酸鹽緩沖液，混勻后用50K超濾管在3000r/min，4°C條件下離心1min ;重復(fù)以上步驟三次，使最后一次CRP和PCT抗體溶液總體積不超過(guò)50 μ I。用微量PH計(jì)檢測(cè)最終pH并調(diào)節(jié)pH值至8.5。將步驟3處理的量子點(diǎn)和抗體分別混合，混勻后在搖床上反應(yīng)6h，反應(yīng)溫度23?25°C。反應(yīng)結(jié)束后用superdex 200分離量子點(diǎn)-CRP復(fù)合物并用100K超濾管將復(fù)合物濃縮到200 μ I以內(nèi)，測(cè)蛋白濃度后加入總濃度為lmg/ml的Gly后放于4°C保存。
[0051]4.樣品的檢測(cè):
[0052]I)準(zhǔn)備好血清及二抗后，取出抗原片，平衡至室溫。
[0053]2)用PBS洗3次(放入PBS溶液中均勻緩慢晃動(dòng))，每次3分鐘，每孔滴加15ul血清(陽(yáng)性質(zhì)控孔中加入甲型流感病毒血凝素抗體)，37°C溫育60min。
[0054]3)用PBS清洗3次(放入PBS溶液中均勻緩慢晃動(dòng))，每次5分鐘，用純化水緩慢水流沖洗玻片(注意不要沖入玻片孔中)。
[0055]4)待瞭干后，每孔滴加量子點(diǎn)標(biāo)記抗人IgM抗體15ul (陽(yáng)性質(zhì)控孔中加入甲型流感病毒血凝素抗體-抗抗體)，37°C溫育30分鐘。
[0056]5)孵育完成用PBS清洗3次(放入PBS溶液中均勻緩慢晃動(dòng))，每次5分鐘，用純化水緩慢水流沖洗玻片(注意不要沖入玻片孔中)。
[0057]6)待晾干后蓋上蓋玻片，封片鏡檢。
[0058]7)利用計(jì)算機(jī)對(duì)掃描圖片進(jìn)行鏡檢和分析:首先掃描抗原片上行，對(duì)時(shí)間進(jìn)行記錄，逐個(gè)玻片孔進(jìn)行掃描檢測(cè)，待上行掃描完畢再對(duì)下行玻片孔進(jìn)行掃描。
[0059]結(jié)果分析:
[0060]有效性判斷:陽(yáng)性質(zhì)控孔中出現(xiàn)紅色熒光，表明抗原片并未失效，無(wú)紅色熒光則可能試劑盒失去效力或者有人為操作失誤出現(xiàn)。
[0061]陰性質(zhì)控孔中無(wú)明顯熒光出現(xiàn)，表明病人血清沒(méi)有特異性與細(xì)胞結(jié)合；若有綠色熒光出現(xiàn)，可能病人血清中含有與細(xì)胞特異性結(jié)合的成分，結(jié)果可能不可取。
[0062]結(jié)果判斷:陽(yáng)性結(jié)果:可觀察到呼吸道合胞病毒、肺炎支原體孔中出現(xiàn)紅色熒光；腺病毒、肺炎衣原體孔中出現(xiàn)藍(lán)色熒光；人感病毒、嗜肺軍團(tuán)菌中出現(xiàn)黃色熒光、副流感病毒、柯薩奇病毒中出現(xiàn)深紅色熒光；?？刹《局谐霈F(xiàn)綠色熒光。
[0063]陰性結(jié)果:玻片孔中無(wú)熒光出現(xiàn)。
[0064]其中，所述包被優(yōu)選方法為:1.用質(zhì)量體積比5%的磷壁酸水溶液處理玻片1min,處理完畢倒出剩余液體。2.將細(xì)胞懸液滴加在撥片孔中，細(xì)胞懸液滴加前置超聲波震蕩10s-20s。3.紫外照射10min-15min，冷丙酮固定lOmin。4.50%甘油水溶液浸潤(rùn)5min。5.吹干后冷凍保存待用。
[0065]其中，所述的化學(xué)交聯(lián)法優(yōu)選為，使用EDC/NHS交聯(lián)法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量子點(diǎn)的修飾。修飾方案為優(yōu)化過(guò)的方案，其中關(guān)鍵步驟包括:
[0066]I)用新的磷酸鹽緩沖液清洗量子點(diǎn)，充分去除量子點(diǎn)原保存緩沖液，使量子點(diǎn)達(dá)到指定pH值，并用超濾法濃縮到指定濃度。
[0067]所述磷酸鹽緩沖液濃度為10mmol/L，pH = 7.2?7.5，不含其它任何成分；量子點(diǎn)最終所達(dá)到的pH在7.2?7.5之間。所述超濾法指用10K超濾管在5000r/min，25°C條件下離心6min。
[0068]2)用EDC和NHS活化量子點(diǎn)表面羧基，嚴(yán)格控制EDC、NHS與量子點(diǎn)的摩爾比、反應(yīng)時(shí)間和溫度；
[0069]所述需嚴(yán)格控制的條件是:EDC、NHS與量子點(diǎn)的摩爾比應(yīng)為25000: 5000: 1，溫度為23?25°C，反應(yīng)時(shí)間為60min。所述EDC和NHS不能配制成溶液使用，用分析天平稱量后應(yīng)迅速加入反應(yīng)液中，注意EDC和NHS在低溫干燥條件下稱量。
[0070]3)用硼酸鹽緩沖液再次清洗活化后的量子點(diǎn)，以充分去除EDC和NHS，用超濾管超濾濃縮后將活化后的量子點(diǎn)保存于新的PH環(huán)境中；
[0071]所述硼酸鹽緩沖液濃度為50mmol/l，pH = 8.5，量子點(diǎn)和免疫球蛋白最終所達(dá)到的pH為8.5 ;所述超濾法指用10K超濾管在5000r/min, 25°C條件下離心6min。所述新的pH環(huán)境指濃度為50mmol/L，pH = 8.5硼酸鹽緩沖液環(huán)境。
[0072]4)用硼酸鹽緩沖液充分清洗待用免疫球蛋白，并用超濾管多次低速超濾濃縮以去除蛋白原保存液中的NaN3，并使免疫球蛋白處于指定的pH環(huán)境中。
[0073]所述硼酸鹽緩沖液濃度為50mmol/L，pH = 8.5，量子點(diǎn)和免疫球蛋白最終所達(dá)到的pH為8.5 ;所述超濾法指用50K超濾管在3000r/min, 4°C條件下離心1min ;指定的pH環(huán)境濃度為50mmol/L，pH = 8.5硼酸鹽緩沖液環(huán)境。
[0074]5)將活化的量子點(diǎn)和免疫球蛋白按照特定比例混合，同時(shí)不斷晃動(dòng)，在指定溫度下反應(yīng)特定時(shí)間；
[0075]所述量子點(diǎn)于免疫球蛋白的摩爾比為1:10，反應(yīng)時(shí)間為6h。I微摩爾量子點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的免疫球蛋白偶聯(lián)反應(yīng)總體系為1.25微升，此體系根據(jù)需要可等比例放大。
[0076]反應(yīng)結(jié)束后用排阻層析分離量子點(diǎn)免疫球蛋白復(fù)合物和過(guò)量的免疫球蛋白。量子點(diǎn)免疫球蛋白復(fù)合物用超濾管濃縮到指定濃度并加入硼酸鹽配制的Gly封閉液，4°C度保存，嚴(yán)禁凍存。所述排阻層析柱填料為superdex200或Sephacryl 300，流速為1.5ml/min。Gly封閉液達(dá)到的終濃度為lmg/ml。若長(zhǎng)期保存需加入0.0 lmg/ml的NaN3。
[0077]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)有:可以同時(shí)檢測(cè)九種呼吸道病原體，呼吸道病原體檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，樣本和量子點(diǎn)標(biāo)記二抗的孵育在25°C _37°C下即可完成，無(wú)需其他額外設(shè)備，2小時(shí)便可完成整個(gè)檢測(cè)。利用量子點(diǎn)的多色性，實(shí)現(xiàn)電腦自動(dòng)識(shí)別區(qū)分病原體，可以更好、更準(zhǔn)確的檢測(cè)不同病原體。選用的五種波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，每種顏色波長(zhǎng)之間相距30nm以上，可以清晰的分辯出五種顏色，更有利于計(jì)算機(jī)的自動(dòng)判讀。
[0078]上述內(nèi)容，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用于限制本發(fā)明的實(shí)施方案，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的主要構(gòu)思和精神，可以十分方便地進(jìn)行相應(yīng)的變通或修改，故本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書(shū)所要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟: 第一步，對(duì)病原體進(jìn)行包被，并進(jìn)行增殖培養(yǎng)； 第二步，設(shè)置質(zhì)控孔，將無(wú)吸附病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陰極質(zhì)控孔中，做陰極對(duì)照，將吸附有病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陽(yáng)極質(zhì)控孔中，做陽(yáng)極對(duì)照； 第三步，用化學(xué)交聯(lián)法將量子點(diǎn)與抗人IgM的特異性抗體連接，得到量子點(diǎn)修飾抗體； 第四步，利用計(jì)算機(jī)對(duì)掃描圖片進(jìn)行鏡檢和分析。
2.如權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其特征在于，所述的第一步中病原體增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)至病原體細(xì)胞長(zhǎng)至80%單層。
3.如權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其特征在于，所述的玻片上設(shè)有凹槽，所述凹槽底部設(shè)有縱橫分布的條紋。
4.如權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其特征在于，所述的病原體包被包括以下步驟: 第一步，用體積比5%的磷壁酸溶液處理玻片； 第二步，將病原體細(xì)胞懸浮液用超聲波震蕩10至20秒，然后將細(xì)胞懸浮液滴加在玻片孔中； 第三步，將細(xì)胞懸浮液用紫外線照射10至15分鐘，然后用冷丙酮固定10分鐘； 第四步，用體積比為50%的甘油溶液浸潤(rùn)5分鐘； 第五步，吹干后冷凍保存待用。
5.如權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其特征在于，所述的量子點(diǎn)包括單一化合物的量子點(diǎn)和核殼型量子點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其特征在于，所述的化學(xué)交聯(lián)法為EDC/NHS交聯(lián)法。
【專利摘要】一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光的病原體檢測(cè)方法，其包括如下步驟：第一步，對(duì)病原體進(jìn)行包被，并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；第二步，設(shè)置質(zhì)控孔，將無(wú)吸附病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陰極質(zhì)控孔中，做陰極對(duì)照，將吸附有病毒的MDCK細(xì)胞包被在玻片陽(yáng)極質(zhì)控孔中，做陽(yáng)極對(duì)照；第三步，用化學(xué)交聯(lián)法將量子點(diǎn)與抗人IgM的特異性抗體連接，得到量子點(diǎn)修飾抗體；第四步，利用計(jì)算機(jī)對(duì)掃描圖片進(jìn)行鏡檢和分析。本發(fā)明的一種基于量子點(diǎn)間接免疫熒光標(biāo)記方法，其靈敏度高、自動(dòng)化強(qiáng)、細(xì)胞固定穩(wěn)固等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33-569, G01N33-542
【公開(kāi)號(hào)】CN104634969
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510081033
【發(fā)明人】張二盈
【申請(qǐng)人】深圳市金準(zhǔn)生物醫(yī)學(xué)工程有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日