本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基、其制備方法以及枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
在我國(guó)，由于動(dòng)物養(yǎng)殖密度大、畜禽疾病復(fù)雜多樣及監(jiān)管不到位等諸多原因，普遍存在抗生素濫用的問(wèn)題，例如在防治畜禽疾病時(shí)過(guò)量使用抗生素、在畜禽飼料中隨意添加抗生素、隨意使用抗生素藥物濾渣、使用違禁種類抗生素等使得動(dòng)物養(yǎng)殖和食品安全問(wèn)題日益嚴(yán)峻，且細(xì)菌耐藥性的提高也為養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展埋下隱患。目前相關(guān)部門和國(guó)家機(jī)關(guān)已經(jīng)出臺(tái)一系列限用禁用部分抗生素的政策方針，市場(chǎng)上常用的耐藥性較高的抗生素首當(dāng)其沖?？墒钱?dāng)前復(fù)雜多樣的畜禽疾病也決定了抗菌抗病藥物的必要性，研發(fā)和尋找新型抗菌物質(zhì)成為當(dāng)務(wù)之急，具有抗菌能力的生物活性抗菌肽開(kāi)始被人類深入研究，伊枯草菌素就是其中之一。
伊枯草菌素是由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的一種有環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)的小分子多肽，一般包括親水和疏水兩部分，疏水部分是β-氨基脂肪酸，親水部分是由7-10個(gè)α-氨基酸形成的酰胺鍵環(huán)。大部分枯草芽孢桿菌都具有產(chǎn)生伊枯草菌素的能力，伊枯草菌素具有較強(qiáng)的抗菌特性，具有抗菌譜廣，無(wú)副作用的特點(diǎn)，是一種較好的抗菌制劑。
目前取得伊枯草菌素的方式主要有兩種：微生物發(fā)酵和化學(xué)合成，微生物發(fā)酵主要是通過(guò)發(fā)酵枯草芽孢桿菌獲得，化學(xué)合成法主要根據(jù)氨基酸序列合成，但化學(xué)合成法無(wú)論在產(chǎn)量和成本上都有很大局限性，很難滿足生產(chǎn)需要?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵包括液體發(fā)酵(專利ZL200910058559.9)和固體發(fā)酵(Mizumoto等人)，伊枯草菌素產(chǎn)量最高可分別達(dá)到8g/L和3.3g/Kg。但是這兩種方法因?yàn)槌杀究刂坪臀廴究刂茊?wèn)題無(wú)法廣泛推廣。
本發(fā)明人長(zhǎng)期從事微生物發(fā)酵及次級(jí)代謝產(chǎn)物研究工作。在對(duì)一株枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行研究改良過(guò)程中，通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分比例、發(fā)酵工藝參數(shù)和發(fā)酵方法進(jìn)行研究，獲得了能夠高密度發(fā)酵枯草芽孢桿菌進(jìn)而獲得高產(chǎn)量伊枯草菌素的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵方法，完成了本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基、其制備方法以及枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中提到的不足。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
一種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及各種成分在第一載體液中的含量為：糖10-30g/L、破壁啤酒酵母5-25g/L、水解羽毛粉1-15g/L、蛋白胨1-5g/L、水解蛋白1-5g/L和第一添加劑0.1-0.6g/L。
進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及各種成分在第一載體液中的含量為：糖15-25g/L、破壁啤酒酵母12-18g/L、水解羽毛粉6-9g/L、蛋白胨3-4g/L、水解蛋白3-4g/L和第一添加劑0.3-0.4g/L。更優(yōu)選為：糖20g/L、破壁啤酒酵母15g/L、水解羽毛粉7g/L、蛋白胨4g/L、水解蛋白3g/L和第一添加劑0.3g/L
進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基的成分以及各種成分在第二載體液中的含量為：葡萄糖7～14g/L、圣琪酵母浸出物3～7g/L、蛋白胨3～7g/L和第二添加劑6～10g/L。
進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基的成分以及各種成分在第二載體液中的含量為：葡萄糖10g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L和第二添加劑8.5g/L。
進(jìn)一步地，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述糖為蔗糖，所述蛋白胨為大豆蛋白胨，所述水解蛋白為小麥水解蛋白。
進(jìn)一步地，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述第一添加劑包括該七水合硫酸鎂，其加量為0.1-0.5g/L；
進(jìn)一步地，在所述種子培養(yǎng)基中，所述第二添加劑包括氯化鈉和七水合硫酸鎂，其加量為：氯化鈉8g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L。
進(jìn)一步地，在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述第一添加劑還包括硫酸亞鐵，其加量為0.05-0.1g/L。
進(jìn)一步地，所述第一載體液和第二載體液優(yōu)選為水。
一種所述的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基的制備方法：其特征在于：
發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：按比例稱取糖、破壁啤酒酵母、水解羽毛粉、蛋白胨、水解蛋白和第一添加劑，然后加入第一載體液中，攪拌均勻；
種子培養(yǎng)基的制備方法為：按比例稱取葡萄糖、圣琪酵母浸出物、蛋白胨和第二添加劑，并將其加入第二載體液中，攪拌均勻。
一種采用所述的培養(yǎng)基進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法包括以下步驟：
S1：種子培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌菌種接種于種子培養(yǎng)基中，于30～35℃下，搖床培養(yǎng)，制得一級(jí)種子液；
按10％的接種量將上述制得的一級(jí)種子液接種于所述種子培養(yǎng)基中，于30～35℃下，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)至種子液中的OD值為3-4時(shí)停止培養(yǎng)，即制得二級(jí)種子液；
S2：發(fā)酵培養(yǎng)：將所述發(fā)酵培養(yǎng)基裝在發(fā)酵罐中，將步驟S1中制得的二級(jí)種子液按10％的比例加入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
S3：檢測(cè)：步驟S2中發(fā)酵結(jié)束以后，取發(fā)酵液，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行處理，然后檢測(cè)發(fā)酵液中的伊枯草菌素。
進(jìn)一步地，步驟S2中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程包括増菌培養(yǎng)階段、發(fā)酵表達(dá)中前期和發(fā)酵表達(dá)后期；
増菌培養(yǎng)階段：0-8h進(jìn)行増菌培養(yǎng)，増菌培養(yǎng)中的參數(shù)為：溫度：30～35℃，pH：6.8-7.0，轉(zhuǎn)速：180～250rpm，發(fā)酵罐罐壓：0.3-0.4kg/cm2，DO：大于30％；
發(fā)酵表達(dá)中前期：發(fā)酵培養(yǎng)至8-60h時(shí)進(jìn)行中前期的發(fā)酵表達(dá)，中前期的發(fā)酵表達(dá)中的參數(shù)為：溫度：28～33℃，pH：6.5-6.8，轉(zhuǎn)速：150～200rpm，發(fā)酵罐罐壓：0.2-0.4kg/cm2，DO：大于30％；
發(fā)酵表達(dá)后期：發(fā)酵培養(yǎng)至60-72h時(shí)進(jìn)行后期的發(fā)酵表達(dá)，后期的發(fā)酵表達(dá)中的參數(shù)為：溫度：28～33℃，pH：6.5-6.8，轉(zhuǎn)速：180～220rpm，發(fā)酵罐罐壓：0.3-0.4kg/cm2，DO：大于30％。
進(jìn)一步地，步驟S3中，所述檢測(cè)的具體過(guò)程為：發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵上清用0.45μm濾膜過(guò)濾除菌后，采用10KD超濾管進(jìn)行二次超濾分離，再選用截留分子量為1000Da的透析袋進(jìn)行處理，真空冷凍干燥，然后以冷凍前樣品體積的1/10的比例加雙蒸水溶解，0.45μm濾膜過(guò)濾得到處理后的發(fā)酵液；對(duì)測(cè)定處理后的發(fā)酵液中的伊枯草菌素含量。
本發(fā)明至少具有以下有益效果：
①本發(fā)明提供了一種培育枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能夠有效培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，其增值快、存活率高，所培育的菌種活性高，培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌的的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有著重要的影響，并能夠通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)基(特別是發(fā)酵培養(yǎng)基)和優(yōu)化后的培育方法共同作用使得枯草芽孢桿菌產(chǎn)生伊枯草菌素的量提高，每升發(fā)酵液能夠獲得11g左右的伊枯草菌素，試驗(yàn)過(guò)程中最高達(dá)到了將近12g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出現(xiàn)有技術(shù)中的產(chǎn)量。
②本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分豐富，無(wú)需后期補(bǔ)料即可獲得高密度菌體和高產(chǎn)伊枯草菌素。
③本發(fā)明的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，操作方便，有利于伊枯草菌素大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)；而且該培養(yǎng)基和培養(yǎng)過(guò)程不會(huì)產(chǎn)生污染以及二次污染問(wèn)題，并且其成本較現(xiàn)有技術(shù)低。
綜上，本發(fā)明的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方法具有極其重要和廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值和前景。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。以下提供的本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通方法人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
一種培育高產(chǎn)伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖10g/L、破壁啤酒酵母25g/L、水解羽毛粉1g/L、大豆蛋白胨5g/L、小麥水解蛋白1g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L和硫酸亞鐵0.05g/L。
實(shí)施例2
一種培育高產(chǎn)伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖30g/L、破壁啤酒酵母5g/L、水解羽毛粉15g/L、大豆蛋白胨1g/L、小麥水解蛋白5g/L、七水合硫酸鎂0.1g/L和硫酸亞鐵0.1g/L。
實(shí)施例3
一種培育高產(chǎn)伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖15g/L、破壁啤酒酵母18g/L、水解羽毛粉6g/L、大豆蛋白胨4g/L、小麥水解蛋白3g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L和硫酸亞鐵0.05g/L。
實(shí)施例4
一種培育高產(chǎn)伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖25g/L、破壁啤酒酵母12g/L、水解羽毛粉9g/L、大豆蛋白胨3g/L、小麥水解蛋白4g/L、七水合硫酸鎂0.1g/L和硫酸亞鐵0.1g/L。
實(shí)施例5
一種培育高產(chǎn)伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基，包括種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖20g/L、破壁啤酒酵母15g/L、水解羽毛粉7g/L、大豆蛋白胨4g/L、小麥水解蛋白3g/L、七水合硫酸鎂0.24g/L和硫酸亞鐵0.06g/L。
實(shí)施例6
實(shí)施例1～5中的任意一個(gè)中所述的種子培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖7g/L、圣琪酵母浸出物7g/L、蛋白胨3g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實(shí)施例7
實(shí)施例1～5中的任意一個(gè)中所述的種子培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖14g/L、圣琪酵母浸出物3g/L、蛋白胨7g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實(shí)施例8
實(shí)施例1～5中的任意一個(gè)中所述的種子培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖9g/L、圣琪酵母浸出物7g/L、蛋白胨4g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實(shí)施例9
實(shí)施例1～5中的任意一個(gè)中所述的種子培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖12g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實(shí)施例10
實(shí)施例1～5中的任意一個(gè)中所述的種子培養(yǎng)基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖10g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實(shí)施例11
培育枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基中載體水的體積量，然后按上述實(shí)施例1～5中任意一個(gè)實(shí)施例所述的比例稱取蔗糖、破壁啤酒酵母、水解羽毛粉、大豆蛋白胨、小麥水解蛋白、七水合硫酸鎂和硫酸亞鐵，然后將這些成分加至水中，攪拌均勻，滅菌處理；
培育枯草芽孢桿菌的種子培養(yǎng)基的制備方法為：根據(jù)種子培養(yǎng)基中載體水的體積量，然后按上述實(shí)施例6～10中任意一個(gè)實(shí)施例所述的比例稱取葡萄糖、圣琪酵母浸出物、蛋白胨、氯化鈉和七水合硫酸鎂，然后將這些成分加至水中，攪拌均勻，滅菌處理。
實(shí)施例12
11、一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養(yǎng)：取斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，將枯草芽孢桿菌菌種接種于裝有300ml種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，接種后，種子培養(yǎng)基中的芽孢含量約為106cfu/ml，于33℃下，160rpm搖床培養(yǎng)8-10h，培養(yǎng)至種子液中的OD值為1-2時(shí)停止培養(yǎng)，即制得一級(jí)種子液；
按10％的接種量將上述制得的一級(jí)種子液接種于裝有400ml種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，于33℃下，150rpm搖床培養(yǎng)12h左右，培養(yǎng)至種子液中的OD值為3-4時(shí)停止培養(yǎng)，即制得二級(jí)種子液；
上述的種子培養(yǎng)基為按以下配方配制：10g葡萄糖/1L水,5g圣琪酵母浸出物/1L水，5g蛋白胨/1L水，8g氯化鈉/1L水，0.5g七水合硫酸鎂/1L水。
S2：發(fā)酵培養(yǎng)：將30L的所述發(fā)酵培養(yǎng)基裝在50L發(fā)酵罐中，將步驟S1中制得的二級(jí)種子液按10％的體積比例加入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，該發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程包括前8小時(shí)的増菌培養(yǎng)階段、8-60小時(shí)時(shí)的中前期的發(fā)酵表達(dá)階段和60-72小時(shí)的后期的發(fā)酵表達(dá)階段；
該發(fā)酵培養(yǎng)基中為按以下配方及比例配制：10g蔗糖/1L水、5g破壁啤酒酵母/1L水、1g水解羽毛粉/1L水、1g大豆蛋白胨/1L水、1g小麥水解蛋白/1L水、0.1g七水合硫酸鎂/1L水、0.05g硫酸亞鐵/1L水。
具體發(fā)酵中的具體參數(shù)如下表1所示。
表1 發(fā)酵罐中發(fā)酵工藝的參數(shù)
S3：檢測(cè)：步驟S2中發(fā)酵結(jié)束以后，取發(fā)酵上清用0.45μm濾膜過(guò)濾除菌后，采用10KD超濾管進(jìn)行二次超濾分離；由于超濾分離得到的是截留后的濾出液，而小分子的鹽類也隨之在濾出液中存在，故需要對(duì)濾出液進(jìn)行脫鹽處理,該脫鹽處理選用截留分子量為1000Da的透析袋除去鹽分而保留目的多肽，然后真空冷凍干燥，再以冷凍前樣品體積的1/10的比例加雙蒸水溶解，0.45μm濾膜過(guò)濾備用。
采用高效液相色譜法測(cè)定伊枯草菌素含量(標(biāo)品有上海佑隆生物技術(shù)有限公司提供，純度99.9％)。色譜條件為：色譜柱C18×150mm，流動(dòng)相為45％乙腈：5％甲醇：50％水，流速為0.8ml/min，波長(zhǎng)為280nm。經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)過(guò)72h發(fā)酵，發(fā)酵液上清中的伊枯草菌素含量為8.64g/L，伊枯草菌素含量較高，其說(shuō)明了本發(fā)明中的培養(yǎng)基和優(yōu)化后的培養(yǎng)方法對(duì)枯草芽孢桿菌的的生長(zhǎng)較好以及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生量較大。
實(shí)施例13
一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養(yǎng)：同實(shí)施例12的步驟S1，這里不再重復(fù)限定；
S2：發(fā)酵培養(yǎng)：將30L的所述發(fā)酵培養(yǎng)基裝在50L發(fā)酵罐中，將步驟S1中制得的二級(jí)種子液按10％的體積比例加入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，該發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程包括前8小時(shí)的増菌培養(yǎng)階段、8-60小時(shí)時(shí)的中前期的發(fā)酵表達(dá)階段和60-72小時(shí)的后期的發(fā)酵表達(dá)階段；具體發(fā)酵中的具體參數(shù)如下表1所示。
該發(fā)酵培養(yǎng)基中為按以下配方及比例配制：15g蔗糖/1L水、12g破壁啤酒酵母/1L水、8g水解羽毛粉/1L水、2.5g大豆蛋白胨/1L水、2.5g小麥水解蛋白/1L水、0.25g七水合硫酸鎂/1L水、0.075g硫酸亞鐵/1L水。
S3：檢測(cè)：具體過(guò)程同實(shí)施例12步驟S3，這里不再重復(fù)限定。經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)過(guò)72h發(fā)酵，發(fā)酵液上清中的伊枯草菌素含量為9.33g/L，伊枯草菌素含量較高，其也同時(shí)說(shuō)明了本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌的的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有著重要的影響。
實(shí)施例14
一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養(yǎng)：同實(shí)施例12的步驟S1，這里不再重復(fù)限定；
S2：發(fā)酵培養(yǎng)：將30L的所述發(fā)酵培養(yǎng)基裝在50L發(fā)酵罐中，將步驟S1中制得的二級(jí)種子液按10％的體積比例加入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，該發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程包括前8小時(shí)的増菌培養(yǎng)階段、8-60小時(shí)時(shí)的中前期的發(fā)酵表達(dá)階段和60-72小時(shí)的后期的發(fā)酵表達(dá)階段；具體發(fā)酵中的具體參數(shù)如下表1所示。
該發(fā)酵培養(yǎng)基中為按以下配方及比例配制：15g蔗糖/1L水、20g破壁啤酒酵母/1L水、13g水解羽毛粉/1L水、2.5g大豆蛋白胨/1L水、4g小麥水解蛋白/1L水、0.25g七水合硫酸鎂/1L水、0.075g硫酸亞鐵/1L水。
S3：檢測(cè)：具體過(guò)程同實(shí)施例12步驟S3，這里不再重復(fù)限定。經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)過(guò)72h發(fā)酵，發(fā)酵液上清中的伊枯草菌素含量為10.95g/L，伊枯草菌素的含量極高，其說(shuō)明了發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌的的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有著重要的影響。
實(shí)施例15
一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養(yǎng)：取斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，將枯草芽孢桿菌菌種接種于裝有300ml種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，接種后，種子培養(yǎng)基中的芽孢含量約為106cfu/ml，于33℃下，160rpm搖床培養(yǎng)8-10h，培養(yǎng)至種子液中的OD值為1-2時(shí)停止培養(yǎng)，即制得一級(jí)種子液；
按10％的接種量將上述制得的一級(jí)種子液接種于裝有400ml種子培養(yǎng)基的1L三角瓶中，于33℃下，150rpm搖床培養(yǎng)12h左右，培養(yǎng)至種子液中的OD值為3-4時(shí)停止培養(yǎng)，即制得二級(jí)種子液；
上述的種子培養(yǎng)基為按以下配方配制：10g葡萄糖/1L水,7g圣琪酵母浸出物/1L水，5g蛋白胨/1L水，8g氯化鈉/1L水，0.5g七水合硫酸鎂/1L水。
S2：發(fā)酵培養(yǎng)：將30L的所述發(fā)酵培養(yǎng)基裝在50L發(fā)酵罐中，將步驟S1中制得的二級(jí)種子液按10％的體積比例加入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，該發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程包括前8小時(shí)的増菌培養(yǎng)階段、8-60小時(shí)時(shí)的中前期的發(fā)酵表達(dá)階段和60-72小時(shí)的后期的發(fā)酵表達(dá)階段；具體發(fā)酵中的具體參數(shù)如下表1所示。
該發(fā)酵培養(yǎng)基中為按以下配方及比例配制：10g蔗糖/1L水、5g破壁啤酒酵母/1L水、1g水解羽毛粉/1L水、1g大豆蛋白胨/1L水、1g小麥水解蛋白/1L水、0.1g七水合硫酸鎂/1L水、0.05g硫酸亞鐵/1L水
S3：檢測(cè)：具體過(guò)程同實(shí)施例12步驟S3，這里不再重復(fù)限定。經(jīng)檢測(cè)，經(jīng)過(guò)72h發(fā)酵，發(fā)酵液上清中的伊枯草菌素含量為9.05g/L，該實(shí)施例也說(shuō)明了種子培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有重要作用，尤其是圣琪酵母浸出物。
具體實(shí)施時(shí)，本發(fā)明中的培養(yǎng)量可根據(jù)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中各種成分的之間的比值按比例擴(kuò)大，但不管規(guī)模如何，只要比例在本發(fā)明的范圍內(nèi)，便在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，且本發(fā)明擴(kuò)大生產(chǎn)后不會(huì)影響最終的結(jié)果。
本發(fā)明中的七水合硫酸鎂可用硫酸鎂代替，但需要根據(jù)分子量適當(dāng)減少加量便可。
以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以有各種改動(dòng)和變化。凡在本發(fā)明的精神和原理之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。