專利名稱：萊姆病試劑盒及檢測(cè)萊姆病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及萊姆病試劑盒以及檢測(cè)萊姆病的方法。
背景技術(shù)：
萊姆病的血清學(xué)檢測(cè)方法，主要是用已知抗原檢測(cè)患者體內(nèi)可能存在的針對(duì)萊姆病螺旋體的特異性抗體，最常用的方法是，間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westernblotting)、分子生物學(xué)方法聚合酶鏈(PCR)、組織鏡檢與體外病原菌培養(yǎng)。
到目前為止，萊姆病的實(shí)驗(yàn)室診斷沒(méi)有得到有效的解決，全球仍然沒(méi)有統(tǒng)一的參考標(biāo)準(zhǔn)。
傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)多采用萊姆病螺旋體全菌抗原作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重，如酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，就這兩種方法比較，間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)是將菌體固定于載體上，加上病人的血清，在用螢光二抗來(lái)顯色，其靈敏度低，人為干擾因素比較多。免疫印跡實(shí)驗(yàn)比較復(fù)雜，一般實(shí)驗(yàn)室不易做到。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是敏感特異的方法，但由于病人菌血癥時(shí)間短且不規(guī)則，在臨床實(shí)驗(yàn)室診斷中有其根本的局限性，與PCR在診斷其他病原微生物方面一樣，也具有明顯的誤導(dǎo)作用，目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。
關(guān)于萊姆病螺旋體特異抗體檢測(cè)用抗原可分為以下幾個(gè)發(fā)展階段。
1、全菌抗原1)最傳統(tǒng)的方法，有兩種A.一是將整個(gè)菌體吸附于抗原板上，方法與IFA一樣只能檢測(cè)到菌體表面的抗原，靈敏度和特異性都不滿意，目前已被淘汰。
B.IFA法(免疫熒光法)其特點(diǎn)同上，也是將菌體固定于載體上，但受人為的干擾比較多，如判定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，是在一個(gè)視野能看到有50％的菌體即為陽(yáng)性，這只是多少的估計(jì)，必須在有經(jīng)驗(yàn)的人指導(dǎo)下使用。由于菌體暴露的是表面抗原其靈敏度和特異性也不滿意?，F(xiàn)在雖然用，但趨于淘汰。
C.對(duì)菌體進(jìn)行超聲波擊碎制成可溶性抗原，它的優(yōu)點(diǎn)是讓菌體內(nèi)部的抗原暴露出來(lái)得到檢測(cè)機(jī)會(huì)。但是它的各種抗原比例是菌體本身的組成所決定，而實(shí)際上不同抗原在診斷中所起的作用是不一樣的(即抗原性是不同的)同時(shí)它也不能排除萊姆病螺旋體和其它菌體有交叉的抗原存在2)提純抗原，是應(yīng)用一定的技術(shù)對(duì)萊姆病螺旋體內(nèi)部分抗原進(jìn)行提純，提取主要免疫反應(yīng)性抗原，使用最多的是用超速離心方法提取鞭毛蛋白，因?yàn)殡S著人們研究的深入和應(yīng)用范圍的增加，認(rèn)識(shí)到病人在早期和晚期都產(chǎn)生對(duì)鞭毛蛋白的抗體，德國(guó)的Klause Hensen用它做抗原發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性都高于全菌ELISE，但由于沒(méi)能去除交叉的鞭毛蛋白成份，仍有假陽(yáng)性的發(fā)生，為此，后來(lái)人們?cè)诤铣煽乖袃H對(duì)鞭毛蛋白中對(duì)萊姆病螺旋體特異的片段進(jìn)行克隆表達(dá)，即基因工程抗原。
3)基因工程抗原，隨著研究的深入人們已經(jīng)了解到哪些蛋白是主要的早期免疫反應(yīng)性蛋白，利用分子克隆和表達(dá)技術(shù)對(duì)某些蛋白進(jìn)行合成，用作ELISA抗原。

發(fā)明內(nèi)容
萊姆病是近十年來(lái)在世界廣泛流行的人畜共患新病種之一，其流行之廣泛在世界有多個(gè)國(guó)家報(bào)道。我國(guó)已發(fā)現(xiàn)萊姆病疫源地區(qū)17個(gè)省市，22個(gè)省市有萊姆病的報(bào)道。由于萊姆病對(duì)人體危害極大，又不易被臨床醫(yī)生認(rèn)識(shí)，所以極易引起臨床上的誤診誤治，有些萊姆病病人長(zhǎng)期得不到有效醫(yī)治，造成終身殘疾，甚至死亡，所以萊姆病的臨床實(shí)驗(yàn)診斷成為我國(guó)近幾年來(lái)的重要研究課題，2001年列入國(guó)家“十五”攻關(guān)計(jì)劃。我院研究萊姆病已有十余年的歷史，所以根據(jù)國(guó)外的資料，我們用我國(guó)自行分離的萊姆病螺旋體菌株BmpA即P39基因，成功的進(jìn)行基因克隆。P39基因在大腸桿菌中以天然蛋白形式得到高效表達(dá)(參閱佟玉偘等人的“萊姆病螺旋體T39蛋白的基因克隆及在大腸桿菌的高效表達(dá)”，中國(guó)人獸共患病雜志，2000，16卷，第4期，9-11頁(yè))。表達(dá)的P39蛋白，在一系列的試劑組合作用下，較好的解決了以往的抗原交叉反應(yīng)問(wèn)題。用于ELISA檢測(cè)臨床萊姆病收到良好的社會(huì)效益，其抗原處于國(guó)家萊姆病實(shí)驗(yàn)診斷用抗原領(lǐng)先地位。填補(bǔ)了我國(guó)無(wú)檢測(cè)萊姆病試劑盒的空白。
因此，本發(fā)明的目的是提供萊姆病試劑盒，該試劑盒特征在于包括P39蛋白抗原包被的載體微孔板，酶標(biāo)抗體，和底物液。
本發(fā)明的試劑盒還可包括IgG陽(yáng)性標(biāo)本，IgG陰性標(biāo)本，樣品稀釋液，洗滌液和終止液。
優(yōu)選，樣品液稀釋液包括Na2HPO412H2O，NaH2PO42H2O，NaCL，馬血清，硫柳汞，慶大霉素和H2O；酶標(biāo)抗體稀釋液包括Na2HPO412H2O，NaH2PO42H2O，NaCL，Casein，硫柳汞，慶大霉素，馬血清和H2O；洗液包括NaCL，KCL，KH2PO4，Na2HPO412H2O，Twee-20和H2O；底物液包括底物液A和底物液B，底物液A包括檸檬酸，醋酸鈉，過(guò)氧化脲和H2O，底物液B包括檸檬酸，EDTA，H2O和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；和終止液為2N H2SO4。
實(shí)施方案本發(fā)明的試劑盒的組成1)聚苯乙烯微孔板(深圳化工一廠)。
2)酶標(biāo)鼠抗人IgG抗體進(jìn)行篩選，選擇協(xié)和基礎(chǔ)研究所用辣根酶記，2株鼠抗人單克隆抗體，混和抗體為應(yīng)用二抗，其使用濃度為1∶10000(2D1和2D5)。
3)P39蛋白抗原包被濃度的篩選，應(yīng)用濃度為145ng/ml。該抗原用我國(guó)自行分離的萊姆病螺旋體菌株BmpA即P39基因，成功的進(jìn)行基因克隆，在大腸桿菌中以天然蛋白形式高效表達(dá)來(lái)制取。
4)試劑
A封閉液NaCl 8.0g Na2HPO4.12H2O 5.8g NaH2PO42H2O 0.593g Casein2.5g 蔗糖50g 馬血清22mL H2O 1000mLB樣品液稀釋液Na2HPO412H2O 5.8g NaH2PO42H2O 0.593g NaCL 8.0g 馬血清 50mL 硫柳汞 0.5g 慶大霉素2ml H2O 1000mLC酶標(biāo)抗體稀釋液Na2HPO412H2O 5.8g NaH2PO42H2O 0.593g NaCL8.0gCasein 2.5g 硫柳汞 0.5g 慶大霉素 2mL 馬血清 50mL H2O1000mLD洗液NaCL 8.0g KCL 0.2g KH2PO42.0gNa2HPO412H2O 2.9g Twee-20 1.0mL H2O 1000mLE包被液Na2CO31.59g NaHCO32.93g H2O 1000mlF底物液A檸檬酸 2.101g 醋酸鈉 12.247g 過(guò)氧化脲 0.6gH2O1000ml底物液B檸檬酸2.101g EDTA 0.3g H2O 1000ml四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 1.0g溶于上液中
G終止液 2N/H2SO45)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)最佳溫度37℃本發(fā)明萊姆病試劑盒的檢測(cè)方法本試劑盒采用了基因工程抗原P39包被48孔板，底物為TMB，采用先進(jìn)的樣品稀釋液配方，使其穩(wěn)定性好特異性強(qiáng)，適合批量檢測(cè)，可供臨床檢驗(yàn)科或?qū)嶒?yàn)室診斷及萊姆病研究，本試劑盒于4℃保存，有效期暫定為6個(gè)月。
1、預(yù)包被微孔條 5、樣品稀釋液2、酶聯(lián)試劑 6、PBST洗滌液3、IgG陽(yáng)性標(biāo)本(20倍稀釋)7、顯色劑、A、B。
4、IgG陰性標(biāo)本(20倍稀釋)8、終止液(2M H2SO4)操作步驟1、洗滌液配制，每瓶PBST洗滌液用蒸流水稀釋至400ml；2、標(biāo)本稀釋，用樣品稀釋液稀釋400倍；3、陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清的稀釋，盒內(nèi)陽(yáng)性和陰性對(duì)照血清已20倍稀釋好，用者只需吸取10μL加入200μL樣品稀釋液，即為應(yīng)用對(duì)照血清；4、加樣，將稀釋好的待檢測(cè)樣品及對(duì)照血清，按順序分別加入100μL與微孔中；5、溫育，置37℃溫育60分種；6、洗滌，將孔內(nèi)的液體甩干，用洗滌液，洗滌3次×5分種；
7、加酶聯(lián)試劑每孔100μL；8、溫育，置37℃溫育20分種；9、洗滌，將孔內(nèi)的液體甩干，用洗滌液，洗滌3次×5分鐘；10、顯色，每孔加顯色劑A、B各一滴(50μL)混勻，37℃或室溫避光5分種；11、終止液，每孔加一滴(50μL)混勻；12、用酶標(biāo)儀450nm測(cè)定各孔OD值。
結(jié)果判定用空白調(diào)零點(diǎn)，以O(shè)D值＞0.200為陽(yáng)性洗滌液的配制NaCL 8.0gKCL0.2gNa2HPO4.12H2O 2.9gKH2PO40.2gTween201.0ml蒸餾水 1000ml本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))是將特異性的萊姆病螺旋體抗原按照一定的量包被于微孔板上，然后將病人血清和抗原發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，加入辣根酶標(biāo)記過(guò)的抗人IgG抗體，加入底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。
該試劑盒應(yīng)用基因工程抗原，其優(yōu)點(diǎn)是抗原免疫源性強(qiáng)、穩(wěn)定、能批量生產(chǎn)，并用一套試劑和多個(gè)單克隆鼠抗人IgG抗體，解決了顯色時(shí)交叉反應(yīng)，使本底更清晰，該試劑盒操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器一般醫(yī)院檢驗(yàn)科專業(yè)人員均可操作。能廣泛用于流行病調(diào)查和單個(gè)病人檢測(cè)。與其它檢測(cè)方法比較易于推廣。
我國(guó)應(yīng)用重組蛋白診斷萊姆病的工作尚未開展，而且急需建立一種簡(jiǎn)便，敏感，特異的血清學(xué)檢測(cè)方法。為此，我們的試劑盒解決了這一問(wèn)題。方便了臨床的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種萊姆病試劑盒，包括萊姆病螺旋體P39基因表達(dá)的P39蛋白抗原包被的載體微孔板，酶標(biāo)抗體，和底物液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的萊姆病試劑盒，特征在于還包括IgG陽(yáng)性標(biāo)本，IgG陰性標(biāo)本，樣品稀釋液，洗滌液和終止液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的萊姆病試劑盒，其中底物液包括底物液A和B，其中A包括檸檬酸，醋酸鈉，過(guò)氧化脲和H2O，底物液B包括檸檬酸，EDTA，H2O和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的萊姆病試劑盒，其中終止液為2N H2SO4。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的萊姆病試劑盒，其中酶標(biāo)抗體為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的2株鼠抗人單克隆抗體。
6.一種檢測(cè)萊姆病的方法，包括將萊姆病螺旋體P39基因表達(dá)的P39蛋白抗原按照一定的量包被于微孔板上，然后將病人血清和抗原發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，加入辣根酶標(biāo)記過(guò)的抗人IgG抗體，加入底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及萊姆病檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明的萊姆病試劑盒包括P39蛋白抗原包被的載體微孔板，酶標(biāo)抗體，和底物液等。本發(fā)明的萊姆病試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是抗原免疫源性強(qiáng)、穩(wěn)定、能批量生產(chǎn)，并用一套試劑和多個(gè)單克隆鼠抗人IgG抗體，解決了顯色時(shí)交叉反應(yīng)，使本底更清晰，該試劑盒操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器一般醫(yī)院檢驗(yàn)科專業(yè)人員均可操作。能廣泛用于流行病調(diào)查和單個(gè)病人檢測(cè)。與其它檢測(cè)方法比較易于推廣。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1469125SQ0215318
公開日2004年1月21日 申請(qǐng)日期2002年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月15日
發(fā)明者賈月萍, 佟玉偘, 張曉芳, 陳昌松, 祝楊, 王東香 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二六一醫(yī)院