一株高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐高溫中間葡糖醋桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一株高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐高溫菌株中間葡糖醋桿菌（Gluconacetobacterintermedius）1-17及利用該菌高產(chǎn)細(xì)菌纖維的方法。該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.8318。該菌的生物學(xué)特性是形狀短桿狀，革蘭氏陰性，不產(chǎn)芽孢，VP實驗陽性，耐3%乙酸和5%乙醇，耐40℃高溫，能夠利用乙醇、葡萄糖產(chǎn)乙酸。中間葡糖醋桿菌1-17（Gluconacetobacterintermedius1-17）是一株耐高溫的菌株，能夠在25～40℃的溫度下生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，最適溫度為35～37℃。該菌株能夠利用甘油，葡萄糖，甘露醇，蔗糖，果糖等多種碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，在改良的HS培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量可達(dá)到8.7g/L。由該菌產(chǎn)生的細(xì)菌纖維素能夠廣泛的應(yīng)用于食品，醫(yī)藥，造紙和電子等行業(yè)，該菌株的發(fā)現(xiàn)可為細(xì)菌纖維素的獲得可提供微生物資源基礎(chǔ)。
【專利說明】一株高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐高溫中間葡糖醋桿菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐高溫菌株中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17及利用該菌高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌纖維素(Bacteria cellulose，BC)是一種由細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的天然纖維素的統(tǒng)稱。細(xì)菌纖維素與植物纖維素具有相同的化學(xué)組成，但細(xì)菌纖維素的形態(tài)結(jié)構(gòu)和超分子結(jié)構(gòu)與植物纖維素有很大的不同，屬于典型的生物納米纖維材料。細(xì)菌纖維素是一種新型的納米級生物材料，其優(yōu)點有:(I)高化學(xué)純度，細(xì)菌纖維素與植物纖維素相比不含果膠質(zhì)等雜質(zhì)，用發(fā)酵法生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，提取過程很簡單，只需通過稀堿液處理就可以除去培養(yǎng)基和細(xì)胞，最終產(chǎn)品質(zhì)地純，纖維素含量高，而一般的植物纖維，必須在高溫下用濃堿進(jìn)行強(qiáng)烈消化，才能溶解除去緊貼纖維素的木質(zhì)素、半纖維素等成分；(2)纖維超細(xì)(納米級)，由細(xì)菌細(xì)胞壁側(cè)的小孔分泌出的相鄰幾根微纖絲間由氫鍵相互聯(lián)接形成的微纖絲束直徑為3-4nm，而由微纖維束聯(lián)接成的纖維絲帶寬度為30_100nm ;(3)高結(jié)晶度，細(xì)菌纖維素的結(jié)晶度高于普通高等植物纖維，而低于藻類和動物纖維；(4)很好的可修飾性，用不同的培養(yǎng)方法，如靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)可以得到不同高級結(jié)構(gòu)的纖維素，并且通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件也可以得到化學(xué)性質(zhì)有差異的細(xì)菌纖維素；(5)很好的生物親和性和降解性。細(xì)菌纖維素具有較高的生物適應(yīng)性，在自然界中可以直接降解，不污染環(huán)境，是環(huán)境友好產(chǎn)品；(6)高的保水性，由于細(xì)菌纖維素的超細(xì)納米結(jié)構(gòu)及分子內(nèi)存在著大量的親水性基團(tuán)，使其具有極強(qiáng)吸水和持水保濕能力，一般情況下，持水率高達(dá)97%以上；(7)很好的透氣性；(8)極佳的形狀維持能力和抗撕力，由于細(xì)菌纖維素中存在大量羥基，容易形成很強(qiáng)的分子內(nèi)和分子間氫鍵，氫鍵的存在對纖維的楊氏模量和抗拉強(qiáng)度有很重要的影響。細(xì)菌纖維素具有的這些優(yōu)點使其廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，醫(yī)用材料(人造皮膚、血管，組織等)，造紙工業(yè)，電子行業(yè)，高級音響設(shè)備振動膜，納米級復(fù)合材料，燃料電池等領(lǐng)域。
·[0003]目前產(chǎn)細(xì)菌纖維素的微生物有葡糖醋桿菌屬如cier),假單孢桿菌屬 QPseudomonas), 土壤桿菌屬(Agrobacteriurn),無色桿菌屬(Achromobacter ),氣桿菌屬iAerobac ter )，產(chǎn)喊桿菌屬iAlcaligcncs ),固氣菌屬(Azo tobac ter ),八疊球菌{Sarcina )和根瘤菌屬等,其中葡糖醋桿菌屬是應(yīng)用最廣泛的屬。目前葡萄醋桿菌屬中已有報道的產(chǎn)細(xì)菌纖維素的微生物有7個種，他們分別是G xylinus, G.medellensis, G.hansenii, G.sacchari, G.1n termed!us, G.kombuchae 取 G.swings!i,其中采用G生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的應(yīng)用最廣泛。
[0004]細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)周期長，通常為10-15d，成本高，產(chǎn)量低，消耗大量的人力物力。已報道產(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌株其最適溫度一般在25-30°C之間，通常為28°C和30°C，溫度稍高其生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的速率和產(chǎn)量均會下降。提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量通常有兩種方法，一是通過改善培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件使得細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量能夠有一定程度的提高，二是對已有菌株進(jìn)行改造或篩選新的菌株。用于篩選產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株的原材料有蔬菜，水果，食醋，發(fā)酵產(chǎn)品，土壤等。因此篩選生產(chǎn)效率高和產(chǎn)量高的菌株具有較好的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐高溫菌株中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17,以及利用該菌株高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法。該菌株在25~40°C的條件下能夠快速合成細(xì)菌纖維素，最適溫度為35~37°C。在培養(yǎng)基中添加
0.4%的乳酸鈣能夠顯著提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，產(chǎn)量達(dá)8.7 g/L。
[0006]本發(fā)明的發(fā)明人從傳統(tǒng)發(fā)酵食醋醋醅中分離獲得的一株中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius )1_17，該菌于2013年10月10日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國科學(xué)研究院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8318。
[0007]本發(fā)明中間葡糖醋桿菌1-17 (Gluconace tobac ter Υ/--6?/--(9￡//?5.1-17)的菌體形狀為短桿狀，革蘭氏陰性，不產(chǎn)芽孢，VP實驗陽性，耐3%乙酸和5%乙醇，耐40°C高溫，能夠利用甘油，葡萄糖，甘露醇，蔗糖，果糖等多種碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素。
[0008]本發(fā)明中間葡糖醋桿菌1-17 (Gluconace tobac ter Υ/--6?/--(9￡//?5.1-17)通過 16SrDNA序列比對分析,序列長1455bp,與中間葡糖醋桿菌{Gluconacetobacter intermediusNR_026435.1)的16S rDNA序列同源性最高，相似性為99%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征，生理生化特征確定間葡糖醋桿菌1-17屬于葡糖醋桿菌屬為中間葡糖醋桿|if {Gluconacetobacter in termed! us )菌株。
[0009]應(yīng)用上述微生物生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其步驟如下:
(1)采用保藏號為CGMCCN0.8318的中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterintermedius )1_17為生產(chǎn)菌種，按照常規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液劃線于HS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3天；`
(2)制備中間葡糖醋桿菌1-17菌株的種子液:挑取步驟(1)的HS固體培養(yǎng)基上的單菌落一環(huán)，接種于已滅菌的裝有IOmL種子培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為25~40°C，置搖床上以150~190 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24~48h，得到一級種子。將一級種子接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為25~40°C，置搖床上以15(Tl90 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24~48h，之后用力震蕩，打碎纖維素凝膠團(tuán)，使微生物懸浮于液體培養(yǎng)基中，得到菌懸液，用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基；
(3)細(xì)菌纖維素合成:將步驟(2)中制備好的菌懸液以5~10%(v/v)的接種量接入改良后的HS培養(yǎng)基中，裝液量為250 mL錐形瓶中裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25~40°C，靜置培養(yǎng)6~8 d，得到細(xì)菌纖維素菌膜。
[0010](4)細(xì)菌纖維菌膜的處理方法。將細(xì)菌纖維素菌膜從液體培養(yǎng)基中取出，用去離子水沖洗，將細(xì)菌纖維素菌膜浸泡于0.1M的NaOH溶液中煮沸15min，以除去膜中的菌體及殘留培養(yǎng)基，之后用去離子水沖洗浸泡過夜，直至PH小于7，即得到純凈的細(xì)菌纖維素膜。
[0011]其中步驟(1)中所述的HS培養(yǎng)基的成分及配比為:葡萄糖20g/L，蛋白胨5 g/L,酵母粉 10 g/L，一水合檸檬酸 1.15 g/L，Na2HPO4.12H20 4 g/L, pH 6.0~6.8，121°C 高壓蒸汽下滅菌20 min。冷卻后加2%乙醇。
[0012]步驟(3)中所述的改良后的HS培養(yǎng)基成分及配比為:葡萄糖20g/L，甘油10 g/L,蛋白胨5 g/L，酵母粉10 g/L，一水合檸檬酸1.15 g/L, Na2HPO4.12H20 4 g/L，七水硫酸鎂
0.1 g/L,抗壞血酸0.02 g/L。pH 6.0~6.8,121 °C高壓蒸汽下滅菌20 min,冷卻后加2%乙醇。
[0013]本發(fā)明所述的中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17菌株發(fā)現(xiàn)可利用葡萄糖，甘油等碳源高產(chǎn)細(xì)菌纖維素，并且耐高溫，在35~37°C下細(xì)菌纖維素生產(chǎn)速率快，是一株極具開發(fā)研究價值的生產(chǎn)菌株。
[0014]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17革蘭氏染色顯微拍照。
[0016]圖2為中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius )1-17所產(chǎn)細(xì)菌纖維素膜生成及處理后。
[0017]圖3為細(xì)菌纖維素菌膜傅里葉紅外光譜圖。
[0018]圖4為細(xì)菌纖維素掃描電鏡圖。
[0019]
【具體實施方式】
[0020]實施例1菌種的分·離及鑒定
取IOg醋醅樣品裝入混有玻璃珠和90mL無菌生理鹽水的500mL三角瓶中，200rpm震蕩30min后取菌懸液用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋(10_卜10_5)。取200ul合適梯度的稀釋液，涂布平板，30 °C培養(yǎng)3-5d，挑取單菌落進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)。根據(jù)伯杰式菌種鑒定手冊和16SrDNA基因序列分析對其進(jìn)行鑒定。
[0021]分離培養(yǎng)基:酵母粉5g/L,蛋白胨3g/L,甘露醇25g/L,輕質(zhì)碳酸|丐10g/L,瓊脂
1.5g/L, pH6.8,121°C滅菌 20min,冷卻后加乙醇 5ml/L。
[0022]實施例2 中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius ) 1-17產(chǎn)細(xì)菌纖維素
(1)接種菌種的HS平板培養(yǎng)基置于35~37°C的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2-3天，用接種環(huán)挑取一單菌落接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在35~37°C，150~190 rpm搖床上培養(yǎng)24-48 h,震蕩使菌體懸浮于液體培養(yǎng)基中得到適于接種的種子培養(yǎng)液；
(2)將種子培養(yǎng)液以5~10%的接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，35~37°C靜置培養(yǎng)6-8d，得到厚厚的細(xì)菌纖維素菌膜；
實施例3:細(xì)菌纖維素菌膜的處理:
將細(xì)菌纖維素菌膜從液體培養(yǎng)基中取出，用去離子水沖洗，將細(xì)菌纖維素菌膜浸泡于
0.1M的NaOH中煮沸15 min,以除去膜中的菌體及殘留培養(yǎng)基，之后用去離子水沖洗浸泡過夜，直至pH小于7，即得到純凈的細(xì)菌纖維素膜。
[0023]實施例4:培養(yǎng)條件優(yōu)化:
(I)溫度對其產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響。中間葡糖醋桿菌1-17在不同溫度下(25°C，28°C，30°C，33°C，35°C，37°C，40°C )培養(yǎng)生成細(xì)菌纖維素。選取最適溫度做為以后的培養(yǎng)溫度。[0024](2)碳源對其產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響。中間葡糖醋桿菌1-17利用葡萄糖，甘油，甘露醇，蔗糖，果糖及其復(fù)合碳源生產(chǎn)纖維素。將最適碳源做為以后研究的基礎(chǔ)碳源。
[0025](3)不同起始pH對其產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響。中間葡糖醋桿菌1-17在不同pH(6.5，6.0，5.5,5.0,4.5,4.0,3.5,3.0)培養(yǎng)生成細(xì)菌纖維素。 將最適pH做為以后研究的起始pH。
【權(quán)利要求】
1.一株高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的耐高溫菌株，該菌株經(jīng)鑒定為中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter intermedius)l_17,保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)研究院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8318，保藏日期為2013年10月10日。
2.利用權(quán)利要求1的中間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterintermedius) 1-17產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，其特征為: (1)將中間葡糖醋桿菌1-17從平板上挑取單菌落接入到種子培養(yǎng)基中，25lO°C，170-200 r/min培養(yǎng)48 h，得到種子液；種子培養(yǎng)基組成是葡萄糖30 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨 5 g/L，一水合檸檬酸 1.15 g/L, Na2HPO4 4 g/L ；MgS047 H2O 0.01g/L，滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至6.0-6.8，在121 °C高壓蒸汽下滅菌20 min，滅菌后加2%乙醇； (2)將種子培養(yǎng)基中產(chǎn)生的纖維素團(tuán)用力打散，使得菌體細(xì)胞進(jìn)入液體培養(yǎng)基中，制成菌懸液，種子以59TlO%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為250 mL錐形瓶中裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25~4(TC，培養(yǎng)時間為5~8 d，得到細(xì)菌纖維素膜；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20 g/L,甘油10g/L,酵母粉10g/L,蛋白胨5g/L,—水合檸檬酸1.15g/L，Na2HPO4 4 g/L, MgS047 H2O 0.01g/L，乳酸鈣 0.4% ;滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的 pH 至 6.0~6.8，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min，滅菌后加2%乙醇。
【文檔編號】C12R1/01GK103667148SQ201310678608
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月14日
【發(fā)明者】許正宏, 史勁松, 陸震鳴, 蘇俊霞, 王宗敏, 李國權(quán), 余永建 申請人:江南大學(xué)