本發(fā)明涉及一種分子檢測技術(shù)。更確切地說，本發(fā)明涉及DNA甲基化檢測。

背景技術(shù)：

分子檢測在臨床診斷和分子生物學(xué)研究方面起重要作用。舉例來說，DNA甲基化檢測被視為若干應(yīng)用中的關(guān)鍵檢測。DNA中的胞嘧啶(也稱為甲基化胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶)的5'碳的甲基化為調(diào)節(jié)基因表達(dá)且在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用的表觀遺傳修飾，且被認(rèn)為涉及癌癥、基因組印跡、細(xì)胞分化和阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease)(栗田(Kurita),亮司(Ryoji)和丹羽治(Osamu Niwa).“通過凸出部分特異性免疫識別觸發(fā)的DNA甲基化分析(DNA methylation analysis triggered by bulge specific immuno-recognition)”.分析化學(xué)(Analytical chemistry)84.17(2012):7533-7538)。

已開發(fā)若干系統(tǒng)以進(jìn)行用于檢測和/或鑒別DNA分子中的5-甲基胞嘧啶的數(shù)目和/或位置的DNA甲基化檢測。DNA甲基化檢測的主要方法為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化法(李斯特(Lister),瑞恩(Ryan)等人“堿基分解下的人類DNA甲基化組顯示分布廣泛的表觀基因組差異(Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences)”自然(Nature)462.7271(2009):315-322)。在所述方法中，待測試的DNA分子用亞硫酸氫鹽處理以將胞嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)化為尿苷核苷酸，留下未經(jīng)轉(zhuǎn)化的5-甲基胞嘧啶核苷酸。轉(zhuǎn)化的尿苷核苷酸在聚合酶鏈反應(yīng)的后續(xù)復(fù)制中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶核苷酸。另一方面，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的5-甲基胞嘧啶核苷酸在復(fù)制中仍為胞嘧啶核苷酸。為了區(qū)分轉(zhuǎn)化的胸腺嘧啶核苷酸與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的胞嘧啶核苷酸，應(yīng)用基因定序或微陣列方法。舉例來說，全基因組鳥槍亞硫酸氫鹽定序(WGSGS)用于分析亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化之后的全基因序列，且可通過單堿基分解獲得特定情況下的甲基化模式。然而，所述定序?yàn)橘M(fèi)力且成本高的。為了補(bǔ)救所述缺陷，開發(fā)與限制酶聯(lián)合的簡化表示亞硫酸氫鹽定序(RRBS)方法以消除不必要片段，但成本仍不符合要求。另一方法為使用微陣列方法，其能夠以快速和高通量方式分析特定片段的甲基化模式，且廣泛應(yīng)用于藥物篩選。盡管如此，微陣列方法未能測定5-甲基胞嘧啶核苷酸的數(shù)目和位置。

也已開發(fā)用于DNA甲基化檢測生物同切點(diǎn)酶方法。同切點(diǎn)酶為對相同識別位點(diǎn)具有特異性的限制酶對。常用同切點(diǎn)酶中的一個(gè)為僅識別未甲基化胞嘧啶核苷酸且并不識別甲基化胞嘧啶核苷酸的甲基化敏感性酶。另一常用同切點(diǎn)酶為僅識別甲基化胞嘧啶核苷酸且并不識別未甲基化胞嘧啶核苷酸的甲基化依賴性酶。通過并入不同種類的同切點(diǎn)酶，可檢測5-甲基胞嘧啶核苷酸。不幸的是，所述方法的應(yīng)用由于同切點(diǎn)酶的固有特性而高度受限，且僅可檢測位于特定同切點(diǎn)酶對的識別位點(diǎn)的5-甲基胞嘧啶核苷酸。

DNA甲基化檢測的另一方法為親和力方法。與5-甲基胞嘧啶核苷酸具有特異性親和力的抗體或蛋白質(zhì)用于捕獲含有5-甲基胞嘧啶核苷酸的片段，且基因定序或微陣列方法隨后用于分析捕獲片段。親和力方法的實(shí)例為使用抗體的甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)(韋伯(Weber),邁克爾(Michael)等人“與染色體同寬且啟動子特異性分析鑒別正常和轉(zhuǎn)化人類細(xì)胞中的差異性DNA甲基化的位點(diǎn)(Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.)”自然·遺傳學(xué)(Nature genetics)37.8(2005):853-862)或使用甲基結(jié)合域蛋白質(zhì)(MBD)的甲基化CGI恢復(fù)分析(MIRA)(克洛斯(Cross),薩利H(Sally H.)等人“使用甲基化DNA結(jié)合柱的CpG島的純化(Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column)”自然·遺傳學(xué)6.3(1994):236-244；栗田,亮司和丹羽治.“通過凸出部分特異性免疫識別觸發(fā)的DNA甲基化分析”分析化學(xué)84.17(2012):7533-7538)。在親和力方法中，通過如聲處理的方式提供片段且必要時(shí)還提供單鏈片段?？贵w或蛋白質(zhì)首先用于捕獲含有5-甲基胞嘧啶核苷酸的片段。在與抗體或蛋白質(zhì)分離之后，捕獲片段通過基因定序或微陣列分析。由于需要定序或微陣列方法，由如上所述的方法產(chǎn)生的缺陷無法避免。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了改進(jìn)DNA甲基化檢測靈敏度和精確性，提供一種快速且方便的檢測方法。

本發(fā)明提供一種檢測靶寡核苷酸分子的甲基化的方法，其包含獲得由于帶電甲基化檢測分子與靶寡核苷酸分子的結(jié)合而出現(xiàn)的電性變化；其中帶電甲基化檢測分子具有與甲基化胞嘧啶核苷酸的親和力。

本發(fā)明還提供一種檢測靶寡核苷酸分子的甲基化的試劑盒，其包含：

具有與甲基化胞嘧啶核苷酸的親和力的帶電甲基化檢測分子；和

用于檢測電性變化的電性變化檢測元件。

在以下部分中詳細(xì)描述本發(fā)明。本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)可發(fā)現(xiàn)于具體實(shí)施方式和權(quán)利要求書中。

附圖說明

圖1顯示檢測本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的靶寡核苷酸分子的甲基化的方法的示意圖。

圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的電中性核苷酸的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例。

圖3顯示具有SEPT9甲基DNA標(biāo)靶1(C5)的SEPT9DNA探針1的I_d-V_g曲線?！啊觥敝甘?0mM雙-三丙烷緩沖液中檢測的電信號；“●”指示通過SEPT9甲基DNA標(biāo)靶1誘導(dǎo)的電信號；“▲”指示通過1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗體誘導(dǎo)的電信號。

圖4顯示具有SEPT9甲基DNA標(biāo)靶2(C14)的SEPT9DNA探針1的I_d-V_g曲線?！啊觥敝甘?0mM雙-三丙烷緩沖液中檢測的電信號；“●”指示通過SEPT9甲基DNA標(biāo)靶2誘導(dǎo)的電信號；“▲”指示通過1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗體誘導(dǎo)的電信號。

圖5顯示具有SEPT9甲基DNA標(biāo)靶3(C26)的SEPT9DNA探針1的I_d-V_g曲線?！啊觥敝甘?0mM雙-三丙烷緩沖液中檢測的電信號；“●”指示通過SEPT9甲基DNA標(biāo)靶3誘導(dǎo)的電信號；“▲”指示通過1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗體誘導(dǎo)的電信號。

圖6顯示通過靶DNA(左側(cè)柱)和抗體(右側(cè)柱)誘導(dǎo)的納米線FET(NWFET)的閾值電壓位移。

圖7顯示抗體與靶DNA的閾值電壓位移比率。

圖8顯示具有SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6(C2,16,32)的SEPT9DNA探針2的I_d-V_g曲線?！啊觥敝甘?0mM雙-三丙烷緩沖液中檢測的電信號；“●”指示通過SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6誘導(dǎo)的電信號；“▲”指示通過0.25μg/mL抗甲基胞嘧啶抗體誘導(dǎo)的電信號。

圖9顯示通過靶DNA(左側(cè)柱)和抗體(右側(cè)柱)誘導(dǎo)的NWFET的閾值電壓位移。1×意指靶寡核苷酸分子具有一個(gè)甲基化胞嘧啶核苷酸。2×意指靶寡核苷酸分子具有兩個(gè)甲基化胞嘧啶核苷酸。3×意指靶寡核苷酸分子具有三個(gè)甲基化胞嘧啶核苷酸。

圖10顯示抗體與靶寡核苷酸分子的閾值電壓位移比率。

圖11顯示具有SEPT9甲基DNA標(biāo)靶7的SEPT9DNA探針2的I_d-V_g曲線。

圖12顯示與SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6(C2,C16,C32)和抗體結(jié)合的部分中性單鏈寡核苷酸(N-DNA)探針的I_d-V_g曲線?！啊觥敝甘?0mM雙-三丙烷緩沖液中檢測的電信號；“●”指示通過SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6誘導(dǎo)的電信號；“▲”指示通過0.1μg/mL抗甲基胞嘧啶抗體誘導(dǎo)的電信號。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種檢測靶寡核苷酸分子的甲基化的方法，其包含獲得由于帶電甲基化檢測分子與靶寡核苷酸分子的結(jié)合而出現(xiàn)的電性變化；其中帶電甲基化檢測分子具有與甲基化胞嘧啶核苷酸的親和力。

如本文所用，術(shù)語“寡核苷酸”或“寡核苷酸分子”是指核苷酸的寡聚物。術(shù)語“核苷酸”是指由含氮堿基、糖和一或多個(gè)磷酸酯基；優(yōu)選一個(gè)磷酸酯基構(gòu)成的有機(jī)分子。含氮堿基包括嘌呤或嘧啶的衍生物。嘌呤包括經(jīng)取代或未經(jīng)取代的腺嘌呤和經(jīng)取代或未經(jīng)取代的鳥嘌呤；嘧啶包括經(jīng)取代或未經(jīng)取代的胸腺嘧啶、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的胞嘧啶和經(jīng)取代或未經(jīng)取代的尿嘧啶。糖優(yōu)選地為五碳糖，更優(yōu)選地經(jīng)取代或未經(jīng)取代的核糖或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的脫氧核糖。磷酸酯基與糖的2碳、3碳或5碳；優(yōu)選地與5碳位點(diǎn)形成鍵。為了形成寡核苷酸，通過磷酸二酯橋?qū)⒁粋€(gè)核苷酸的糖與相鄰糖接合。優(yōu)選地，寡核苷酸為DNA或RNA；更優(yōu)選地為DNA。

如本文所用，術(shù)語“靶寡核苷酸分子”是指天然存在的或人工分子。在另一方面中，靶寡核苷酸分子為純化的或與其它內(nèi)容物混合。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，靶寡核苷酸分子的甲基化模式在正常條件和異常條件(如疾病)下不同。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，靶寡核苷酸分子的甲基化模式在不同細(xì)胞類型中不同。

如本文所用，術(shù)語“靶寡核苷酸分子的甲基化”是指靶寡核苷酸分子中的甲基化核苷酸。確切地說，甲基化核苷酸是指甲基化胞嘧啶核苷酸。如本文所用，甲基化胞嘧啶核苷酸具有胞嘧啶的5'碳中的甲基取代，且也稱為5-甲基胞嘧啶核苷酸。當(dāng)靶寡核苷酸分子包含甲基化胞嘧啶核苷酸時(shí)，靶寡核苷酸分子具有具有至少一個(gè)甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列。

如本文所用，術(shù)語“檢測靶寡核苷酸分子的甲基化”是指發(fā)現(xiàn)或測定靶寡核苷酸分子的甲基化概況或模式，包括(但不限于)靶寡核苷酸分子中的甲基化核苷酸的位置、數(shù)目或百分比。

如本文所用，術(shù)語“帶電甲基化檢測分子”是指具有與甲基化胞嘧啶核苷酸的親和力且攜有電荷的分子。優(yōu)選地，帶電甲基化檢測分子為特異性結(jié)合到甲基化胞嘧啶核苷酸的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，帶電甲基化檢測分子選自由以下組成的群組：抗甲基胞嘧啶抗體、甲基結(jié)合域蛋白質(zhì)和限制酶。抗甲基胞嘧啶抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，抗甲基胞嘧啶抗體識別單鏈寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸，且在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，抗甲基胞嘧啶抗體識別雙鏈寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸。在另一方面中，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，甲基結(jié)合域蛋白質(zhì)結(jié)合到單鏈寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸，且在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，甲基結(jié)合域蛋白質(zhì)結(jié)合到雙鏈寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸。甲基結(jié)合域蛋白質(zhì)的實(shí)例包括甲基-CpG結(jié)合域(MBD)1、MBD2、MBD3和MBD4蛋白質(zhì)。在另一方面中，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，限制酶識別單鏈寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸，且在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，限制酶識別雙鏈寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸。限制酶的實(shí)例包括HpaII、MspI、SmaI和XmaI。

根據(jù)本發(fā)明，如果甲基化胞嘧啶核苷酸存在于靶寡核苷酸分子中，那么帶電甲基化檢測分子結(jié)合到靶寡核苷酸分子的甲基化胞嘧啶核苷酸。由于帶電甲基化檢測分子攜有電荷，由于帶電甲基化檢測分子與靶寡核苷酸分子的結(jié)合而出現(xiàn)電性變化，所述結(jié)合是通過將帶電甲基化檢測分子的電荷引入到由帶電甲基化檢測分子和靶寡核苷酸分子形成的復(fù)合物中。另一方面，如果甲基化胞嘧啶核苷酸不存在于靶寡核苷酸分子中，那么帶電甲基化檢測分子無法結(jié)合到靶寡核苷酸分子的甲基化胞嘧啶核苷酸。因此，電環(huán)境不變，且未出現(xiàn)電性變化。通過監(jiān)測電性變化，檢測靶寡核苷酸分子的甲基化，且測定靶寡核苷酸分子的甲基化概況或模式。

根據(jù)本發(fā)明的電性變化包括(但不限于)電荷的增加。電性變化可檢測為電信號。電信號包括(但不限于)導(dǎo)電性、電場、電容、電流、電子或電子空穴的變化。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，電性變化為閾值電壓位移變化。

優(yōu)選地，電性變化通過電性變化檢測元件檢測。電性變化檢測元件應(yīng)用于檢測是否由于帶電甲基化檢測分子與靶寡核苷酸分子的結(jié)合而出現(xiàn)電性變化。優(yōu)選地，電性變化檢測元件為場效應(yīng)晶體管或表面等離子體共振。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，檢測靶寡核苷酸分子的甲基化的方法包含：

通過識別單鏈寡核苷酸分子捕獲靶寡核苷酸分子的單鏈以根據(jù)堿基互補(bǔ)性形成雙螺旋；

提供帶電甲基化檢測分子；和

將雙螺旋與帶電甲基化檢測分子結(jié)合且檢測由結(jié)合所致的電性變化。

靶寡核苷酸分子可為單鏈分子或雙鏈分子。獲得雙鏈靶寡核苷酸分子的單鏈的方式可例如為加熱或改變雙鏈靶寡核苷酸分子的環(huán)境的離子強(qiáng)度。

如本文所用，術(shù)語“識別單鏈寡核苷酸分子”是指根據(jù)堿基互補(bǔ)性能夠與靶寡核苷酸分子形成雙螺旋的單鏈寡核苷酸分子。換句話說，識別單鏈寡核苷酸分子充當(dāng)雜交靶寡核苷酸分子的探針。雙螺旋優(yōu)選地是指雙鏈結(jié)構(gòu)，且一條鏈為靶寡核苷酸分子的單鏈且另一條鏈為識別單鏈寡核苷酸分子。優(yōu)選地，識別單鏈寡核苷酸分子具有與靶序列匹配的序列；更優(yōu)選地，具有與靶序列完全匹配的序列。通過形成雙螺旋，靶寡核苷酸分子可捕獲自樣品中的混合物。捕獲步驟也指特異性選擇靶寡核苷酸分子和在雙螺旋中呈現(xiàn)靶寡核苷酸分子的純化步驟。因此，帶電甲基化檢測分子結(jié)合到雙螺旋，尤其雙螺旋中的靶核苷酸分子的甲基化胞嘧啶核苷酸，且獲得由于結(jié)合而出現(xiàn)的電性變化。

根據(jù)本發(fā)明的樣品衍生自天然存在的來源或衍生自人工操縱。優(yōu)選地，樣品衍生自天然存在的來源，如提取物、體液、組織生檢、液體生檢或細(xì)胞培養(yǎng)物。在另一方面中，樣品根據(jù)檢測的反應(yīng)處理。舉例來說，可以調(diào)節(jié)樣品的pH值或離子強(qiáng)度。

優(yōu)選地，由靶寡核苷酸分子的單鏈和識別單鏈寡核苷酸分子形成的雙螺旋包含凸出部分且甲基化胞嘧啶核苷酸安置于凸出部分中。識別單鏈寡核苷酸分子的序列優(yōu)選地經(jīng)設(shè)計(jì)以與靶寡核苷酸分子的單鏈形成凸出部分。凸出部分允許甲基化胞嘧啶核苷酸很好地呈現(xiàn)于雙螺旋的三維結(jié)構(gòu)中的帶電甲基化檢測分子。

根據(jù)本發(fā)明的識別單鏈寡核苷酸分子可呈現(xiàn)于溶液中或附接到固體表面。優(yōu)選地，識別單鏈寡核苷酸分子附接到固體表面或識別單鏈寡核苷酸分子與固體表面間隔開一定距離。

如本文所使用，術(shù)語“固體表面”是指固體載體，包括(但不限于)聚合物、紙、織物或玻璃。優(yōu)選地，采用的固體表面取決于電性變化檢測元件而變化。舉例來說，當(dāng)方法采用場效應(yīng)晶體管檢測電性變化時(shí)，固體表面為場效應(yīng)晶體管的晶體管表面；當(dāng)方法采用表面等離子體共振時(shí)，固體表面為表面等離子體共振的金屬表面。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，固體表面的材料為硅；優(yōu)選地多晶硅或單晶硅；更優(yōu)選地多晶硅。多晶硅比單晶硅更便宜，但由于多晶具有更多晶界，通常在晶界中出現(xiàn)阻礙電子轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺陷。此類現(xiàn)象使得固體表面不均勻并且難以定量。此外，離子可能穿透到多晶的晶界中且引起溶液中的檢測失效。另外，多晶硅在空氣中不穩(wěn)定。然而，上述缺點(diǎn)將不干擾根據(jù)本發(fā)明的方法的功能。

附接識別單鏈寡核苷酸分子與固體表面的方式取決于固體表面的材料和識別單鏈寡核苷酸分子的類型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，識別單鏈寡核苷酸分子經(jīng)由共價(jià)鍵連接到固體表面。共價(jià)鍵的實(shí)例包括(但不限于)以下方法，其取決于固體表面化學(xué)性質(zhì)和寡核苷酸的修飾。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)氧化硅用作固體表面時(shí)，固體表面通過使用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)修飾。APTES的分子中的硅原子進(jìn)行與羥基的氧原子的共價(jià)結(jié)合且其將表面的硅烷醇基團(tuán)(SiOH)轉(zhuǎn)化為胺；接著識別單鏈寡核苷酸分子的5'-氨基通過戊二醛與固體表面胺基共價(jià)結(jié)合(羅伊以利拿單(Roey Elnathan),莫里亞奎亞特(Moria Kwiat),亞歷山大佩夫茲納(Alexander Pevzner),約尼恩格爾(Yoni Engel),拉里薩伯斯坦(Larisa Burstein)阿爾蒂姆卡其托林茨(Artium Khatchtourints),阿米爾利希滕斯坦(Amir Lichtenstein),賴莎坎塔艾夫(Raisa Kantaev)和費(fèi)爾南多帕托斯基(Fernando Patolsky),生物識別層工程改造：克服基于納米線的FET裝置的篩選限度(Biorecognition Layer Engineering:Overcoming Screening Limitations of Nanowire-Based FET Devices),納米快報(bào)(Nano letters),2012,12,5245-5254)。在本發(fā)明的另一實(shí)施例中，固體表面修飾為自組裝單層分子，所述分子具有用于通過各種化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵聯(lián)到識別單鏈寡核苷酸分子的不同官能團(tuán)的不同官能團(tuán)(斯里瓦塔薩文卡塔蘇巴勞(Srivatsa Venkatasubbarao),微陣列狀態(tài)和展望(Microarrays-status and prospects),生物技術(shù)趨勢(TRENDS in Biotechnology)第22卷第12號2004年12月；金蘇文(Ki Su Kim)、李炫升(Hyun-Seung Lee)、楊鄭安(Jeong-A Yang)、喬孟何(Moon-Ho Jo)和韓四光(Sei Kwang Hahn)，適體官能化Si-納米線FET生物傳感器的制造、表征和應(yīng)用(The fabrication,characterization and application of aptamer-functionalized Si-nanowire FET biosensors),納米技術(shù)(Nanotechnology)20(2009))。

在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，識別單鏈寡核苷酸分子與固體表面間隔開一定距離。由于電性變化檢測元件應(yīng)用于檢測由帶電甲基化檢測分子與靶寡核苷酸分子的結(jié)合所致的電性變化，識別單鏈寡核苷酸分子不必直接結(jié)合到固體表面，其條件是識別單鏈寡核苷酸分子與固體表面之間的距離足夠短以允許電性變化檢測元件檢測電性變化。優(yōu)選地，固體表面與識別單鏈寡核苷酸分子之間的距離為約0到約10nm；更優(yōu)選約0到約5nm。

優(yōu)選地，固體表面與電性變化檢測元件耦接以檢測電性變化。

根據(jù)本發(fā)明，自由形式的帶電甲基化檢測分子優(yōu)選地在檢測電性變化之前去除，進(jìn)而避免通過由自由形式的帶電甲基化檢測分子攜帶的電荷產(chǎn)生的噪音。去除方式包括(但不限于)洗滌。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，方法用于檢測靶寡核苷酸分子的甲基化位置。通過將識別單鏈寡核苷酸分子附著于固體表面上，雙螺旋的不同位置中出現(xiàn)的電性變化能夠彼此區(qū)分。舉例來說，當(dāng)帶電甲基化檢測分子結(jié)合到接近固體表面安置的甲基化胞嘧啶核苷酸時(shí)，通過與固體表面耦接的電性變化檢測元件檢測到較強(qiáng)電信號，因?yàn)橥ㄟ^帶電甲基化檢測分子引入的電荷接近電性變化檢測元件安置。另一方面，當(dāng)帶電甲基化檢測分子結(jié)合到遠(yuǎn)離固體表面安置的甲基化胞嘧啶核苷酸時(shí)，通過與固體表面耦接的電性變化檢測元件檢測到較弱電信號，因?yàn)橥ㄟ^帶電甲基化檢測分子引入的電荷遠(yuǎn)離電性變化檢測元件安置。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，方法用于檢測靶寡核苷酸分子的甲基化數(shù)目或百分比。通過將識別單鏈寡核苷酸分子附著于固體表面上，由于雙螺旋的不同甲基化胞嘧啶核苷酸數(shù)目而出現(xiàn)的電性變化能夠彼此區(qū)分。舉例來說，當(dāng)較多帶電甲基化檢測分子結(jié)合到具有較多甲基化胞嘧啶核苷酸的靶寡核苷酸分子時(shí)，通過與固體表面耦接的電性變化檢測元件檢測到較強(qiáng)電信號，因?yàn)橥ㄟ^帶電甲基化檢測分子引入更多電荷。另一方面，當(dāng)較少帶電甲基化檢測分子結(jié)合到具有較少甲基化胞嘧啶核苷酸的靶寡核苷酸分子時(shí)，通過與固體表面耦接的電性變化檢測元件檢測到較弱電信號，因?yàn)橥ㄟ^帶電甲基化檢測分子引入較少電荷。

參看圖1，說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。在步驟1中，識別單鏈寡核苷酸分子附接到固體表面。在步驟2中，通過識別單鏈寡核苷酸分子捕獲靶寡核苷酸分子以根據(jù)堿基互補(bǔ)性形成雙螺旋。在步驟3中，帶電甲基化檢測分子應(yīng)用于接觸雙螺旋。在步驟4中，由于靶寡核苷酸分子包含至少一個(gè)甲基化胞嘧啶核苷酸，帶電甲基化檢測分子結(jié)合到至少一個(gè)甲基化胞嘧啶核苷酸，且由于帶電甲基化檢測分子與靶寡核苷酸分子的結(jié)合而出現(xiàn)電性變化。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，識別單鏈寡核苷酸分子為包含至少一個(gè)電中性核苷酸和至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸的部分中性單鏈寡核苷酸。使核苷酸呈電中性的方式不受限制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，電中性核苷酸包含經(jīng)烷基取代的磷酸酯基。優(yōu)選地，烷基是C₁-C₆烷基；更優(yōu)選地，烷基是C₁-C₃烷基。C₁-C₃烷基的實(shí)例包括(但不限于)甲基、乙基和丙基。圖2顯示根據(jù)本發(fā)明的電中性核苷酸的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例。磷酸酯基中的帶負(fù)電氧原子改變?yōu)椴痪哂须姾傻闹行栽?。用烷基取代磷酸酯基的方式可以根?jù)普通化學(xué)反應(yīng)應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的帶負(fù)電核苷酸包含具有至少一個(gè)負(fù)電荷的磷酸酯基。未經(jīng)修飾的核苷酸優(yōu)選地為不具有修飾或取代的天然存在的核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，帶負(fù)電核苷酸包含未經(jīng)取代的磷酸酯基。

根據(jù)本發(fā)明的部分中性單鏈寡核苷酸被部分賦予電中性。序列或長度不受限制，并且部分中性單鏈寡核苷酸的序列或長度可根據(jù)靶分子，基于本發(fā)明的公開內(nèi)容進(jìn)行設(shè)計(jì)。

電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的數(shù)目取決于部分中性單鏈寡核苷酸的序列和雙螺旋形成的條件。電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的位置也取決于部分中性單鏈寡核苷酸的序列和雙螺旋形成的條件?？筛鶕?jù)可用信息，基于本發(fā)明的公開內(nèi)容，設(shè)計(jì)電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的數(shù)目和位置。舉例來說，可通過基于雙鏈(ds)結(jié)構(gòu)能量的分子建模計(jì)算設(shè)計(jì)電中性核苷酸的數(shù)目和位置，并且可接著參考結(jié)構(gòu)能量測定dsDNA/DNA或dsDNA/RNA的熔融溫度(Tm)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，部分中性單鏈寡核苷酸包含多個(gè)電中性核苷酸，并且至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸安置在兩個(gè)電中性核苷酸之間；更優(yōu)選地，至少兩個(gè)帶負(fù)電核苷酸安置在兩個(gè)電中性核苷酸之間。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，當(dāng)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的部分中性單鏈寡核苷酸時(shí)，至少一個(gè)電中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸附近；更優(yōu)選地，2、3、4或5個(gè)電中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸附近。在另一方面中，至少一個(gè)電中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸的下游或上游位點(diǎn)；優(yōu)選地，至少一個(gè)電中性核苷酸安置在甲基化胞嘧啶核苷酸的下游和上游位點(diǎn)。

通過引入電中性核苷酸，相比于常規(guī)DNA探針，根據(jù)本發(fā)明的部分中性單鏈寡核苷酸的完美匹配雙鏈寡核苷酸與不匹配雙鏈寡核苷酸之間的熔融溫度差異更高。不受理論限制，可推測，兩條鏈之間的靜電排斥力通過引入中性寡核苷酸而減小，并且熔融溫度從而升高。通過控制電中性核苷酸的數(shù)目和位置，將熔融溫度差值調(diào)節(jié)到所需點(diǎn)，提供較好工作溫度或溫度范圍以區(qū)分完美和不匹配寡核苷酸，從而改進(jìn)捕獲特異性。此類設(shè)計(jì)有益于整合到一個(gè)芯片或陣列中的不同部分中性單鏈寡核苷酸的熔融溫度的一致性。待檢測反應(yīng)的數(shù)目可以隨著較高特異性而顯著升高，并且更多檢測單元可并入到單一檢測系統(tǒng)中。所述設(shè)計(jì)提供較好微陣列操作條件。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，部分中性單鏈寡核苷酸包含連接到固體表面的第一部分；第一部分的長度是部分中性單鏈寡核苷酸的總長度的約50％；并且第一部分包含至少一個(gè)電中性核苷酸和至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸；更優(yōu)選地，第一部分的長度是部分中性單鏈寡核苷酸的總長度的約40％；更優(yōu)選地，第一部分的長度是部分中性單鏈寡核苷酸的總長度的約30％。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，部分單鏈核苷酸進(jìn)一步包含與第一部分鄰接的第二部分。第二部分位于固體表面的遠(yuǎn)端。第二部分包含至少一個(gè)電中性核苷酸和至少一個(gè)帶負(fù)電核苷酸。電中性核苷酸和帶負(fù)電核苷酸的描述與第一部分的描述相同并且在本文中不再重復(fù)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，另外提供信號放大器以增強(qiáng)電性變化的檢測。根據(jù)本發(fā)明的信號放大器優(yōu)選是指增強(qiáng)固體表面的電壓變化的檢測的組件。舉例來說，信號放大器可為附接到識別單鏈寡核苷酸分子的一端的納米金粒子。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在具有低于約50mM；更優(yōu)選地低于約40mM、30mM、20mM或10mM的離子強(qiáng)度的緩沖液中進(jìn)行所述方法。不受理論限制，推測通過應(yīng)用部分中性單鏈寡核苷酸，部分中性單鏈寡核苷酸與靶分子之間的形成的雙螺旋可在不需要抑制部分帶電半中性單鏈寡核苷酸與其靶標(biāo)之間的靜電排斥力的情況下發(fā)生。接著通過每條鏈的堿基配對和堆疊力驅(qū)動雜交。因此，可在較低鹽條件下形成雙螺旋。在FET的情況下，較低離子強(qiáng)度增加檢測長度(德拜長度)，并且轉(zhuǎn)而增強(qiáng)檢測靈敏度。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，相比于常規(guī)檢測，主要在FET檢測的兩個(gè)方面中可見形成雙螺旋的改進(jìn)的雜交特異性。第一，熔融溫度差異較高。第二，緩沖液具有較低鹽條件，并且FET檢測長度(德拜長度)增加。這些差異均導(dǎo)致檢測靈敏度的改進(jìn)。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，若干識別單鏈寡核苷酸分子包含于一個(gè)系統(tǒng)中以在一個(gè)操縱中進(jìn)行若干檢測。舉例來說，多個(gè)識別單鏈寡核苷酸分子可并入檢測系統(tǒng)中。優(yōu)選地，檢測系統(tǒng)是微陣列或芯片。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，方法包含以下步驟：

(a)提供

靶寡核苷酸分子的單鏈；

識別單鏈寡核苷酸分子；

具有無甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列的參考單鏈寡核苷酸分子；和

帶電甲基化檢測分子；

(b)分別用識別單鏈寡核苷酸分子捕獲靶寡核苷酸分子的單鏈以形成靶雙螺旋，且用識別單鏈寡核苷酸分子捕獲參考單鏈寡核苷酸分子以形成參考雙螺旋；

(c)分別使帶電甲基化檢測分子與靶雙螺旋接觸以形成靶復(fù)合物，且使帶電甲基化檢測分子與參考雙螺旋接觸；且去除自由形式的帶電甲基化檢測分子；且

(d)監(jiān)測靶復(fù)合物與參考雙螺旋之間的電性變化。

如本文所用，術(shù)語“參考單鏈寡核苷酸分子”是指具有無甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列，提供不具有甲基化的背景的寡核苷酸分子。優(yōu)選地，參考單鏈寡核苷酸分子具有與除了甲基化胞嘧啶核苷酸的靶寡核苷酸分子相同的結(jié)構(gòu)。在另一方面中，參考單鏈寡核苷酸分子和靶寡核苷酸分子均通過識別單鏈寡核苷酸分子捕獲，且同時(shí)進(jìn)行步驟(b)到(d)中與參考單鏈寡核苷酸分子和靶寡核苷酸分子相關(guān)的操縱。

優(yōu)選地，形成靶雙螺旋和參考雙螺旋的條件相同。在另一方面中，形成靶復(fù)合物與參考復(fù)合物的條件相同。

靶復(fù)合物與參考雙螺旋之間的電性變化表示由于帶電甲基化檢測分子和靶寡核苷酸分子的結(jié)合而出現(xiàn)的電性變化。

本發(fā)明還提供一種檢測靶寡核苷酸分子的甲基化的試劑盒，其包含：

具有與甲基化胞嘧啶核苷酸的親和力的帶電甲基化檢測分子；和

用于檢測電性變化的電性變化檢測元件。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包含如上所述的識別單鏈寡核苷酸分子。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包含如上所述的信號放大器。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒進(jìn)一步包含具有無如上所述的甲基化胞嘧啶核苷酸的靶序列的參考單鏈寡核苷酸分子。

提供以下實(shí)例來幫助所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。

實(shí)例

合成作為識別單鏈寡核苷酸分子的部分中性單鏈寡核苷酸：

脫氧胞嘧啶核苷(n-ac)對甲氧基亞磷酰胺、胸苷對甲氧基亞磷酰胺、脫氧鳥苷(n-ibu)對甲氧基亞磷酰胺和脫氧腺苷(n-bz)對甲氧基亞磷酰胺(全部購自美國化學(xué)基因公司(ChemGenes Corporation,USA))用于根據(jù)基于固相磷酸三酯合成的給定順序或通過應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)3900高通量DNA合成器(由Biosci&Tech或使命生物技術(shù)(Mission Biotech)提供)合成寡核苷酸。

合成的寡核苷酸以弱堿性在甲苯中在室溫下反應(yīng)24小時(shí)，且樣品經(jīng)受離子交換色譜以將pH值調(diào)節(jié)到7。在樣品經(jīng)濃縮和干燥之后，獲得部分中性單鏈寡核苷酸。

識別單鏈寡核苷酸分子附接：

通過Si-納米線(SiNW)表面層(SiO₂)的功能化進(jìn)行識別單鏈寡核苷酸分子附接。首先，使用(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)來修飾表面。APTES分子中的硅原子進(jìn)行與羥基的氧的共價(jià)結(jié)合并且將表面的硅烷醇基團(tuán)(SiOH)轉(zhuǎn)化成胺。將樣品浸沒于2％APTES(99％EtOH)中30分鐘，并且接著加熱到120℃后維持10分鐘。在此步驟完成之后，氨基(NH₂)為相對于表面的終端單元。

隨后，戊二醛用作DNA附接的接枝劑。戊二醛結(jié)合經(jīng)由其醛基(COH)實(shí)現(xiàn)以確保與APTES的氨基的共價(jià)結(jié)合。對于這一步驟，在室溫下將樣品浸沒于12.5％戊二醛液體(10mM磷酸鈉緩沖液)中1小時(shí)。

識別單鏈寡核苷酸分子與濃度為1μM的雙-三丙烷緩沖液混合，且經(jīng)修飾SiNW表面另外浸沒于溶液中12小時(shí)。

捕獲靶寡核苷酸分子

識別單鏈寡核苷酸分子(探針)的序列和靶寡核苷酸分子(標(biāo)靶)在表1中列出。

表1：

C_me：甲基化胞嘧啶核苷酸

實(shí)例1：檢測靶寡核苷酸分子的甲基化位置

靶寡核苷酸分子為SEPT9甲基DNA標(biāo)靶1(C5)、SEPT9甲基DNA標(biāo)靶1(C14)和SEPT9甲基DNA標(biāo)靶1(C26)，其分別在位置5、14和26處具有甲基化胞嘧啶核苷酸。

靶寡核苷酸分子與濃度為100pM的雙-三丙烷緩沖液混合，且通過附接到SiNW的SEPT9DNA探針1捕獲30分鐘以形成雙螺旋。

將作為帶電甲基化檢測分子的抗5mC抗體(0.25μg/mL)引入到雙螺旋以反應(yīng)30分鐘。

結(jié)果顯示于圖3到7中。

圖3顯示分析物處理下的pSNWFET的電信號?！啊觥本€示出用10mM pH＝7雙-三丙烷緩沖液處理所謂pSNWFET所謂I_d-V_g曲線。在pSNWFET用互補(bǔ)DNA處理之后，DNA受損緩沖液經(jīng)相同雙-三丙烷緩沖液替換。隨后，電信號檢測經(jīng)處理且得出為“●”線。最后，注射包含抗甲基胞嘧啶抗體的緩沖液且在納米線上培育。雙-三丙烷緩沖液替換之后為培育，且電信號顯示為“▲”線。進(jìn)行不同甲基胞嘧啶位點(diǎn)的類似檢測且結(jié)果顯示于圖4和圖5中。通過靶DNA和抗甲基胞嘧啶抗體誘導(dǎo)的平均ΔV_th顯示于圖6中。以下方程式用于標(biāo)準(zhǔn)化通過抗體誘導(dǎo)的電信號：

圖7顯示抗體與靶DNA的標(biāo)準(zhǔn)化比率結(jié)果，其顯著表明根據(jù)本發(fā)明的方法用于檢測靶寡核苷酸分子的甲基化位置。

實(shí)例2：檢測靶寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸數(shù)目

靶寡核苷酸分子為SEPT9甲基DNA標(biāo)靶4(C2)、SEPT9甲基DNA標(biāo)靶5(C2+C16)和SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6(C2+C16+C32)，其分別具有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)甲基化胞嘧啶核苷酸。

靶寡核苷酸分子與濃度為100pM的雙-三丙烷緩沖液混合，且通過附接到SiNW的SEPT9DNA探針1捕獲30分鐘以形成雙螺旋。

將作為帶電甲基化檢測分子的抗5mC抗體(0.25μg/mL)引入到雙螺旋以反應(yīng)30分鐘。

結(jié)果顯示于圖8到10中。

靶寡核苷酸分子用不同數(shù)目的甲基胞嘧啶合成，其提供不同數(shù)目的抗體結(jié)合位點(diǎn)。圖8顯示SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6的檢測結(jié)果。作為距離效應(yīng)的驗(yàn)證，在雙-三丙烷緩沖液，含有DNA標(biāo)靶和抗甲基胞嘧啶抗體的緩沖液的條件下檢測I_d-V_g曲線。圖9表明分別通過靶DNA和抗體誘導(dǎo)的3次閾值電壓位移的平均值。圖10顯示來自圖9的閾值電壓位移的標(biāo)準(zhǔn)化，且其明顯地指示甲基胞嘧啶數(shù)目與電壓位移具有正相關(guān)。

實(shí)例3：檢測靶寡核苷酸分子中的單鏈尾上的甲基化胞嘧啶核苷酸

靶寡核苷酸分子為SEPT9甲基DNA標(biāo)靶7(C39)。

靶寡核苷酸分子與濃度為100pM的雙-三丙烷緩沖液混合，且通過附接到SiNW的SEPT9DNA探針2捕獲30分鐘以形成雙螺旋。

將作為帶電甲基化檢測分子的抗5mC抗體(1μg/mL)引入到雙螺旋以反應(yīng)30分鐘。

結(jié)果顯示于圖11中。所述圖表明安置于由SEPT9DNA探針2與SEPT9甲基DNA標(biāo)靶7形成的雙螺旋的單鏈尾上的甲基化胞嘧啶將檢測極限增加到1ng/ml抗甲基胞嘧啶抗體。

實(shí)例4：檢測具有N-DNA的靶寡核苷酸分子中的甲基化胞嘧啶核苷酸

靶寡核苷酸分子為SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6(C2,16,32)。

靶寡核苷酸分子與濃度為100pM的雙-三丙烷緩沖液混合，且通過附接到SiNW的SEPT9N-DNA探針捕獲30分鐘以形成雙螺旋。

將作為帶電甲基化檢測分子的抗5mC抗體(0.1μg/mL)引入到雙螺旋以反應(yīng)30分鐘。

結(jié)果顯示于圖12中。所述圖表明安置于由SEPT9DNA探針2與SEPT9甲基DNA標(biāo)靶7形成的雙螺旋的單鏈尾上的甲基化胞嘧啶將檢測極限增加到1ng/ml抗甲基胞嘧啶抗體。

圖12顯示與SEPT9甲基DNA標(biāo)靶6(C2,C16,C32)和抗體結(jié)合的部分中性單鏈寡核苷酸(N-DNA)探針的I_d-V_g曲線。相比于圖8，其顯示N-DNA在靈敏度中具有改進(jìn)的效應(yīng)。

盡管已結(jié)合上文闡述的特定實(shí)施例描述本發(fā)明，對于其的許多替代方案和其修飾和變化將對所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。所有此類替代方案、修改和變化被視為落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。