一種利用qRT-PCR鑒定啤酒大麥Gairdner品種純度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用qRT-PCR鑒定啤酒大麥Gairdner品種純度的方法，屬于制麥 和啤酒釀造領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 啤酒大麥?zhǔn)鞘瞧【粕a(chǎn)的主要原料，其品質(zhì)優(yōu)劣是決定啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵。啤酒大 麥品種不同，大麥籽粒的飽滿度和粗蛋白含量及麥芽的品質(zhì)如水分、浸出物、色度、總蛋白 及可溶性氮含量等指標(biāo)也有所差異，最終也影響著成品啤酒的泡持性、濁度、成熟度和風(fēng)味 等質(zhì)量指標(biāo)。除了遺傳特性之外，啤酒大麥的釀造品質(zhì)也受環(huán)境因素和農(nóng)藝措施的影響，對(duì) 于某些品質(zhì)性狀，環(huán)境因子起著更大的決定作用。我國(guó)大麥主要產(chǎn)區(qū)相對(duì)集中，主要分布在 長(zhǎng)江流域、黃河流域和青藏高原，按釀造性能可將啤酒大麥產(chǎn)區(qū)分為三類：甘肅新疆產(chǎn)區(qū)， 東北產(chǎn)區(qū)和江浙產(chǎn)區(qū)。啤酒工業(yè)的發(fā)展促進(jìn)了對(duì)大麥原料的需求，其中西北和黑龍江等地 啤酒大麥發(fā)展較快。20世紀(jì)90年代，我國(guó)啤酒行業(yè)主要使用進(jìn)口啤酒大麥，隨著國(guó)際市場(chǎng) 的不穩(wěn)定和價(jià)格上升，進(jìn)入21世紀(jì)后，啤酒企業(yè)逐漸重視和使用國(guó)產(chǎn)啤酒大麥。盡管國(guó)內(nèi) 大麥產(chǎn)量不斷上升，但農(nóng)藝性狀優(yōu)良、適宜于釀造的啤酒大麥品系缺乏，在質(zhì)量上仍存在大 麥質(zhì)量指標(biāo)極差大、波動(dòng)大、對(duì)應(yīng)麥芽脆度低、微粉浸出物低，品質(zhì)均一"性差等質(zhì)量缺陷，大 部分只能做飼料用，而能用于啤酒行業(yè)的啤酒大麥只有150萬(wàn)噸左右。因此，每年需從澳大 利亞、加拿大、法國(guó)等歐洲國(guó)家進(jìn)口啤酒大麥，以滿足國(guó)內(nèi)啤酒行業(yè)發(fā)展的需要。
[0003] 由于進(jìn)口大麥品質(zhì)優(yōu)售價(jià)高，因而市場(chǎng)上常出現(xiàn)將混級(jí)大麥或國(guó)產(chǎn)質(zhì)量稍好的大 麥混入進(jìn)口一級(jí)大麥等以次充好的情況，這不僅造成了對(duì)外貿(mào)易或采購(gòu)的經(jīng)濟(jì)損失，更影 響了以此為原料釀造的啤酒的品質(zhì)，對(duì)生產(chǎn)周期、生產(chǎn)設(shè)備也可能造成一定影響，影響啤酒 行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。進(jìn)口大麥的品種和質(zhì)量直接關(guān)系到麥芽的制作和啤酒釀造的工藝，這就 要求檢驗(yàn)檢疫部門能夠準(zhǔn)確地對(duì)進(jìn)口大麥的品種和品種純度進(jìn)行鑒定。同時(shí)由于進(jìn)口啤酒 大麥成本高，國(guó)產(chǎn)啤酒大麥質(zhì)量日益完善，加上相關(guān)部門對(duì)其品種鑒定手段還不完善，使得 進(jìn)口啤酒大麥在品種真實(shí)性問(wèn)題上還存在一些挑戰(zhàn)。因此，有必要對(duì)進(jìn)口啤酒大麥進(jìn)行品 種純度及真實(shí)性鑒定。
[0004] 目前用于大麥品種鑒定的方法有感官評(píng)價(jià)法、物理化學(xué)法、DNA分子標(biāo)記法、同工 酶電泳法等，但這些鑒定方法只能對(duì)品種進(jìn)行判斷，無(wú)法鑒定大麥樣品的純度，此外在品種 判斷上也存在不確定性、假陽(yáng)性或成本高、操作難度大等缺點(diǎn)。普遍被認(rèn)可的方法是醇溶 蛋白SDS-PAGE電泳法，此方法可同時(shí)判斷大麥樣品的品種和純度，具有較高的準(zhǔn)確性，然 而，由于該方法需對(duì)大麥樣品進(jìn)行四分法取樣，將取樣得到的每一粒大麥種子的醇溶蛋白 進(jìn)行提取及SDS-PAGE電泳、染色、脫色及與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的比較后，才能判斷其品種及純度，工 作量大，耗時(shí)長(zhǎng)，因此存在一定的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)鑒 定啤酒大麥Gairdner品種純度的方法。本發(fā)明利用啤酒大麥Gairdner品種標(biāo)志蛋白BMAI-1(由基因IMAI-1編碼），通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)建立其相對(duì)表達(dá)量與 其純度的相關(guān)性曲線，并擬合線性方程，通過(guò)該相關(guān)性曲線檢測(cè)未知純度Gairdner大麥樣 品的純度。本發(fā)明方法檢測(cè)的未知Gairdner大麥樣品的純度與傳統(tǒng)SDS-PAGE方法檢測(cè)的 純度相差無(wú)幾，檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，工作量大大降低。同時(shí)，本發(fā)明適用于其它啤酒大麥品 種的純度鑒定。
[0006] 所述方法是針對(duì)Gairdner的品種標(biāo)志蛋白，利用qRT-PCR技術(shù)建立該標(biāo)志蛋白相 對(duì)表達(dá)量與Gairdner品種純度的相關(guān)性曲線，從而對(duì)Gairdner大麥樣品純度進(jìn)行定量檢 測(cè)。
[0007] 所述Gairdner的品種標(biāo)志蛋白為由基因IMAI-1編碼的α-淀粉酶抑制劑 ΒΜΑΙ-1〇
[0008] 所述qRT-PCR的引物為：標(biāo)志蛋白編碼基因IMAI-1特異引物如SEQIDN0:1和 SEQIDN0:2所示，內(nèi)參基因?yàn)锳CTIN。
[0009] 所述內(nèi)參基因的特異引物如SEQIDN0:3和SEQIDN0:4所示。
[0010] 所述相關(guān)性曲線為y= 〇. 〇129x-〇. 2748(R2= 0. 972)，其中y為樣品中標(biāo)志蛋白 編碼基因IMAI-1相對(duì)于純Gairdner大麥的IMAI-1基因的相對(duì)表達(dá)量，X為Gairdner大 麥樣品純度。
[0011] 所述方法是對(duì)未知Gairdner大麥樣品進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，通過(guò)標(biāo)志蛋白的相對(duì)表 達(dá)量和相關(guān)性曲線，計(jì)算未知樣品中Gairdner大麥的純度。
[0012] 所述方法是：（1)人工制備不同純度Gairdner啤酒大麥樣品；（2)提取不同純度 Gairdner啤酒大麥樣品的總RNA;(3)根據(jù)標(biāo)志蛋白編碼基因IMAI-1設(shè)計(jì)如SEQIDN0:1 和SEQIDN0:2所示的特異引物，以肌動(dòng)蛋白actin編碼基因ACTIN為內(nèi)參基因，分別進(jìn)行 qRT-PCR，獲得標(biāo)志蛋白基因及內(nèi)參基因的Ct值，以2 & ^表示標(biāo)志蛋白基因的相對(duì)表達(dá) 倍數(shù)；(4)以樣品純度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)志蛋白基因相對(duì)表達(dá)量即2 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)志 蛋白基因相對(duì)表達(dá)量與大麥樣品純度的擬合線性方程；(5)對(duì)任一未知大麥樣品，提取總RNA，然后使用步驟3的方法進(jìn)行qRT-PCR得到未知樣品中標(biāo)志蛋白基因相對(duì)表達(dá)量y，將y 代入擬合線性方程，即得未知樣品中Gairdner大麥的純度X。
[0013] 所述方法，具體由以下步驟組成：
[0014] (1)收集目前普遍采用的啤酒大麥樣品（包括含Gairdner在內(nèi)的6種澳大利亞啤 酒大麥及4種國(guó)產(chǎn)啤酒大麥），根據(jù)溶解性差別，分別進(jìn)行分級(jí)提取種子醇溶蛋白，經(jīng)過(guò)雙 向電泳分離，利用圖像分析軟件找到各品種的共同蛋白和差異蛋白，并對(duì)共同蛋白和差異 蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，不存在于共同蛋白中的差異蛋白即為Gairdner的特征蛋白或標(biāo)志蛋 白。
[0015] (2)通過(guò)人工混種，獲得一系列純度梯度（60% -100% )的Gairdner大麥樣品，分 別提取總RNA，根據(jù)其標(biāo)志蛋白編碼基因設(shè)計(jì)特異引物，以肌動(dòng)蛋白actin編碼基因ACTIN為內(nèi)參基因，分別進(jìn)行qRT-PCR，獲得標(biāo)志蛋白基因及內(nèi)參基因的Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒 光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），以2 表示標(biāo)志蛋白基因的相對(duì)表達(dá)倍數(shù) (ACt=Ct(標(biāo)志蛋白基因)_Ct(ACTIN)，ΔACt=ACt(某一純度)-ACt_%純度)），以樣品純度為橫坐標(biāo)， 以標(biāo)志蛋白基因相對(duì)表達(dá)量即2 縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)志蛋白基因相對(duì)表達(dá)量與其純度的 相關(guān)性曲線，并擬合線性方程。
[0016] (3)按步驟（2)的方法，分別提取純度為100 %的標(biāo)準(zhǔn)Gairdner樣品及待測(cè) Gairdner大麥樣品的mRNA，并進(jìn)行qRT-PCR，根據(jù)Ct值計(jì)算2Λ&(^并代入標(biāo)志蛋白基因相 對(duì)表達(dá)量與其純度的相關(guān)性曲線方程，即可計(jì)算出待測(cè)樣品的純度。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明方法與目前認(rèn)可的SDS-PAGE方法具有相同的準(zhǔn)確率， 但在操作上更簡(jiǎn)便快捷、檢測(cè)時(shí)間明顯縮短、工作量大大降低。利用本發(fā)明檢測(cè)啤酒大麥樣 品純度，具有良好的應(yīng)用前景。同時(shí)，本發(fā)明適用于其它啤酒大麥品種的純度鑒定。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為啤酒大麥醇溶蛋白分級(jí)提取流程；
[0019] 圖2為大麥醇溶蛋白的雙向電泳圖譜，a.Gairdner;b.Baudin;
[0020] 圖3為大麥醇溶蛋白的雙向電泳圖譜，c.Hindmarsh;d.Vlamingh;e.Commander； f.Schooner；
[0021] 圖4為大麥醇溶蛋白的雙向電泳圖譜，g.蘇啤3號(hào)；h.蘇啤6號(hào)；i墾啤7號(hào)；j 星啤10號(hào)；
[0022] 圖5為標(biāo)志蛋白相對(duì)表達(dá)量與Gairdner純度的相關(guān)性曲線；
[0023] 圖6為三個(gè)未知Gairdner樣品a,b，c各籽粒醇溶蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下實(shí)施例1~實(shí)施例3所涉及實(shí)