本發(fā)明涉及生物防控技術(shù)，具體涉及乳桿菌D8及其應(yīng)用，乳桿菌D8可以有效促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖分化，修復(fù)TNF-α誘導(dǎo)的損傷；口服動(dòng)物乳桿菌D8可以顯著改善腸炎癥狀。

背景技術(shù)：

1.乳桿菌的研究現(xiàn)狀及其免疫學(xué)作用

乳桿菌屬(Lactobacillus)在分類學(xué)上歸屬于硬菌門(Firmicutes)，桿菌綱(Bacilli)，乳桿菌目(lactobacillales)，乳桿菌科(lactobacillaceae)，是一種革蘭氏陽性桿菌，不形成芽抱，分解糖能夠產(chǎn)生乳酸。乳桿菌是人和動(dòng)物腸道的正常菌，與宿主營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、腸道黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)育都有著密切的關(guān)系。研究表明乳桿菌作為益生菌，在抑制腸道病原微生物的定植、促進(jìn)腸道健康等方面起重要作用；乳桿菌也可作為黏膜免疫佐劑，促進(jìn)黏膜免疫系統(tǒng)對抗原的反應(yīng)，以提高疫苗的作用效果。除此之外，乳桿菌還可以成為藥物和抗原分子的活載體。

乳桿菌可引導(dǎo)非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，刺激腸道免疫細(xì)胞，加強(qiáng)腸道自身的免疫系統(tǒng)功能，特別是增強(qiáng)巨唾細(xì)胞的功能，并通過刺激特異性免疫應(yīng)答，增加血清中IgA、IgG和IgM水平，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞成熟，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫，提高腸道免疫力和抗病力，抵抗腸道腫瘤、炎癥等疾病。研究證實(shí)約氏乳桿菌和雙歧乳桿菌在體外能增強(qiáng)吞唾細(xì)胞對大腸桿菌的吞嗟作用。乳桿菌的免疫促健康功能離不開其表面的配體和腸道上的受體，外源乳桿菌進(jìn)入腸道后，只有其表面物質(zhì)與腸上皮細(xì)胞表面的特異受體相結(jié)合，并通過信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，才能激活機(jī)體的免疫應(yīng)答。近年來研究證實(shí)，乳桿菌表面成分在增強(qiáng)宿主免疫中起著重要的作用，如脂碟壁酸(LTA)、細(xì)胞壁肽聚糖(PG)、細(xì)胞表面蛋白(S-protein)以及一些未知的細(xì)胞表面提取物。乳桿菌表面物質(zhì)作為配體被受體識(shí)別后激活免疫信號(hào)通路，產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子。有關(guān)乳桿菌表面蛋白在勝附腸道上皮中的作用研究得較多，而對于表面蛋白在免疫調(diào)節(jié)中的作用還知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)，約氏乳桿菌(L.johnsonii NCC533)細(xì)胞表面的熱應(yīng)激蛋白能夠促進(jìn)該菌對細(xì)胞和腸枯膜的牲附，并能促進(jìn)腸道上皮和巨嗟細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，slpA基因能促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的生成。脂磷壁酸(LTA)普遍存在于革蘭氏陽性細(xì)菌中，并大量存在于乳桿菌的細(xì)胞表面，不僅能夠介導(dǎo)細(xì)菌的枯附，還作為細(xì)胞表面受體的配體，與受體結(jié)合后刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫因子，如TNF-α和白細(xì)胞介素(IL-1)。研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中乳桿菌細(xì)胞壁肽聚糖能刺激巨噬細(xì)胞的成熟，并能誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，產(chǎn)生免疫學(xué)效應(yīng)。

2.腸道類器官的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用

腸類器官培養(yǎng)(organoid culture)是將腸上皮的單個(gè)干細(xì)胞或含有干細(xì)胞的隱窩分離出來，在體外進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)基中加入必要的生長因子(R-spondin1、Noggin和EGF等)，使單個(gè)Lgr5干細(xì)胞或者隱窩逐漸增殖分化為具有類似腸器官的結(jié)構(gòu)，通過類器官的生長出芽，體外模擬腸上皮的增殖分化過程，該結(jié)構(gòu)不但具有“腸腔”，還具有腸黏膜的各種功能細(xì)胞。其較為單一的微環(huán)境為不同因素對腸上皮的發(fā)育影響研究提供了一個(gè)便利的平臺(tái)，已經(jīng)逐漸成為人們探索腸的生長發(fā)育及腸炎腸癌最為有力的研究模型。這種類器官具有與正常腸道上皮類似的結(jié)構(gòu)與功能。目前小腸類器官培養(yǎng)技術(shù)己經(jīng)被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞、疾病模型W及再生藥物等相關(guān)研究。

目前，還沒有任何關(guān)于從健康豬群中分離出該乳桿菌D8分離鑒定的報(bào)道，也沒有任何關(guān)于體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立的報(bào)道，更沒有關(guān)于采用該乳桿菌D8探究乳桿菌的免疫學(xué)作用以及對腸黏膜的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種乳桿菌D8。該乳桿菌D8可以有效緩解腸炎?？梢杂行Т龠M(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖分化，修復(fù)TNF-α誘導(dǎo)的損傷；口服動(dòng)物乳桿菌D8可以顯著改善腸炎癥狀。

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供了一種體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供了體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法。

本發(fā)明所要解決的第四個(gè)技術(shù)問題是提供了乳桿菌D8或體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型在制備預(yù)防或治療腸道疾病藥物方面的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的第五個(gè)技術(shù)問題是提供了一種益生菌，所述益生菌包含所述的乳桿菌D8。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種乳桿菌D8，所述乳桿菌D8的分類命名為乳桿菌(Lactobacillus sp.)，于2016年10月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.13112；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。

本發(fā)明內(nèi)容還包括一種體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型，所述共培養(yǎng)模型是通過將分離得到的固有層淋巴細(xì)胞和腸道類器官混合培養(yǎng)，然后加入所述的乳桿菌D8構(gòu)建形成的體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

本發(fā)明內(nèi)容還包括體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)腸道類器官的分離培養(yǎng)；

2)固有層淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)；

3)乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立。

其中，上述的步驟3)中固有層淋巴細(xì)胞和腸道類器官的體積比為3:1～10:1。

作為優(yōu)選，本發(fā)明的步驟3)中固有層淋巴細(xì)胞和腸道類器官的體積比為7:1。

其中，上述的步驟3)中的乳桿菌為乳桿菌D8，所述乳桿菌D8加入量為每孔1×10³CFU～1×10⁴CFU。

作為優(yōu)選，本發(fā)明的步驟3)中的乳桿菌為乳桿菌D8，所述乳桿菌D8加入量為每孔1×10⁴CFU。

本發(fā)明的乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的構(gòu)建具體步驟參見具體實(shí)施例方式中的實(shí)施例2～4。

本發(fā)明內(nèi)容還包括所述的乳桿菌D8或所述的體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型在制備預(yù)防或治療腸道疾病藥物方面的應(yīng)用。

其中，上述腸道疾病為腸炎或結(jié)腸炎。

其中，上述藥物劑型為片劑、膠囊、緩釋片、控釋片、口服液、糖漿、滴丸、注射液劑型或凍干粉針劑型中的一種。

本發(fā)明內(nèi)容還包括一種益生菌，所述益生菌包含所述的乳桿菌D8。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的特色和優(yōu)點(diǎn)：

1)本發(fā)明首次分離鑒定獲得了乳桿菌D8；該菌株的特點(diǎn)：革蘭氏染色陽性，呈桿狀；口服乳桿菌D8可以顯著提高小腸絨毛的長度和小腸隱窩的深度，降低腸炎癥狀；

2)本發(fā)明首次構(gòu)建了一種體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型；該模型可以用來探究乳桿菌的免疫學(xué)作用以及對腸黏膜的作用；乳桿菌D8可以有效促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖分化進(jìn)而維護(hù)腸黏膜屏障的完整性，提升腸道黏膜免疫水平。

3)本發(fā)明首次證明了乳桿菌D8可以有效促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖分化，修復(fù)TNF-α誘導(dǎo)的損傷。

4)本發(fā)明分離得到的乳桿菌D8直接飼喂動(dòng)物，可以減輕動(dòng)物腸炎癥狀，維護(hù)腸道健康；該菌有望開發(fā)成預(yù)防腸炎的益生菌。

附圖說明

圖1：乳桿菌D8光學(xué)顯微鏡革蘭氏染色觀察圖；

圖2：體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型光學(xué)顯微鏡觀察圖；a：乳桿菌(D8)-腸道類器官(intestinal organoids)-固有層淋巴細(xì)胞(LPLs)共培養(yǎng)模型模式圖；b：光學(xué)顯微鏡下乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型照片；c：乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型中腸道類器官1到6天生長發(fā)育光學(xué)顯微鏡觀察圖；

圖3：乳桿菌D8能夠促進(jìn)腸道類器官生長，改善由TNF-α引起的腸道類器官損傷；Ctrl：陰性對照，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做任何處理；乳桿菌D8組：每孔加1×10⁴CFU乳桿菌D8；TNF-α損傷組：每孔加入30ng的TNF-α；乳桿菌D8修復(fù)組(D8+TNF-α)：每孔先加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后加入1×10⁴CFU乳桿菌D8；

圖4：乳桿菌D8能夠提高腸道類器官BrdU陽性細(xì)胞面積；分組同圖3；

圖5：乳桿菌D8能夠提高腸道類器官Ki67陽性細(xì)胞面積；分組同圖3；

圖6：乳桿菌D8能夠提高空腸隱窩深度和絨毛高度，改善DSS引起的小腸黏膜損傷；Ctrl：陰性對照，每天灌胃100ul的PBS；D8：小鼠每天灌胃1×10⁸CFU乳桿菌D8，連續(xù)飼喂27天；DSS：飼喂的第21天在飲水中添加質(zhì)量百分比5％的葡聚糖硫酸鈉(DSS)；D8+DSS：對小鼠每天灌胃1×10⁸CFU乳桿菌D8，連續(xù)飼喂27天，在第21天的飲水中添加質(zhì)量百分比5％的葡聚糖硫酸鈉(DSS)；

圖7：小鼠口服乳桿菌D8后結(jié)腸炎的組織病理癥狀減輕；飼喂磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH＝7.4)的小鼠用DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，表現(xiàn)出明顯的組織病理變化；上皮細(xì)胞脫落，黏膜下和腸腔中出血，黏膜下和固有層炎性細(xì)胞浸潤，腸壁增生變厚；飼喂乳桿菌D8后腸炎組織病理變化明顯減輕；無明顯可見出血點(diǎn)和炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞較為完整，腸壁無明顯增生；分組同圖6；

圖8：小鼠口服乳桿菌D8后結(jié)腸炎癥狀減輕。表現(xiàn)為結(jié)腸長度增加，出血減輕；分組同圖6；

圖9：乳桿菌D8能夠促進(jìn)共培養(yǎng)模型分泌白細(xì)胞介素22(IL-22)；Ctrl：陰性對照；乳桿菌D8組：每孔加1×10⁴CFU乳桿菌D8；TNF-α損傷組：每孔加入30ng的TNF-α；乳桿菌D8修復(fù)組(D8+TNF-α)：先加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后加入1×10⁴CFU乳桿菌D8；

圖10：乳桿菌D8能夠刺激共培養(yǎng)模型分泌IL-22改善由TNF-α引起的腸道類器官損傷；Ctrl：陰性對照；TNF-α損傷組：每孔加入30ng的TNF-α；乳桿菌D8修復(fù)組(D8+TNF-α)：先加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后加入1×10⁴CFU乳桿菌D8共同培養(yǎng)；IL-22抗體中和組：先加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后，同時(shí)加入1×10⁴CFU乳桿菌D8和白細(xì)胞介素22中和抗體(anti-IL-22)(Sigma，美國)共同培養(yǎng)。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例和附圖對本發(fā)明進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)試劑和常規(guī)方法。

實(shí)施例1 乳桿菌D8的分離鑒定

1.1樣品的來源與菌株的初步篩選

樣品來自30日齡杜洛克小豬，購買于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，仔豬屠宰后打開腹腔，用滅菌棉繩將十二指腸的兩頭扎好，剪斷后立即放入預(yù)冷的生理鹽水中，30min內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室作菌種分離，分菌操作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，用無菌剪刀將腸段縱向剪開，接著用無菌PBS緩沖液沖洗腸表面的內(nèi)容物，然后用刀片輕輕刮取腸壁黏膜約0.5g左右，放置裝有玻璃珠的三角錐瓶內(nèi)充分振蕩，室溫靜置2-3min后，取100μl懸液涂布MRS瓊脂培養(yǎng)基(pH 5.8)表面，37℃燭缸培養(yǎng)24-36h。樣品挑選疑似菌落進(jìn)行革蘭氏染色，如圖1所示乳桿菌D8的光學(xué)顯微鏡觀察圖。

1.2乳桿菌屬特異PCR鑒定

挑選初步篩選的菌株，加入MRS培養(yǎng)基(乳桿菌選擇性培養(yǎng)基，購買于青島海博生物，中國)擴(kuò)增培養(yǎng)后，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，中國)提取細(xì)菌基因組，用一對乳桿菌屬16s通用引物P1和P2將提取的細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

P1:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

P2:GGTTACCTTGTTACGACTT(該序列參見序列表中的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)

以上引物由南京金斯瑞公司合成，反應(yīng)采用25μl體系(12.5μl BU-Taq 2×Master PCR mix(Takara，中國)，2μl模板DNA(細(xì)菌基因組)，上下游引物各1μl，9.5μl ddH2O)在Biometra PCR儀(Bio-Rad，美國)進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，94℃30s，72℃1min，共執(zhí)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸15min。反應(yīng)產(chǎn)物測序所得的SEQ ID NO:1序列經(jīng)過Blast比對，發(fā)現(xiàn)與Lactobacillus reuteri strain CTI0324-RS-018 16S ribosomal RNA gene,partial sequence(GenBank：KU754503.1)相似性達(dá)到99％，從而確定為乳桿菌D8，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.13112。

實(shí)施例2 體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

2.1腸道類器官的分離培養(yǎng)

2.1.1小鼠購買于揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，四周齡C57小鼠，取小腸約15cm，縱向剖開后，用預(yù)冷的加有質(zhì)量百分比為1％青霉素和質(zhì)量百分比為1％鏈霉素的無菌PBS緩沖溶液清洗數(shù)次；

2.1.2將洗凈的小腸剪成3-5mm左右的片段，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管內(nèi)，加入10mL的20mM預(yù)冷的EDTA，冰上消化20min，用移液槍吸取液體丟棄，保留小腸組織；

2.1.3在小腸組織中加入預(yù)冷的PBS，用移液槍輕柔持續(xù)吹打，并及時(shí)通過光學(xué)顯微鏡鏡檢，棄去含有大量絨毛的上清，直至視野中出現(xiàn)大量小腸隱窩，開始收集上清；

2.1.4將帶有小腸隱窩的上清用70μM細(xì)胞過濾器過濾，上清液用800rpm，4℃離心5min收集沉淀；

2.1.5用預(yù)冷的PBS重懸沉淀，再用600rpm離心、收集，反復(fù)3-4次直至洗凈多余的絨毛碎片得到小腸隱窩；

2.1.6用50μl Matrigel基質(zhì)膠(Corning，美國)重懸小腸隱窩，混合均勻后接種到24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)孔中央；待Matrigel凝固后添加DMEM/F-12培養(yǎng)基(每孔加入500μl)(Gibco，美國)，每孔培養(yǎng)基中加入0.25μl(濃度為100μg/mL)的重組小鼠的EGF(Peprotech，美國)、每孔培養(yǎng)基中加入1μl(濃度為50μg/ml)的重組小鼠的Noggin(Peprotech，美國)和每孔培養(yǎng)基中加入1μl(濃度為250μg/ml)的重組人的R-spondin(Peprotech，美國)，隔天換液；即培養(yǎng)獲得腸道類器官(intestinal organoids)(包含腸干細(xì)胞等各種類型的3D立體培養(yǎng)模型)。

2.2固有層淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.2.1在無Ca²⁺、Mg²⁺的100ml的Hanks平衡液(源培，中國)中加入5g牛血清白蛋白(Sigma，美國)，58mg EDTA，15.4mg二硫蘇糖醇(Sigma，美國)，配制分離液。在100mlPBS中加入5g牛血清白蛋白，0.15gⅧ型膠原酶(Sigma，美國)，100U的DNaseⅠ(Sigma，美國)，于37℃下孵育5min，配制消化液。Percoll細(xì)胞分離液(聯(lián)科，中國)與10×PBS按體積比9：1混合，配制100％等滲Percoll母液。用Percoll母液，DMEM高糖溶液和FCS分別按體積比8：1：1和4：5：1混合，配制80％等滲Percoll溶液和40％等滲Percoll溶液。

2.2.2頸椎脫臼法處死小鼠，立即取出約7-8cm結(jié)腸和回腸組織，置于預(yù)冷不含鈣、鎂PBS(PBS^-/-)中，去除脂肪、腸系膜結(jié)締組織及小腸的集合淋巴結(jié)；沿腸系膜一側(cè)將腸管縱向剖開，在不含鈣鎂預(yù)冷PBS中輕輕漂洗，直至糞便完全漂洗干凈，橫向切成約0.5-1.0cm的腸組織片段。

2.2.3將腸組織片段移入50ml離心管中，加入5ml分離液，置于恒溫振蕩箱中，于37℃下震蕩(250r/min)15min；置于旋渦混合器上，渦旋30s，然后將渦旋后的腸組織片段通過100μm尼龍濾網(wǎng)過濾，此時(shí)濾液為腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞；將過濾后的腸組織片段重新移入50ml離心管中，加入5ml分離液，重復(fù)上述震蕩、渦旋和過濾步驟。

2.2.4將過濾處理后的腸組織片段移入新的50ml離心管中，加入5ml消化液，置于恒溫振蕩箱中，于37℃下震蕩(250r/min)45min；置于旋渦混合器上，渦旋30s，將渦旋后的腸組織片段通過100μm尼龍濾網(wǎng)過濾，收集濾液于15ml離心管中，于4℃下離心(400g)10min，棄去上清液，此時(shí)沉淀包含固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria lymphocytes，LPLs)。

2.2.5將80％等滲Percoll溶液4ml鋪于新的15ml離心管底部；用40％等滲Percoll溶液8ml重懸上述沉淀，充分吹打均勻后鋪在80％等滲Percoll溶液上，將離心管傾斜180度使液體緩慢沿著管壁加入，兩層液體間可見清晰的分界面；在20℃下行零加減速密度梯度離心(500×g)20min；棄去上層液體至剩余體積為7ml，吸出兩層界面間的不透明細(xì)胞層，移入新的15ml離心管中，加入PBS^-/-至體積為15ml，充分混勻后，于4℃下離心(400×g)8min，棄去上清液，用5ml含質(zhì)量百分比為10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸沉淀，充分吹打均勻制備細(xì)胞懸液即得固有層淋巴細(xì)胞。

2.3乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)將分離得到的固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria lymphocytes)和腸道類器官(intestinal organoids)按照體積比為7：1的比例進(jìn)行混合(具體量是7μl固有層淋巴細(xì)胞和1μl腸道類器官)，加入Matrigel基質(zhì)膠(每孔50μl)重懸，鋪于24孔板中，每孔加入50μl Matrigel基質(zhì)膠，待Matrigel凝固后每孔中加入500μl的DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco，美國)(含有25ng的重組小鼠的EGF、50ng的重組小鼠的Noggin和125ng的重組人的R-spondin)，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。需要乳桿菌處理組每孔加入1×10⁴CFU的乳桿菌D8，構(gòu)建出一種體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型，探究乳桿菌的免疫學(xué)作用以及對腸黏膜的作用。如圖2所示。

實(shí)施例3 體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

與實(shí)施例2基本一致，所不同的在于，固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria lymphocytes)和腸道類器官(intestinal organoids)按照體積比為3：1的比例進(jìn)行混合(具體量是3μl固有層淋巴細(xì)胞和1μl腸道類器官)，加入(每孔50μl)Matrigel重懸，鋪于24孔板中，每孔加入50μl Matrigel，待Matrigel凝固后每孔中加入500μl的DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco，美國)(含有25ng的重組小鼠的EGF、50ng的重組小鼠的Noggin和125ng的重組人的R-spondin)，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。需要乳桿菌處理組每孔加入1×10³CFU的乳桿菌D8，構(gòu)建出一種體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

實(shí)施例4 體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

與實(shí)施例2基本一致，所不同的在于，固有層淋巴細(xì)胞(lamina propria lymphocytes)和腸道類器官(intestinal organoids)按照體積比為10：1的比例進(jìn)行混合(具體量是10μl固有層淋巴細(xì)胞和1μl腸道類器官)，加入(每孔50μl)Matrigel重懸，鋪于24孔板中，每孔加入50μl Matrigel，待Matrigel凝固后每孔中加入500μl的DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco，美國)(含有25ng的重組小鼠的EGF、50ng的重組小鼠的Noggin和125ng的重組人的R-spondin)，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。需要乳桿菌處理組每孔加入1×10³CFU的乳桿菌D8，構(gòu)建出一種體外乳桿菌-腸道類器官-固有層淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

實(shí)施例5 檢測乳桿菌D8對腸道類器官的作用

實(shí)驗(yàn)組分為四組。對照組(圖3中Ctrl組)，乳桿菌D8組(圖3中D8組)，TNF-α損傷組(圖3中TNF-α組)，TNF-α引起損傷加入乳桿菌修復(fù)組(圖3中D8+TNF-α組)。乳桿菌D8組是往實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型每孔中加入1×10⁴CFU乳桿菌D8，持續(xù)作用24h以上；TNF-α組是往實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型中每孔加入30ng的TNF-α，持續(xù)作用24h；TNF-α引起損傷加入乳桿菌D8修復(fù)組往實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型先每孔加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后加入1×10⁴CFU乳桿菌D8，持續(xù)作用24h以上；對照組是實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，不做任何處理。普通光學(xué)顯微鏡觀察各組腸道類器官的表面積，發(fā)芽率以及損傷程度。分別通過BrdU和Ki67免疫熒光染色觀察腸道類器官的增值情況。

5.1普通顯微鏡觀察腸道類器官形態(tài)指數(shù)變化

將腸道類器官直接放置于顯微鏡鏡下觀察腸道類器官的表面積，發(fā)芽率以及損傷程度。發(fā)現(xiàn)乳桿菌D8能夠促進(jìn)腸道類器官生長，提升腸道類器官的表面積以及發(fā)芽率，改善由TNF-α引起的腸道類器官損傷。如圖3所示。

5.2 BrdU和Ki67免疫熒光染色觀察腸道類器官的增值情況

BrdU染色前2h每孔加入300μl的BrdU染料(終濃度為30μg/L)作用2h。棄去上清，4％的甲醛4℃固定過夜。1×PBS洗3次，每次10min。0.4％Triton X-100透化5分鐘；1×PBS洗3次，每次10min；質(zhì)量百分比為5％BSA室溫封閉30min；分別加入Brdu的一抗(Arigo，中國臺(tái)灣)或者Ki-67抗體(Arigo，中國臺(tái)灣)(用1％BSA稀釋1:100)放在濕盒里，4度過夜；1×PBS洗3次，每次10min；分別加入100μl熒光標(biāo)記的Brdu二抗(用1％BSA稀釋1:200)或100μl熒光標(biāo)記的Ki-67二抗(聯(lián)科，中國)(用1％BSA稀釋1:200)30分鐘，閉光；1×PBS洗3次，每次10min。用共聚焦顯微鏡(Zeiss)觀察腸道類器官染色情況。發(fā)現(xiàn)乳桿菌D8能夠提高腸道類器官BrdU和Ki67陽性細(xì)胞面積。如圖4和圖5所示。乳酸桿菌組相較于對照組，腸道類器官BrdU和Ki67陽性細(xì)胞面積分別提升50.8％和34.4％。乳酸桿菌修復(fù)組相較于損傷組，腸道類器官BrdU和Ki67陽性細(xì)胞面積分別提升118.2％和146.3％。

實(shí)施例6 檢測口服乳桿菌D8后對小鼠小腸以及結(jié)腸炎的影響

對小鼠每天灌胃1×10⁸CFU乳桿菌D8，連續(xù)飼喂21天后在飲水中添加質(zhì)量百分比為5％葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎。7天后頸椎脫臼處死小鼠觀察結(jié)腸長度變化，并對空場、結(jié)腸進(jìn)行HE染色，評價(jià)隱窩深度絨毛高度以及組織病理變化。

發(fā)現(xiàn)乳桿菌D8能夠提高空腸隱窩深度和絨毛高度，改善DSS引起的小腸黏膜損傷。Ctrl：陰性對照，每天灌胃100μl的PBS；D8：小鼠每天灌胃1×10⁸CFU乳桿菌D8，連續(xù)飼喂27天；DSS：飼喂的第21天在飲水中添加質(zhì)量百分比5％的葡聚糖硫酸鈉(DSS)；D8+DSS：對小鼠每天灌胃1×10⁸CFU乳桿菌D8，連續(xù)飼喂27天，在第21天的飲水中添加質(zhì)量百分比5％的葡聚糖硫酸鈉(DSS)；如圖6所示。乳桿菌D8組相較于PBS對照組，小腸絨毛高度提升35.7％左右，隱窩深度提升33.4％左右。乳桿菌D8修復(fù)組相較于DSS損傷組，小腸絨毛高度提升83.2％左右，隱窩深度增加21.4％左右。如圖6所示，小鼠口服乳桿菌D8后結(jié)腸炎的組織病理癥狀減輕。損傷組小鼠飼喂DSS后，表現(xiàn)出明顯的腸炎組織病理變化：上皮細(xì)胞脫落，黏膜下和腸腔中出血，黏膜下和固有層炎性細(xì)胞浸潤，腸壁增生變厚。乳酸桿菌修復(fù)組飼喂乳桿菌D8后腸炎組織病理變化明顯減輕：無可見出血點(diǎn)和炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞較為完整，腸壁無明顯增生。如圖7所示。小鼠口服乳桿菌D8后結(jié)腸炎癥狀減輕：表現(xiàn)為結(jié)腸長度增加，出血減輕。如圖8所示。乳酸桿菌組相較于對照組，結(jié)腸長度無變化。乳酸桿菌修復(fù)組相較于損傷組，結(jié)腸長度提升33.3％左右。

實(shí)施例7 乳桿菌D8刺激共培養(yǎng)模型分泌IL-22改善腸炎癥狀

7.1乳桿菌D8能夠促進(jìn)共培養(yǎng)模型分泌IL-22

實(shí)驗(yàn)組分為四組。對照組(圖9中Ctrl組)，乳桿菌D8組(圖9中D8組)，TNF-α損傷組(圖9中TNF-α組)，TNF-α引起損傷加入乳桿菌修復(fù)組(圖9中D8+TNF-α組)。乳桿菌D8組是往實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型每孔中加入1×10⁴CFU乳桿菌D8，持續(xù)作用24h以上；TNF-α損傷組是往實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型中每孔加入30ng的TNF-α，持續(xù)作用24h；TNF-α引起損傷加入乳桿菌D8修復(fù)組往實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型先每孔加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后加入1×10⁴CFU乳桿菌D8，持續(xù)作用24h以上；對照組不做任何處理，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集上清，應(yīng)用ELISA試劑盒(eBioscience，美國)檢測培養(yǎng)液中IL-22濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌D8能夠顯著提高腸類器官上清中IL-22濃度。相對于對照組中IL-22濃度為198pg/ml，乳桿菌D8組中IL-22濃度為2253pg/ml，顯著增加10.3倍。相對于TNF-α損傷組中IL-22濃度為980pg/ml，乳桿菌修復(fù)組中IL-22濃度為1230pg/ml，顯著提高了25.5％。

7.2乳桿菌D8能夠刺激共培養(yǎng)模型分泌IL-22改善腸道類器官損傷

實(shí)驗(yàn)組分為四組。對照組(圖10中Ctrl組)，TNF-α損傷組(圖10中TNF-α組)：每孔加入30ng的TNF-α；乳桿菌D8修復(fù)組(圖10中的D8+TNF-α)：每孔先加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后加入1×10⁴CFU乳桿菌D8共同培養(yǎng)；IL-22抗體中和組(圖10中的D8+TNF-α+anti-IL-22)：每孔先加入30ng的TNF-α作用6h引起損傷后，同時(shí)加入1×10⁴CFU乳桿菌D8和白細(xì)胞介素22中和抗體(每孔加2.5ng)(anti-IL-22)(Sigma，美國)共同培養(yǎng)；對照組不做任何處理，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)TNF-α可誘導(dǎo)78.1％的腸類器官死亡，IL-22抗體中和組中腸類器官死亡率為80.8％。相對于TNF-α損傷組，乳桿菌D8修復(fù)組中腸類器官死亡率僅為20.2％，腸類器官死亡率下降達(dá)57.9％。結(jié)果證實(shí)乳桿菌D8可以刺激實(shí)施例2構(gòu)建的共培養(yǎng)模型分泌IL-22，維護(hù)腸類器官的完整性。

上述僅為本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，這里無需也無法對所有的實(shí)施例來舉例說明。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這些也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 乳桿菌D8及其應(yīng)用

<130> SG2017001

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1424

<212> DNA

<213> Lactobacillus

<400> 1

aatggttagg ccaccgactt tgggcgttac aaactcccat ggtgtgacgg gcggtgtgta 60

caaggcccgg gaacgtattc accgcggcat gctgatccgc gattactagc gattccgact 120

tcgtgtaggc gagttgcagc ctacagtccg aactgagaac ggctttaaga gattagctta 180

ctctcgcgag cttgcgactc gttgtaccgt ccattgtagc acgtgtgtag cccaggtcat 240

aaggggcatg atgatctgac gtcgtcccca ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctca 300

ctagagtgcc caacttaatg ctggcaacta gtaacaaggg ttgcgctcgt tgcgggactt 360

aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cgaccatgca ccacctgtca ttgcgtcccc 420

gaagggaacg ccttatctct aaggttagcg caagatgtca agacctggta aggttcttcg 480

cgtagcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg 540

agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg cggagtgctt aatgcgttag ctccggcact 600

gaagggcgga aaccctccaa cacctagcac tcatcgttta cggcatggac taccagggta 660

tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga gcctcagcgt cagttgcaga ccagacagcc 720

gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc tacgcattcc accgctacac atggagttcc 780

actgtcctct tctgcactca agtcgcccgg tttccgatgc acttcttcgg ttaagccgaa 840

ggctttcaca tcagacctaa gcaaccgcct gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggat 900

aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt gactttctgg 960

ttggataccg tcactgcgtg aacagttact ctcacgcacg ttcttctcca acaacagagc 1020

tttacgagcc gaaacccttc ttcactcacg cggtgttgct ccatcaggct tgcgcccatt 1080

gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtatgga ccgtgtctca gttccattgt 1140

ggccgatcag tctctcaact cggctatgca tcatcgcctt ggtaagccgt taccttacca 1200

actagctaat gcaccgcagg tccatcccag agtgatagcc aaagccatct ttcaaacaaa 1260

agccatgtgg cttttgttgt tatgcggtat tagcatctgt ttccaaatgt tatcccccgc 1320

tccggggcag gttgcctacg tgttactcac ccgtccgcca ctcactggtg atccatcgtc 1380

aatcaggtgc aagcaccatc aatcagttgg gccagtgcgt acga 1424

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物P1

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 下游引物P2

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19