本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌，屬于代謝工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，分子式為C₅O₃NH₉，分子量為131.13，熔點(diǎn)為149-151℃，它是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B₁₂等的關(guān)鍵前體物質(zhì)。ALA作為一種安全、選擇、滲透性好的光動(dòng)力學(xué)藥物在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸受到重視，已經(jīng)成功應(yīng)用于皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷和光動(dòng)力治療中。另外，ALA作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化農(nóng)藥，在農(nóng)藥領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，如作為一種無公害的綠色農(nóng)藥、除草劑以及植物生長調(diào)節(jié)劑等。

目前，ALA合成主要采用化學(xué)法合成，最早出現(xiàn)在上世紀(jì)50年代，直到20世紀(jì)90年代，相關(guān)研究才大量開展，并取得了一定的成績。但是由于化學(xué)合成反應(yīng)步驟繁瑣，副產(chǎn)物多，分離提純困難，ALA的得率也較低，并且環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，近年來，微生物發(fā)酵生產(chǎn)ALA已成為研究的熱點(diǎn)。自然界中，ALA的生物合成存在兩條途徑，一條是C4途徑，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA編碼)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反應(yīng)組成，主要存在于一些光合細(xì)菌、真菌以及動(dòng)物體內(nèi)。另外一條是C5途徑，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX編碼)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA還原酶(GluTR，hemA編碼)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基轉(zhuǎn)移酶(GSA-AM，hemL編碼)催化生成ALA。該途徑廣泛存在于植物、藻類以及細(xì)菌(如大腸桿菌)中。

早期，人們篩選到產(chǎn)ALA的光合細(xì)菌類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)，通過誘變育種法對(duì)其進(jìn)行誘變，篩選ALA的高產(chǎn)菌株，并通過發(fā)酵優(yōu)化等使得ALA的產(chǎn)量達(dá)到7.2g/L。但由于光合細(xì)菌的特殊性，其成本較高，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一種5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌株，是以大腸桿菌為宿主，在表達(dá)C4途徑關(guān)鍵基因hemA(編碼5-氨基乙酰丙酸合酶)的基礎(chǔ)上，共表達(dá)大腸桿菌輔酶A途徑的相關(guān)基因即編碼泛酸激酶的的基因coaA、編碼磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脫羧酶的基因dfp、和編碼磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因coaA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因dfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因coaD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因hemA以pRSFDuet-1為表達(dá)載體進(jìn)行共表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述基因coaA、dfp、coaD共用一個(gè)表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括pUC19和pETDuet-1。

本發(fā)明要解決的第二個(gè)問題是提供所述大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，所述方法是以大腸桿菌為宿主，以pRSFDuet-1為表達(dá)載體表達(dá)hemA基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還以pUC19或pETDuet-1載體，并表達(dá)coaA、dfp、coaD基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將coaA、dfp和coaD基因通過同源重組方法連接載體pUC19和pETDuet-1載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體包括以下步驟：

(1)將來源于莢膜紅細(xì)菌的基因hemA通過擴(kuò)增利用同源重組方法連接到同樣通過擴(kuò)增得到的載體pRSFDuet-1中，獲得重組表達(dá)載體pRSFDuet-1-hemA；(2)將來源于大腸桿菌的coaA、dfp、coaD基因通過同源重組方法連接到載體pUC19和pETDuet-1載體中，分別得到表達(dá)載體pUC19-coaA-dfp-coaD和pETDuet-1-coaA-dfp-coaD；(3)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)；或?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA與pUC19-coaA-dfp-coaD共轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)；或?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA與pETDuet-1-coaA-dfp-coaD共轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)。

本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法是將所述大腸桿菌工程菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃，200～220r/min培養(yǎng)24-32h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有：(NH₄)₂SO₄15g/L，KH₂PO₄5.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，酵母提取物1.0g/L，葡萄糖20g/L。

本發(fā)明還提供所述大腸桿菌工程菌在制備含5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明在表達(dá)C4途徑關(guān)鍵基因hemA的基礎(chǔ)上，共表達(dá)大腸桿菌輔酶A途徑的相關(guān)基因即編碼泛酸激酶的的基因coaA、編碼磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脫羧酶的基因dfp、編碼磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD，取得了意料不到的技術(shù)效果：共表達(dá)coA途徑關(guān)鍵基因的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD在250m L搖瓶培養(yǎng)中能夠積累5-氨基乙酰丙酸700mg/L，相比于對(duì)照菌株提高了46％，有效地利用C4途徑促進(jìn)5-氨基乙酰丙酸的合成，實(shí)現(xiàn)了微生物發(fā)酵法直接發(fā)酵葡萄糖合成5-氨基乙酰丙酸，縮短發(fā)酵周期、降低生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為大腸桿菌中ALA C4合成途徑；

圖2為大腸桿菌中輔酶A合成途徑；

圖3為重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA構(gòu)建菌落PCR電泳圖；M：DL 5000Marker；

圖4為重組質(zhì)粒pUC19-coaA-dfp-coaD和pETDuet-1-coaA-dfp-coaD構(gòu)建菌落PCR電泳圖；M：DL 5000Marker；1-12：pUC19-coaA-dfp-coaD質(zhì)粒構(gòu)建菌落PCR結(jié)果；13-24：pETDuet-1-coaA-dfp-coaD質(zhì)粒構(gòu)建菌落PCR結(jié)果；M：DL 5000Marker；

圖5為重組菌搖瓶發(fā)酵ALA產(chǎn)量；從左至右分別為E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA，E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pUC19-coaA-dfp-coaD，E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD。

具體實(shí)施方式

ALA分析方法：采用Mauzerall和Granick的分光光度法：將樣品稀釋至2mL，加入1mL的乙酸鹽緩沖液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷卻至室溫，取2mL的反應(yīng)液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s試劑，反應(yīng)20min，利用分光光度計(jì)554nm下檢測。

培養(yǎng)基：

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，瓊脂20，pH 7.0；

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，pH 7.0，裝液量20mL/250mL；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：(NH₄)₂SO₄15，KH₂PO₄5.0，Na₂HPO₄·12H₂O 15，MgSO₄·7H₂O 1.0，酵母提取物1.0，葡萄糖20，pH 7.0，裝液量30mL/250mL。

培養(yǎng)條件：

菌種培養(yǎng)：甘油管劃線，然后挑取單菌落劃線平板37℃培養(yǎng)，作為種子來源；

種子培養(yǎng)：平板挑取菌體，37℃，220r/min，根據(jù)要求添加卡那霉素100μg/mL和氨芐霉素100μg/mL，培養(yǎng)約12h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基；

發(fā)酵培養(yǎng)：以2％(按體積比)接種量轉(zhuǎn)接，0h時(shí)添加0.1-0.5mM IPTG誘導(dǎo)基因表達(dá)，根據(jù)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的抗性添加卡那霉素(100μg/mL)或氨芐霉素(100μg/mL)，37℃，220r/min培養(yǎng)，周期24-32h。

實(shí)施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

(1)重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA，pUC19-coaA-dfp-coaD，pETDuet-1-coaA-dfp-coaD的構(gòu)建。

引物如下：

RSF-F:TGTTTAACTTTAATAAGGAGGAAAATATATGGACTACAATCTCGCGCTCGAC

RSF-R:CTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAG

hemA-F:TGTTTAACTTTAATAAGGAGGAAAATATATGGACTACAATCTGGCACTCG

hemA-R:CGAGCTCGGCCACGAAGTGCTCAGGCAGAGGCCTCGGCGCGA

pUC19-F:TGATGGCGAAGTTAGCGTAGGTCATAGCTGTTTCCT

pUC19-R:CTCTTTTATACTCATTACGAGCCGGAAGCATAAAG

pET-F:GATGGCGAAGTTAGCGTAGGGCGCGCCTGCAGGTCGACAAGCTTG

pET-R:GTTTGCTCTTTTATACTCATGAATTCGGATCCTGGCTGTGGTG

coaA-19F:TGCTTCCGGCTCGTAATGAGTATAAAAGAGCAAACGTTAAT

coaA-ETF:CACAGCCAGGATCCGAATTCATGAGTATAAAAGAGCAAAC

coaA-R:ACCGGCCAGGCTCATTTATTTGCGTAGTCTGACCTCTTCT

dfp-F:AGACTACGCAAATAAATGAGCCTGGCCGGTAAAAAAATCG

dfp-R:CGCCCGTTTTTGCATTTAACGTCGATTTTTTTCATCATAA

coaD-F:AAAAATCGACGTTAAATGCAAAAACGGGCGATTTATCCGG

coaD-19R:CAGCTATGACCTACGCTAACTTCGCCATCAGCGCC

coaD-ETR:CACCACAGCCAGGATCCGATAACTTCGCCATCAGCGCC

以pRSFDuet-1質(zhì)粒為模板，以引物RSF-F和RSF-R進(jìn)行擴(kuò)增，獲得pRSFDuet-1線性載體；以莢膜紅細(xì)菌ATCC 11166基因組為模板，以引物hemA-F和hemA-R擴(kuò)增hemA基因，獲得hemA基因片段，將pRSFDuet-1線性載體與hemA基因片段通過同源重組反應(yīng)進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA。

以pUC19質(zhì)粒為模板，以引物pUC19-F和pUC19-R進(jìn)行擴(kuò)增，獲得pUC19線性載體；以大腸桿菌基因組為模板，以引物coaA-19F和coaA-R擴(kuò)增coaA基因，以引物dfp-F和dfp-R擴(kuò)增dfp基因，以引物coaD-F和coaD-19R擴(kuò)增coaD基因，分別獲得coaA-19、dfp、coaD-19基因片段，將pUC19線性載體、coaA-19、dfp、coaD-19片段通過同源重組反應(yīng)進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pUC19-coaA-dfp-coaD。

以pETDuet-1質(zhì)粒為模板，以引物pET-F和pET-R進(jìn)行擴(kuò)增，獲得pETDuet-1線性載體；以大腸桿菌基因組為模板，以引物coaA-ETF和coaA-R擴(kuò)增coaA基因，以引物dfp-F和dfp-R擴(kuò)增dfp基因，以引物coaD-F和coaD-ETR擴(kuò)增coaD基因，分別獲得coaA-ET、dfp、coaD-ET基因片段，將pETDuet-1線性載體、coaA-ET、dfp、coaD-ET片段通過同源重組反應(yīng)進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-1-coaA-dfp-coaD。

反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min/kb(32個(gè)循環(huán))；72℃10min進(jìn)行PCR反應(yīng)，并以1％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證并回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將片段(0.04ng/bp)和載體(0.02ng/bp)混于同一PCR管中，加入4μl重組酶緩沖液和2μl重組酶，加ddH₂O補(bǔ)齊至20μl，在37度反應(yīng)30min。將反應(yīng)產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至E.coli JM109，挑選陽性克隆子提取質(zhì)粒并送上海生工測序驗(yàn)證，菌落PCR結(jié)果電泳圖如圖3和圖4(箭頭所示為目的條帶)。

(2)ALA發(fā)酵重組菌株的構(gòu)建

基本方法是將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌A1。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA，pUC19-coaA-dfp-coaD共轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌A2。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-hemA，pETDuet-1-coaA-dfp-coaD共轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌A3。

實(shí)施例2重組菌搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

菌株：

A1:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA

A2:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pUC19-coaA-dfp-coaD

A3:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD

將重組菌A2和A3分別進(jìn)行種子培養(yǎng)和發(fā)酵，以未共表達(dá)CoA相關(guān)基因的菌株A1為對(duì)照，37℃，220r/min發(fā)酵24-32h，測定ALA產(chǎn)量。結(jié)果顯示(圖5)，通過高拷貝質(zhì)粒和中拷貝質(zhì)粒組合表達(dá)coaA、dfp、coaD，與對(duì)照菌株A1相比，ALA產(chǎn)量均有提高。使用pUC19表達(dá)CoA相關(guān)基因的重組菌A2的ALA產(chǎn)量為654mg/L,比對(duì)照菌株A1提高了約37％；使用質(zhì)粒pETDuet-1表達(dá)CoA相關(guān)基因的重組菌A3的ALA產(chǎn)量為700mg/L,比對(duì)照菌株A1提高了約46％。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggactaca atctcgcgct cgacaaagcg atccagaaac tccacgacga gggacgttac 60

cgcacgttca tcgacatcga acgcgagaag ggcgccttcc ccaaggcgca gtggaaccgc 120

cccgatggcg gcaagcagga catcaccgtc tggtgcggca acgactatct gggcatgggc 180

cagcacccgg tcgttctggc cgcgatgcat gaggcgctgg aagcggtcgg ggccggttcg 240

ggcggcaccc gcaacatctc gggcaccacg gcctatcacc gccgtctgga agccgagatc 300

gccgatctgc acggcaagga agcggcgctt gtcttctcct cggcctatat cgccaatgac 360

gcgacgctct cgacgctgcg cgtgcttttc cccggcctga tcatctattc cgacagcctg 420

aaccacgcct cgatgatcga ggggatcaag cgcaatgccg ggccgaagcg gatcttccgt 480

cacaatgacg tcgcccatct gcgcgagctg atcgccgctg atgatccggc cgcgccgaag 540

ctgatcgcct tcgaatcggt ctattcgatg gatggcgact tcggcccgat caaggaaatc 600

tgcgacatcg ccgatgaatt cggcgcgctg acctatatcg acgaagtcca tgccgtcggc 660

atgtatggcc cccgcggcgc gggcgtggcc gagcgtgacg gtctgatgca ccgcatcgac 720

atcttcaacg gcacgctggc gaaagcctat ggcgtcttcg gcggctacat cgccgcttcg 780

gcgaagatgg tcgatgccgt gcgctcctat gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840

ccgccggcga tcgccgctgg cgcgcaggcc tcgatcgcgt ttttgaaaac cgccgaaggg 900

cagaagctgc gcgacgcgca acagatgcac gcgaaggtgc tgaaaatgcg gctcaaggcg 960

ctggggatgc cgatcatcga ccatggcagc cacatcgttc cggtggtcat cggtgacccc 1020

gtgcacacca aggcggtgtc ggacatgctc ctgtcggatt acggcgttta cgtgcagccg 1080

atcaacttcc cgacggtgcc gcgcggcacc gaacggctgc gcttcacccc ctcgccggtg 1140

catgacctga aacagatcga cgggctggtt catgccatgg atctgctctg ggcgcgctgt 1200

gcgctgaatc gcgccgaggc ctctgcctga 1230

<210> 2

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtataa aagagcaaac gttaatgacg ccttacctac agtttgaccg caaccagtgg 60

gcagctctgc gtgattccgt acctatgacg ttatcggaag atgagatcgc ccgtctcaaa 120

ggtattaatg aagatctctc gttagaagaa gttgccgaga tctatttacc tttgtcacgt 180

ttgctgaact tctatataag ctcgaatctg cgccgtcagg cagttctgga acagtttctt 240

ggtaccaacg ggcaacgcat tccttacatt atcagtattg ctggcagtgt cgcggtgggg 300

aaaagtacaa ccgcccgtgt attgcaggcg ctattaagcc gttggccgga acatcgtcgt 360

gttgaactga tcactacaga tggcttcctt caccctaatc aggttctgaa agaacgtggt 420

ctgatgaaga agaaaggctt cccggaatcg tatgatatgc atcgcctggt gaagtttgtt 480

tccgatctca aatccggcgt gccaaacgtt acagcacctg tttactcaca tcttatttat 540

gatgtgatcc cggatggaga taaaacggtt gttcagcctg atattttaat tcttgaaggg 600

ttaaatgtct tacagagcgg gatggattat ccacacgatc cacatcatgt atttgtttct 660

gattttgtcg atttttcgat atatgttgat gcaccggaag acttacttca gacatggtat 720

atcaaccgtt ttctgaaatt ccgcgaaggg gcttttaccg acccggattc ctattttcat 780

aactacgcga aattaactaa agaagaagcg attaagactg ccatgacatt gtggaaagag 840

atcaactggc tgaacttaaa gcaaaatatt ctacctactc gtgagcgcgc cagtttaatc 900

ctgacgaaaa gtgctaatca tgcggtagaa gaggtcagac tacgcaaata a 951

<210> 3

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgagcctgg ccggtaaaaa aatcgttctc ggcgttagcg gcggtattgc tgcctataaa 60

acccctgaac tggtgcgtcg tttgcgcgat cgcggggccg acgtccgcgt agccatgacc 120

gaagcggcaa aagcctttat caccccactt agcttgcagg cggtttctgg ttatcccgtt 180

tccgacagtc tgctggaccc ggcagccgaa gccgctatgg gccatattga gctgggtaaa 240

tgggctgatt tagtgattct cgcccctgcc acggcagatt tgattgcccg tgttgctgcc 300

ggaatggcga atgacctggt atcgacgatt tgtctggcta cacctgcgcc tgtagccgtg 360

ctccccgcca tgaaccagca gatgtaccgt gccgctgcca cgcagcataa tttagaggtg 420

cttgcttccc gtggtttgct catctggggg ccagacagtg gcagtcaggc ttgtggtgat 480

atcggtcctg ggcgaatgct cgatccgtta accattgtgg atatggcggt agcgcatttt 540

tcgcccgtca acgacctgaa acatctgaac attatgatta ccgccggccc gacgcgtgaa 600

ccgctcgatc cggtgcgtta tatctctaat cacagctccg gcaagatggg ttttgctatc 660

gccgccgccg ctgcccgtcg tggcgcgaac gtcacgctgg tatcaggtcc ggtttcacta 720

ccgacgccac cgtttgttaa acgtgttgat gtgatgaccg cgctggaaat ggaagccgcc 780

gtgaatgctt ctgtacagca gcaaaatatt tttatcggct gcgccgccgt ggcggattat 840

cgcgcagcta ccgtggcccc agagaaaatc aaaaagcagg ccacgcaggg tgatgaatta 900

acaataaaaa tggttaaaaa ccccgatatc gtcgcaggcg ttgccgcact aaaagaccat 960

cgaccctacg tcgttggatt tgccgccgaa acaaataatg tggaagaata cgcccggcaa 1020

aaacgtatcc gtaaaaacct tgatctgatc tgcgcgaacg atgtttccca gccaactcaa 1080

ggatttaaca gcgacaacaa cgcattacac cttttctggc aggacggaga taaagtctta 1140

ccgcttgagc gcaaagagct ccttggccaa ttattactcg acgagatcgt gacccgttat 1200

gatgaaaaaa atcgacgtta a 1221

<210> 4

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcaaaaac gggcgattta tccgggtact ttcgatccca ttaccaatgg tcatatcgat 60

atcgtgacgc gcgccacgca gatgttcgat cacgttattc tggcgattgc cgccagcccc 120

agtaaaaaac cgatgtttac cctggaagag cgtgtggcac tggcacagca ggcaaccgcg 180

catctgggga acgtggaagt ggtcgggttt agtgatttaa tggcgaactt cgcccgtaat 240

caacacgcta cggtgctgat tcgtggcctg cgtgcggtgg cagattttga atatgaaatg 300

cagctggcgc atatgaatcg ccacttaatg ccggaactgg aaagtgtgtt tctgatgccg 360

tcgaaagagt ggtcgtttat ctcttcatcg ttggtgaaag aggtggcgcg ccatcagggc 420

gatgtcaccc atttcctgcc ggagaatgtc catcaggcgc tgatggcgaa gttagcgtag 480

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtttaactt taataaggag gaaaatatat ggactacaat ctcgcgctcg ac 52

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctccttatta aagttaaaca aaattatttc tacag 35

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtttaactt taataaggag gaaaatatat ggactacaat ctggcactcg 50

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgagctcggc cacgaagtgc tcaggcagag gcctcggcgc ga 42

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgatggcgaa gttagcgtag gtcatagctg tttcct 36

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcttttata ctcattacga gccggaagca taaag 35

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatggcgaag ttagcgtagg gcgcgcctgc aggtcgacaa gcttg 45

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtttgctctt ttatactcat gaattcggat cctggctgtg gtg 43

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgcttccggc tcgtaatgag tataaaagag caaacgttaa t 41

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cacagccagg atccgaattc atgagtataa aagagcaaac 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

accggccagg ctcatttatt tgcgtagtct gacctcttct 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agactacgca aataaatgag cctggccggt aaaaaaatcg 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgcccgtttt tgcatttaac gtcgattttt ttcatcataa 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaaaatcgac gttaaatgca aaaacgggcg atttatccgg 40

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

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cagctatgac ctacgctaac ttcgccatca gcgcc 35

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

caccacagcc aggatccgat aacttcgcca tcagcgcc 38