本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，并涉及一株高產(chǎn)天然食品防腐劑苯乳酸的葡糖醋桿菌（Gluconacetobactersp.）FBFS 97及其苯乳酸的制備方法。

背景技術(shù)：

食品防腐劑是指能防止由微生物引起的食物腐敗變質(zhì)，并延長(zhǎng)食品保質(zhì)期的食品添加劑。按生產(chǎn)方式其可被分為合成和天然的兩大類，其中合成食品防腐劑成本低、防腐效果好，但其安全性存在爭(zhēng)議，隨著人們生活水平的提高以及對(duì)食品安全性要求的提高，安全性較高的天然食品防腐劑的研發(fā)已成為研究熱點(diǎn)。而微生物來(lái)源的天然防腐劑則是天然食品防腐劑的重要來(lái)源。目前已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)的微生物來(lái)源的天然防腐劑主要包括乳酸鏈球菌素、納他霉素、ε - 聚賴氨酸和溶菌酶等，但這些防腐劑都存在抑菌譜窄、理化性質(zhì)差等缺點(diǎn)，如乳酸鏈球菌只能抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，納他霉素只對(duì)霉菌有抑制作用，ε - 聚賴氨酸和溶菌酶在偏堿性條件下易失活。

苯乳酸又名2-羥基-3-苯基丙酸，最早是由Dieulevenx等人于1998年從白地霉的代謝產(chǎn)物中分離得到的一種小分子防腐劑。具有親水性高，對(duì)酸、堿、熱穩(wěn)定性好，安全性高，抑菌譜寬等優(yōu)點(diǎn)。研究表明其對(duì)多種食源性致病菌，如單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157，以及黃曲霉、婁地青霉、赭曲霉等腐敗真菌都有較好的抑制作用。

目前苯乳酸的制備方法包括化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化兩種。其中化學(xué)方法存在技術(shù)路線復(fù)雜，環(huán)境污染大，副產(chǎn)物多，不易分離純化等缺點(diǎn)。故采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)苯乳酸一直是人們努力的方向。研究表明，白地霉、乳酸菌、丙酸菌都能轉(zhuǎn)化苯丙氨酸和苯丙酮酸產(chǎn)生苯乳酸，但其中苯丙氨酸的轉(zhuǎn)化率較低，而苯丙酮酸雖然轉(zhuǎn)化率高但其理化性質(zhì)不穩(wěn)定且成本較高，使得通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法來(lái)制備苯乳酸難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明從土壤中分離得到一株高產(chǎn)天然食品防腐劑苯乳酸的醋酸菌——葡糖醋桿菌（Gluconacetobactersp.）FBFS 97，并提供了從該菌發(fā)酵制備苯乳酸的方法，為以后苯乳酸工業(yè)化生產(chǎn)的微生物篩選拓展了范圍，相關(guān)的研究未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一株高產(chǎn)苯乳酸的葡糖醋桿菌（Gluconacetobactersp.）菌株FBFS 97，其保藏編號(hào)為：CCTCC M 2016388。

上述菌株由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離得到。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種從葡糖醋桿菌FBFS 97發(fā)酵液中制備苯乳酸的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：采用上述葡糖醋桿菌FBFS 97進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，獲得富含苯乳酸的發(fā)酵液，再通過(guò)萃取法得到苯乳酸。

上述方法中，所述發(fā)酵的條件為30 °C，160 r/min培養(yǎng)17 d。

上述方法中，添加苯丙氨酸的液態(tài)培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖100 mg/mL，酵母浸膏10 mg/mL，苯丙氨酸 1 mg/mL，以雙蒸水配制。

上述方法中，將2%（v/v）的葡糖醋桿菌FBFS 97種子液接入添加苯丙氨酸的培養(yǎng)基中。

上述方法中，葡糖醋桿菌FBFS 97種子液是取一環(huán)葡糖醋桿菌FBFS 97斜面的菌體接入種子培養(yǎng)基中，在30 °C，160 r/min培養(yǎng)24 h。

上述方法中，葡糖醋桿菌FBFS 97的種子液培養(yǎng)基如下：葡萄糖100 mg/mL，酵母浸膏10 mg/mL，以雙蒸水配制。葡糖醋桿菌FBFS 97的斜面培養(yǎng)基如下：葡萄糖100 mg/mL，酵母浸膏10 mg/mL，瓊脂15 mg/mL，碳酸鈣30 mg/mL，以雙蒸水配制。

上述方法中，發(fā)酵液中苯乳酸的萃取，包括如下步驟：先通過(guò)高速離心（10000 r/min, 10min）去除發(fā)酵液中的菌體，后用鹽酸（4 mol/L）將上清液的pH調(diào)到2.0，再用乙酸乙酯（乙酸乙酯:上清液= 3:1）萃取3次，最后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40 °C）去除乙酸乙酯，即得到苯乳酸產(chǎn)品。

上述菌株葡糖醋桿菌FBFS 97已于2016年7月11日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱為CCTCC，地址為：湖北省武漢市洪山區(qū)八一路），保藏編號(hào)為：CCTCC M 2016388，分類命名為葡糖醋桿菌（Gluconacetobactersp.）FBFS 97。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，葡糖醋桿菌FBFS 97能產(chǎn)苯乳酸，在不添加苯乳酸的培養(yǎng)液（配方同前述的種子液培養(yǎng)基）中30 °C，160 r/min發(fā)酵13 d，培養(yǎng)液中苯乳酸可達(dá)95.71 mg/L；在該培養(yǎng)基中添加1 mg/mL 苯丙氨酸后，同樣條件下，發(fā)酵17d，培養(yǎng)液中苯乳酸含量為412.05 mg/L，高于現(xiàn)有專利“一株產(chǎn)苯乳酸的菌株及該菌發(fā)酵法制備苯乳酸的方法”（公開(kāi)號(hào)：102604858A）報(bào)道中采用乳酸菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化苯丙氨酸產(chǎn)生的苯乳酸含量（242.36 mg/L）。

附圖說(shuō)明

圖1葡糖醋桿菌FBFS 97發(fā)酵液中苯乳酸含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化。

圖2葡萄醋桿菌FBFS 97發(fā)酵液中苯乳酸的高效液相色譜分析。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例為了便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均來(lái)自常規(guī)生化試劑商店。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中苯乳酸含量的影響：按說(shuō)明書(shū)所述方法，通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)葡萄醋桿菌FBFS 97發(fā)酵液在不同發(fā)酵時(shí)間下苯乳酸的含量，發(fā)現(xiàn)在不添加和添加苯丙氨酸的兩種條件下，發(fā)酵液中的苯乳酸含量皆隨發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行先升高后持平。在不添加苯丙氨酸的發(fā)酵液中，苯乳酸最高可達(dá)95.71 mg/L（發(fā)酵13d），在添加1 mg/mL 苯丙氨酸的發(fā)酵液中，苯乳酸最高可達(dá)412.05 mg/L（發(fā)酵17d）（圖1）。

上述實(shí)例中檢測(cè)發(fā)酵液中苯乳酸含量的高效液相色譜法包括如下步驟：發(fā)酵液先通過(guò)高速離心（10000 r/min, 10min）去除發(fā)酵液中的菌體，過(guò)0.22 μm膜后進(jìn)行高效液相色譜分析（圖2）。

上述高效液相色譜分析條件為：液相色譜Shimadzu LC-20AT，色譜柱inertsil ODS-3 4.6×250 mm，流動(dòng)相為：A相：乙腈；B相：磷酸水溶液，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL,柱溫40 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

上述流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)椋?-15min: A:B = 20:80; 17-20min = 90:10; 20.01-25min: A:B = 20:80。