專利名稱：一種嗜熱乳酸桿菌以及采用該菌種生產(chǎn)l－乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嗜熱乳酸桿菌以及生產(chǎn)L-乳酸的方法。
傳統(tǒng)的生產(chǎn)L-乳酸的方法均采用發(fā)酵法，即利用微生物發(fā)酵碳源生成L-乳酸的方法。國內(nèi)外大多數(shù)均采用根霉等真菌發(fā)酵，其中缺點主要是(1)需要較高的空氣系統(tǒng)及攪拌動力系統(tǒng)，對電、蒸汽等能源的消耗較大，生產(chǎn)成本較高；(2)根霉發(fā)酵由于是乳酸的異型發(fā)酵，在發(fā)酵乳酸的過程中根霉同時進行其它路徑的代謝，有大量的雜酸伴生，使發(fā)酵轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)品質(zhì)量低。中國專利申請?zhí)?6121927.0公開了用凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特點為營養(yǎng)缺陷型，生產(chǎn)成本較高。中國專利申請?zhí)?7181922.X，涉及了用細(xì)菌發(fā)酵含糖發(fā)酵液生產(chǎn)乳酸的方法，但該技術(shù)對培養(yǎng)基要求較高，在營養(yǎng)底物中需加入乳清蛋白作為特殊營養(yǎng)物，使乳酸生產(chǎn)成本較高。歐洲專利號230.021敘述了連續(xù)發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乳酸的方法，其缺點在于以葡萄糖等精制工業(yè)品為原料，營養(yǎng)物質(zhì)復(fù)雜，生產(chǎn)乳酸的成本很高，難以進行大規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是公開一種能夠發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的細(xì)菌菌種，即嗜熱性乳酸桿菌。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是公開了一種以細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，以獲得高純度的L-乳酸產(chǎn)品，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思本發(fā)明的發(fā)酵過程是淀粉質(zhì)原料用水調(diào)漿，加入α-淀粉酶液化后，在發(fā)酵液中加入糖化酶，采用邊糖化邊發(fā)酵技術(shù)(SimultaneousSacchrification and Formentation簡稱SSF)，接入嗜熱性乳酸桿菌CGMCCNo.0784，發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，采用高溫(45-55℃)厭氧發(fā)酵工藝，在發(fā)酵過程中加入中和劑以控制發(fā)酵液的pH為5.0-6.5，更適宜的pH為5.0-5.5。
使用的微生物本發(fā)明用于生產(chǎn)L-乳酸的微生物是一種屬于乳桿菌屬的菌種，嗜熱性乳酸桿菌(Lactobacillus thermophilus)(SNGBL100)即為具有這種能力的菌種，以下簡稱SNGBL100，該菌種已于2002年8月6日在中國微生物菌種保藏管理委員會保藏，保藏號為CGMCC No.0784。
上述菌種具有如下的性質(zhì)1.形態(tài)生理生化特征形態(tài)特征短桿，略彎曲，直桿狀有分段現(xiàn)象，大小不規(guī)則，0.9-1.2×5-15μm，液面不產(chǎn)膜。
生理生化特征革蘭氏陽性菌，產(chǎn)L-(+)乳酸，不產(chǎn)生消旋酶，專性同型乳酸發(fā)酵。
2.采用的培養(yǎng)基固體斜面分離培養(yǎng)基麥芽汁5°Be，酵母膏0.5％，牛肉膏0.3％，碳酸鈣0.6％，瓊脂2.5％，121℃20分鐘滅菌。
固體純化培養(yǎng)基麥芽汁5°Be，牛肉膏0.1％，蛋白胨0.2％，瓊脂2.5％，KH2PO40.02％，K2HPO40.02％，MgSO40.01％，NaCl 0.01％，121℃20分鐘滅菌。
液體增殖培養(yǎng)基麥芽汁5°Be，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，牛肉膏0.3％，KH2PO40.02％，K2HPO40.02％，NaCl 0.01％，CaCO33％，121℃20分鐘滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基碳源玉米粉、玉米淀粉、土豆淀粉、薯干粉、木薯粉、葡萄糖、麥芽糖等一種或多種。
氮源米糠、麩皮、硫酸銨、尿素、麥根、玉米漿等一種或多種。
營養(yǎng)成份玉米漿、毛發(fā)水解液、麥芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白等一種或多種。
3.培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度45-55℃，更適宜溫度50-55℃。
培養(yǎng)方式厭氧培養(yǎng)中和劑用NaOH、碳酸鈣、CaO、KOH等的一種或多種，控制PH在5.0-6.5，更適合PH在5.0-5.5。
根據(jù)文獻“伯杰系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊”，(Brrgey’s Manual of SystematicBacteriology)提供的鑒定方法和上述的試驗結(jié)果表明，上述菌種屬于乳桿菌屬的菌種。
本發(fā)明所用菌種的來源以5°Be麥芽汁在厭氧條件下，培養(yǎng)5天，采集生產(chǎn)有機酸的菌株，并以物理和化學(xué)誘變方式分離篩選出高產(chǎn)、高純度的L-乳酸生產(chǎn)菌株。具體的非限制性地分離方法可以以下述方式進行在液體增殖培養(yǎng)基中滴入數(shù)滴酸泔水(飼養(yǎng)場采集)，于50下厭氧培養(yǎng)3天，以同樣方式轉(zhuǎn)接3-4次后，取裝有玻璃珠的無菌水三角瓶和用于稀釋的裝有9ml無菌水的試管10-20支，吸取1ml富集菌液于三角瓶內(nèi)，打散菌體后吸1ml于稀釋管內(nèi)，依次吸取1ml至無菌試管進行10-1-10-10倍的稀釋，取10-7-10-9稀釋度的稀釋液，各吸取0.1ml固體分離培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天后挑選單個的菌株小、透明圈大的菌落，接于液體培養(yǎng)基中，于厭氧條件下培養(yǎng)3天，以HPLC分析L-乳酸純度，保藏純度＞99％的L-乳酸菌株。
本發(fā)明所用的分析方法采用斐林氏方法測定總糖，以EDTA測定L-乳酸鈣含量；以NaOH滴定法測定酸解后的發(fā)酵液中L-乳酸的含量；以HPLC法測定L-乳酸純度。
采用上述SNGBL100菌種可發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，生產(chǎn)方法包括如下步驟將所說的菌種接入含有淀粉質(zhì)(或糖)及氮源營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，厭氧條件下于50-56℃發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，更適宜的溫度為50-55℃，以NaOH、液氨、CaCO3、KOH、CaO等堿性物質(zhì)的一種或多種調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至5.0-6.5，更適合的pH為5.0-5.5，培養(yǎng)時間為48-72小時。
所說的淀粉質(zhì)包括玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、土豆粉、土豆淀粉或木薯粉中的一種或一種以上；所說的糖包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或乳糖等的一種或多種。所說的氮源包括米糠、麩皮、麥芽、麥根、硫酸銨、尿素、玉米漿等的一種或多種。所說的營養(yǎng)物質(zhì)即包括玉米漿、米糠、麩皮、麥芽汁、麥根、胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白等的一種或幾種。
采用本發(fā)明的菌種和生產(chǎn)方法，優(yōu)點在于可直接利用玉米、紅薯、大米等淀粉質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品粗原料發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，生產(chǎn)成本低廉，采用SSF技術(shù)，簡化了生產(chǎn)步驟。采用本發(fā)明的菌種(SNGBL100)，L-乳酸的轉(zhuǎn)化率在93-95％，L-乳酸的純度在97-99％。
實施例1發(fā)酵培養(yǎng)基，玉米粉8％，米糠0.5％，K2HPO40.02％，NaCl 0.01％，121℃20分鐘滅菌；加0.1％的高溫α-淀粉酶，液化1小時，加0.1％的糖化酶，同時接入5％種量，55±1℃培養(yǎng)，流加無菌碳酸鈣4％，48小時檢測產(chǎn)L-乳酸6.4％，純度98.9％。
實施例2以4-8％的玉米淀粉為碳源，0.1-4.0％的米糠為營養(yǎng)源，加自來水調(diào)勻，加0.1％的高溫α-淀粉酶，液化1小時后，冷卻至55℃，加入0.05％的糖化酶，同時接入5-10％嗜熱性乳酸菌增殖液，保持55±1℃，厭氧發(fā)酵，流加CaCO3調(diào)節(jié)PH值至5.0-6.5，在5-50L自控罐上經(jīng)過48-72小時的培養(yǎng)，生產(chǎn)L-乳酸。結(jié)果見下表1。
表1 實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖5％，硫酸銨0.5％，121℃20分鐘滅菌；55±1℃培養(yǎng)，流加無菌碳酸鈣4％，48小時檢測產(chǎn)L-乳酸4.6％，純度99.8％。
實施例4以8-13％土豆淀粉為碳源，玉米漿為營養(yǎng)物質(zhì)，以10-15μ/克淀粉的添加量加入高溫α-淀粉酶，液化以高壓連續(xù)噴射泵完成，經(jīng)維持罐后進發(fā)酵罐冷卻至55℃，加入量為100-200μ/克淀粉的糖化酶，同時接入5-10％的嗜熱性乳酸桿菌增殖液，發(fā)酵48-72小時，發(fā)酵溫度55±1℃，厭氧發(fā)酵，流加CaCO3調(diào)節(jié)pH值至5.0-6.5，在1000-5000L發(fā)酵罐上實現(xiàn)結(jié)果見下表。
表2
權(quán)利要求
1.一種嗜熱性乳酸桿菌CGMCC No.0784。
2.一種以嗜熱性乳酸桿菌為菌種生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于包括如下步驟將嗜熱性乳酸桿菌CGMCC No.0784接入含有淀粉質(zhì)或糖的培養(yǎng)基中，同時添加必要的氮源及營養(yǎng)物質(zhì)，以堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，即獲得L-乳酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在厭氧條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于對淀粉質(zhì)原料采用邊糖化邊發(fā)酵技術(shù)(Simultaneous Sacchrification and Formentation)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于發(fā)酵液pH為5.0-6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于pH為5.0-5.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)溫度為45-55℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于溫度為50-55℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述及的堿性物質(zhì)包括NaOH、液氨、CaCO3、KOH、CaO中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的淀粉質(zhì)物質(zhì)包括玉米粉、玉米淀粉、薯干粉、土豆粉、土豆淀粉或木薯粉中的一種或一種以上。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的糖包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或乳糖一種或多種。
12.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的氮源包括米糠、麩皮、麥芽、麥根、硫酸銨、尿素或玉米漿的一種或多種。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的營養(yǎng)物質(zhì)，包括毛發(fā)水解液、玉米漿、麥芽汁、玉米胚芽蛋白、花生蛋白、大豆蛋白一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嗜熱乳酸桿菌(Lactobacillusthermophilus)(SNGBL100)，保藏號為CGMCC No.0784和采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的方法，包括如下步驟淀粉質(zhì)原料用水調(diào)漿，加入α－淀粉酶液化后，在發(fā)酵液中加入糖化酶，同時接入嗜熱性乳酸桿菌CGMCC No.0784，采用邊糖化邊發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸。上述方法的優(yōu)點在于可直接利用玉米、紅薯、大米等淀粉質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸，生產(chǎn)成本低廉，采用SSF技術(shù)，簡化了工藝生產(chǎn)步驟。采用本發(fā)明的菌種(SNGBL100)，L－乳酸的轉(zhuǎn)化率在93－95％，L－乳酸的純度在97－99％。
文檔編號C12P7/40GK1415743SQ0214514
公開日2003年5月7日 申請日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者王健, 勞含章, 錢志良, 孫建榮 申請人:上海新立工業(yè)微生物科技有限公司, 錢志良