸組織，置于含預(yù)冷PBS溶液的平皿中。2.仔細(xì)剝?nèi)グ啄?，盡量剔除血管，將曲精小管充分分離，移入另一含預(yù)冷PBS溶液的平皿中。3.用PBS溶液洗滌數(shù)次，去除組織碎塊等其它雜質(zhì)。4.在解剖顯微鏡下，用精細(xì)尖嘴鑷子將已分離的單條曲精小管拉展。5.取新鮮配置的低滲液適量覆蓋曲精小管，37°C通透處理10分鐘。6.吸取適量處理后的液體，加到預(yù)先經(jīng)賴氨酸處理的載玻片上，室溫晾干。6.1%BSA室溫封閉30分鐘。7.滴加一抗，37°C濕盒內(nèi)放置2小時。8.PBS洗滌3次，每次5分鐘。9.滴加二抗，37°C濕盒內(nèi)放置I小時。10.PBS洗滌3次，每次5分鐘。11.DAPI 復(fù)染 I 分鐘。12.PBS洗滌3次，每次5分鐘。13.抗褪色封片劑封片。

14.熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，攝片。
權(quán)利要求
1.利用間接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白的方法，其特征是從動物的睪丸組織中分離曲精小管，利用低滲液處理生精細(xì)胞，采用間接免疫熒光染色方法檢測生精細(xì)胞核蛋白，其中，所述的低滲液中包括有17mM檸檬酸鈉、50mM蔗糖、5mM EDTA、0.5mM DTT、0.5mMPMSF, 30mM Tris，低滲液的 pH 值為 8.2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用間接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白的方法，其特征是包括以下步驟: 1)取置于預(yù)冷的PBS溶液中的動物睪丸組織，剝?nèi)ゲG丸組織的白膜，將曲精小管充分分離，用預(yù)冷的PBS溶液充分洗滌曲精小管； 2)以低滲液覆蓋曲精小管，37°C處理IOmin； 3)吸取含細(xì)胞的低滲液加到預(yù)先經(jīng)賴氨酸處理的載玻片上，室溫晾干后，P/oBSA室溫封閉 30min ； 4)滴加一抗，37°C濕盒內(nèi)放置2h，PBS洗滌3次，每次5min； 5)滴加二抗，37°C濕盒內(nèi)放置lh，PBS洗滌3次，每次5min； 6)DAPI復(fù)染lmin, PBS洗滌3次，每次5min ； 7)抗褪色封片劑 封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，攝片。
全文摘要
利用間接免疫熒光染色檢測生精細(xì)胞核蛋白的方法，是從動物的睪丸組織中分離曲精小管，利用低滲液處理生精細(xì)胞，采用間接免疫熒光染色方法檢測生精細(xì)胞核蛋白，其中，所述的低滲液中包括有17mM檸檬酸鈉、50mM蔗糖、5mMEDTA、0.5mMDTT、0.5mMPMSF，30mMTris，pH值為8.2。本發(fā)明使用低滲液對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，使細(xì)胞快速膨脹，染色質(zhì)散開，核內(nèi)蛋白質(zhì)充分釋放，生精細(xì)胞能夠更好地與一抗結(jié)合，繼而增強(qiáng)二抗的結(jié)合效率，使熒光著色更加完全充分，可以成功制備生精細(xì)胞染色體并進(jìn)行核型分析。
文檔編號G01N33/68GK103235137SQ201310107418
公開日2013年8月7日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者郭睿, 閆萍, 于保鋒, 梁樣紅, 楊麗娟, 張小曼, 劉丹, 李春鋒, 高然朋, 解軍 申請人:山西醫(yī)科大學(xué)