本發(fā)明涉及微生物檢測領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種細菌性陰道炎的檢測方法，更具體的，涉及采用LAMP檢測試劑盒對細菌性陰道炎進行檢測的方法。
背景技術：
細菌性陰道炎(bacterial vaginosis，簡稱BV)是一種常見的、復雜的、以正常的陰道菌群改變?yōu)樘卣鞯呐R床癥候群，它可引起嚴重的并發(fā)癥，包括子宮頸炎、子宮內膜炎，也使患者增加感染HIV病毒和早產(chǎn)的風險。以前由于對其認識有限，曾報道過很多名稱，如非特異性陰道炎、加德納菌性陰道炎、陰道嗜血桿菌性陰道炎等。1984年，瑞典專題國際學術會議將其正式命名為細菌性陰道病。BV是育齡婦女最常見的陰道感染性疾病，在婦科門診中的患病率為18.63％～20％?；颊叱惺芫薮蟮膫€人痛苦，家庭社會經(jīng)濟負擔沉重。
陰道加德納菌(Gardnerella Vaginalis)在BV的微生物菌群中占絕對優(yōu)勢，含量明顯高于其它非正常菌群，是BV的感染原。最新報道陰道加德納菌能明顯刺激HIV病毒在單核-巨噬細胞系統(tǒng)和T淋巴細胞中的表達，與HIV的傳播率增高有關。因此，檢驗受試者樣品中陰道加德納菌是否存在，對于BV的早診、早治及預防至關重要。
目前對陰道加德納菌的實驗室診斷主要有直接涂片法、革蘭氏染色法、分離培養(yǎng)法、免疫熒光法等。而以核酸擴增技術為代表的分子生物學檢測方法也逐漸開始應用于陰道加德納菌的檢測和BV診斷中。其中，環(huán)介導恒溫核酸擴增技術(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)是近些年發(fā)展起來的一種新型的核酸擴增方法(見文獻Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12)：E63.)，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下恒溫擴增，快速實現(xiàn)大量拷貝數(shù)的核酸擴增。與變溫循環(huán)擴增技術相比，等溫擴增技術對儀器設備的需求較為簡化，同時因為反應不需要變性-復性過程，因而能有效縮短反應時間。上述特點使得LAMP技術能更好地滿足細菌性陰道炎門診檢驗以及應急或現(xiàn)場檢測對檢測方法的快速簡便性要求。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種采用LAMP檢測試劑盒對細菌性陰道炎進行檢測的方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，在一個方面中，本發(fā)明提供一種細菌性陰道炎LAMP檢測試劑盒，其包括針對陰道加德納菌保守區(qū)域設計的引物、反應緩沖液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核苷酸序列如下所示：
外引物F3：ATAGCTCTTGGAAACGGGTG(SEQ ID NO：1)
外引物B3：CGCAATATTCCCCACTGCTG(SEQ I D NO：2)
內引物FIP：ACCCCATCCCATGCCACTAAAC-AATGCTGGATGCTCCAACTT(SEQ ID NO：3)
內引物BIP：ACCTAGGCTTCGACGGGTAGC-TGGGCCGTATCTCAGTCC(SEQ ID NO：4)。
優(yōu)選地，所述外引物F3和所述外引物B3的濃度均為5pmol/μl，所述內引物FIP和所述內引物BIP的濃度均為40pmol/μl。
優(yōu)選地，所述反應緩沖液由10mM dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、50mM MgSO4和5mM甜菜堿組成。
優(yōu)選地，所述Bst DNA聚合酶的濃度為8U/μl。
優(yōu)選地，所述核酸染料為1000×SYBR Green I。
優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒進一步包括DNA提取試劑以及陽性對照和陰性對照。
優(yōu)選地，所述DNA提取試劑是CTAB抽提緩沖液，其由100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巰基乙醇、2％CTAB組成，pH 7.0-7.5。
在另一個方面中，本發(fā)明還提供一種采用上述的LAMP檢測試劑盒對細菌性陰道炎進行檢測的方法，其包括以下步驟：
(1)提取待測樣品DNA：向待測樣品中加入CTAB抽提緩沖液，按照常規(guī)CTAB法提取DNA；
(2)建立LAMP反應體系：在PCR管中制備25μl反應體系，其包括5pmol/μl的外引物F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的內引物FIP 1μl、40pmol/μl的內引物BIP 1μl、反應緩沖液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、模板DNA 2μl，加水補充至25μl，并以陰道加德納菌基因組DNA作為陽性對照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對照；
(3)LAMP反應：將步驟(2)中的PCR管于63℃恒溫反應60min；
(4)分析判斷反應產(chǎn)物結果：在(3)中所得反應產(chǎn)物中加入1μl核酸染料，如反應液顏色為橙色，表示結果為陰性，如反應液顏色為綠色，表示結果為陽性。
在另一個方面中，本發(fā)明還提供了引物在制備細菌性陰道炎LAMP試劑盒中的應用，其中所述引物針對陰道加德納菌保守區(qū)域設計，核苷酸序列如下所示：
外引物F3：ATAGCTCTTGGAAACGGGTG(SEQ ID NO：1)
外引物B3：CGCAATATTCCCCACTGCTG(SEQ ID NO：2)
內引物FIP：ACCCCATCCCATGCCACTAAAC-AATGCTGGATGCTCCAACTT(SEQ ID NO：3)
內引物BIP：ACCTAGGCTTCGACGGGTAGC-TGGGCCGTATCTCAGTCC(SEQ ID NO：4)。
本發(fā)明的細菌性陰道炎LAMP檢測試劑盒及檢測方法具有以下有益效果：
1、高特異性：根據(jù)陰道加德納菌基因的保守區(qū)設計四條特異性引物，通過環(huán)介導恒溫擴增反應判斷靶標物質的存在與否，假陽性率低；
2、耗時短：擴增在30-60min內即可完成，快速、高效且產(chǎn)率高；
3、靈敏度高：在復雜體系中可檢測到單個細胞的靶目標，最低檢測極限達到1pg DNA，標本的檢出率達到98％以上；
4、鑒定簡便：通過肉眼觀察顏色變化即可判定結果，無需高端的儀器設備以及繁鎖的電泳和紫外觀察等步驟。
【具體實施方式】
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1本發(fā)明的細菌性陰道炎LAMP檢測試劑盒的制備
1.1試劑
引物由天根生化科技(北京)有限公司合成；Bst DNA聚合酶和10×ThermoPol反應緩沖液購自NEB；SYBR Green I購自Invitrogen；其余PCR試劑和配制CTAB抽提緩沖液所需的試劑購自Sigma。
1.2試劑盒的制備：
獲得以下試劑，以制備本發(fā)明的細菌性陰道炎LAMP檢測試劑盒：
CTAB抽提緩沖液：按照以下配方配制：100mM Tris-HCl pH 8.0、50mM EDTA、1M NaCl、1％(v/v)β-巰基乙醇、2％CTAB，調整pH值至7.0-7.5；
反應緩沖液：按照以下配方配制：10mM dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、50mM MgSO4、5mM甜菜堿；
引物：外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：I所示；外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；內引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，內引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。其中外引物F3和外引物B3的濃度為5pmol/μl，內引物FIP和內引物BIP的濃度為40pmol/μl。
濃度為8U/μl的Bst DNA聚合酶；
核酸染料：1000×SYBR Green I；
陽性對照：陰道加德納菌基因組DNA；
陰性對照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
實施例2
陰道加德納菌特異性檢測
2.1 LAMP特異性檢測
待測菌株包括從BV患者陰道分泌物中分離得到的陰道加德納菌，以及消化鏈球菌、紫單胞菌和嗜血桿菌各1株。
使用實施例1制備的試劑盒按照以下步驟對陰道加德納菌進行檢測：
(1)提取待測樣品DNA：將待測菌株接種于PDA平板上，劃線培養(yǎng)后，收集并離心，加入50μl CTAB抽提緩沖液，按照常規(guī)CTAB法提取DNA；
(2)建立LAMP反應體系：在PCR管中制備25μl反應體系，其中四種引物各1μl、反應緩沖液2.5μl、8U/μl的Bst DNA聚合酶1μl、步驟(1)所得模板DNA 2μl，加水補充至25μl，并以陰道加德納菌基因組DNA作為陽性對照，以100mM Tris-HCl pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對照；
(3)LAMP反應：將步驟(2)中PCR管于63℃恒溫反應60min；
(4)分析判斷反應產(chǎn)物結果：在(3)中所得反應產(chǎn)物中加入1μl1000×SYBR Green I，如反應液顏色為橙色，表示結果為陰性，如反應液顏色為綠色，表示結果為陽性。
2.2檢測結果
陰道加德納菌的PCR管中均呈現(xiàn)綠色，而其作菌株的顯色結果均為橙色，表明引物具有很強的特異性。
實施例3陰道加德納菌靈敏度檢測
3.1 LAMP靈敏度檢測
按照實施例2的步驟(1)提取陰道加德納菌DNA，并以10倍濃度系列稀釋法稀釋成100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg共7個梯度。
LAMP反應體系和反應條件以及結果分析同實施例2的步驟(2)-(4)。
3.2檢測結果
除了DNA濃度為100fg的PCR管顯示橙色之外，其余濃度的PCR管中均呈現(xiàn)綠色，表明本發(fā)明的檢測方法的最低檢測極限達到1pg DNA，靈敏度很高。