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一株改善肝功能的植物乳桿菌ZY001及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11230024閱讀:575來源:國知局
本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域
。更具體地,本發(fā)明涉及一株改善肝功能的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum,l.plantarum)zy001及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
:新疆喀什地區(qū)具有優(yōu)越的草資源條件和種植業(yè)豐富的秸稈資源,擁有驢品種、數(shù)量資源優(yōu)勢,為驢產(chǎn)業(yè)發(fā)展創(chuàng)造了得天獨(dú)厚的條件。2008年,新疆驢被列為國家級畜禽遺傳資源保護(hù)品種。驢奶作為驢養(yǎng)殖業(yè)的主要副產(chǎn)品之一,不僅具有較高的營養(yǎng)價值,而且具有較廣泛的藥用價值。其它奶源相比,驢奶是一種低脂肪、低膽固醇、高鈣、富硒、美容、抗衰老的天然乳品,驢奶中各營養(yǎng)成分的比例最為接近人乳。驢奶中含有大量的表皮細(xì)胞生長因子(egf),egf能增強(qiáng)人體的免疫力、抵抗力;可以促進(jìn)上皮細(xì)胞營養(yǎng)代謝,保護(hù)皮膚及預(yù)防皮膚由于各種原因?qū)е碌膿p失,有促進(jìn)皮下膠原細(xì)胞再生功能。國內(nèi)外臨床研究表明,益生乳酸菌可逆轉(zhuǎn)腸內(nèi)菌群失衡,當(dāng)腸道粘膜組織受損嚴(yán)重,增加富含修復(fù)腸上皮細(xì)胞的特殊營養(yǎng)物質(zhì),如多糖類益生元,藥食同源功能組分等,對恢復(fù)腸道功能有確切的增益作用,可減少腸源性感染和器官功能衰竭的發(fā)生率,是扭轉(zhuǎn)疾病急性轉(zhuǎn)危的關(guān)鍵環(huán)節(jié),從而降低病死率;同時可減少抗生素的使用與住院時間,降低醫(yī)療費(fèi)用,微生態(tài)營養(yǎng)治療已為疾病治療打開一扇新窗口。植物乳桿菌是乳酸菌的一種,常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中,在食品、青貯飼料及醫(yī)療保健等領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。該菌株屬于同型發(fā)酵乳酸菌,能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、l-山梨糖、乳糖、纖維二糖、木糖、蜜二糖、果糖、核糖、葡萄糖酸鈉產(chǎn)酸,但發(fā)酵葡萄糖和葡萄糖酸鈉均不產(chǎn)氣。利用該菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸處理乳清中乳糖轉(zhuǎn)化時,具有其他菌種無法比擬的優(yōu)越性,它既可以高轉(zhuǎn)化率地利用乳糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖,又可以利用乳清中殘留蛋白質(zhì)。本發(fā)明的特色是:1、菌種來源于新疆喀什地區(qū),從新疆土法驢酸奶中分離得到的乳酸菌;2、植物乳桿菌作為人體腸道中的益生菌群,具有維持腸道內(nèi)菌群平衡,提高機(jī)體免疫力和改善肝功能等多種功能;3、cn104770469a提供的產(chǎn)品方案為以純驢奶或加入其他不含酪蛋白的天然產(chǎn)物提取物水溶液的驢奶為原料發(fā)酵生產(chǎn)酸奶制品,其中由于驢奶酪蛋白含量低的原因不能實(shí)現(xiàn)酸奶的制備,可歸為乳酸飲料的一種。本發(fā)明的酸奶制備過程是以植物乳桿菌或植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以1~3∶1~2∶1配比配制發(fā)酵種子,接種至驢奶∶牛奶=2~4∶8~6的混合乳原料中,發(fā)酵獲得凝乳型驢奶發(fā)酵乳產(chǎn)品。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一株改善肝功能的植物乳桿菌(lactobacillusplantarum,l.plantarum)zy001。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的植物乳桿菌zy001在發(fā)酵乳中的應(yīng)用。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一株植物乳桿菌zy001,該菌株已于2016年09月02日在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏號分別為cgmcc13505。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式,所述的乳類發(fā)酵制品是發(fā)酵乳。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式,植物乳桿菌zy001及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用制備步驟如下:(1)從新疆土法驢酸奶中分離得到乳酸菌zy001,經(jīng)鑒定是植物乳桿菌,即植物乳桿菌zy001;(2)以驢奶和牛奶混合乳為原料,接種植物乳桿菌zy001發(fā)酵獲得單菌驢奶發(fā)酵乳;(3)以單菌驢奶發(fā)酵乳灌胃酒精肝損傷sd大鼠,測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)含量,確定植物乳桿菌zy001改善肝功能的功效;(4)將植物乳桿菌zy001、鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以1~3∶1~2∶1配比配制發(fā)酵種子,接種至驢奶∶牛奶=2~4∶8~6的原料中,發(fā)酵獲得驢奶發(fā)酵乳產(chǎn)品。步驟(2)中所述的發(fā)酵溫度為42℃,發(fā)酵終點(diǎn)為ph4.0,即凝乳時間;步驟(3)中所述動物模型每組10只,分別為空白組、生理鹽水對照組、植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳實(shí)驗(yàn)組及混合乳組;給予方式為灌胃;以自動血液生化分析儀測定生化指標(biāo)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)的活性。本發(fā)明方案的實(shí)施,至少具有以下優(yōu)勢:根據(jù)本發(fā)明方法,發(fā)酵菌種分離于肝病發(fā)病率較低的新疆喀什地區(qū)的土菌發(fā)酵驢奶,經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),該菌具有一定的改善肝功能功效。本發(fā)明的應(yīng)用主原料之一為驢奶,驢奶具有增強(qiáng)免疫力,美容、抗衰老的功效,經(jīng)植物乳桿菌zy001發(fā)酵后,更易被人體吸收、代謝,發(fā)酵產(chǎn)品具備驢奶和植物乳桿菌zy001的雙重功效。與cn106190930a不同的是本發(fā)明提供的菌種為自行分離的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的菌種,已進(jìn)行專利保藏;與cn104770469a相比,本發(fā)明提供的產(chǎn)品為真正意義上的發(fā)酵乳品,呈凝乳狀。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步對本發(fā)明作詳細(xì)描述,以使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚。以下實(shí)施例僅用于舉例說明,并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1植物乳桿菌zy001是從新疆牧民家庭自然發(fā)酵酸驢奶中分離、篩選出的一株具有優(yōu)良發(fā)酵特性的植物乳桿菌。將zy001劃線接種至mrs瓊脂培養(yǎng)基,42℃培養(yǎng)24h,在該條件下進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)25代,未見顯著性變異。挑取zy001菌落,畫線接種于mrs液體培養(yǎng)基上,在溫度37℃與厭氧的條件下培養(yǎng)48h;待菌落形成后,以1%的接種量接種mrs液體培養(yǎng)基,37℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24h;再次畫線于mrs瓊脂培養(yǎng)基上,確認(rèn)其為純培養(yǎng)物后穿刺于mrs半固體培養(yǎng)基上,4℃下保存。觀察記錄純培養(yǎng)物的菌落形態(tài)、革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)特征,并進(jìn)行常規(guī)的接觸酶和氧化酶實(shí)驗(yàn)。將革蘭氏陽性、接觸酶和氧化酶試驗(yàn)陰性和細(xì)胞形態(tài)呈桿狀的菌株暫時命名為乳桿菌。該菌株在mrs培養(yǎng)基上形成淺黃色的圓形菌落凸起,表面光滑,細(xì)密,在顯微鏡下觀測的細(xì)胞多為細(xì)長桿狀。本發(fā)明使用的mrs瓊脂培養(yǎng)基由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸合硫酸鎂、20g葡萄糖、1ml吐溫80、5g蘭水合乙酸納、2g三水合磷酸氫二鉀、0.58g七水合硫酸鎂、0.25g一水合硫酸錳、6g瓊脂與1000ml蒸餾水組成,其ph6.2-6.6。本發(fā)明使用的mrs液體培養(yǎng)基是由10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母膏、2g檸檬酸氫二胺、20g葡萄糖、1ml吐溫80、5g三水合乙酸納、2g三水合磷酸氫二鉀、0.58g七水合硫酸鎂、0.25g一水合硫酸錳與1000ml蒸餾水組成,其ph6.2-6.6。以mrs液體培養(yǎng)基重量計(jì)2%的接種量,將分離純化的菌種在37℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng),接著對菌種培養(yǎng)物進(jìn)行碳水化合物產(chǎn)酸(api50ch)反應(yīng),鑒定菌種的理化性質(zhì)。用試劑盒提取菌種dna,設(shè)計(jì)16srdna和phes基因序列的引物并進(jìn)行pcr反應(yīng)及測序。經(jīng)過16srdna和phes基因序列同源性比對,所述菌株與lactobacillusplantarumwcfs1(sequenceid:nc_004567.2)有99%的同源性。經(jīng)過對多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的綜合分析,鑒定菌株zy001為植物乳桿菌。表1為菌種zy001細(xì)胞形態(tài)和生理生化鑒定結(jié)果。實(shí)施例2:將活化的植物乳桿菌zy001接種于mrs液體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24h,以4%接種量接種純牛奶,42℃靜置培養(yǎng)至凝乳,充分?jǐn)嚢韬?,取凝乳發(fā)酵液以4%接種量接種至驢奶∶牛奶=3∶7的混合乳中,42℃培養(yǎng)至凝乳,獲得植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳,凝乳時間為12h,凝乳時ph為4.0。獲得植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳及配置的未發(fā)酵的混合乳用于后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3:大鼠建酒精性肝損傷模型將40只sd大鼠(雌雄各半)機(jī)分為模型組和空白組,體重180-200g,在溫度22-24℃,濕度30-40%,光照和黑暗時間為12h的環(huán)境中飼養(yǎng),正常對照組與模型組動物一樣給予基礎(chǔ)飲食,模型組按0.2ml/100g體質(zhì)量的劑量灌胃50%的乙醇溶液12ml/kg*bw,每天1次;正常對照組給予等體積蒸餾水,持續(xù)30天后,以自動血液生化分析儀測定生化指標(biāo)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)的活性。將建模成功的sd大鼠隨機(jī)分組,每組10只,分別為空白組、生理鹽水對照組、植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳實(shí)驗(yàn)組及混合乳組;給予方式為灌胃,灌胃量5ml/次,每日2次,2周后以自動血液生化分析儀測定生化指標(biāo)血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alt)的活性,結(jié)果見表2。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以單菌驢奶發(fā)酵乳灌胃乙醇肝損傷sd大鼠,可顯著改善ast和alt的表達(dá),由此可見,植物乳桿菌zy001具備改善肝功能的功效。實(shí)施例4:驢奶發(fā)酵乳的制備以驢奶和牛奶混合乳為原料,底物配比2∶8,3∶7,4∶6。分別活化培養(yǎng)公司前期保存鼠李糖乳桿菌、嗜熱鏈球菌以及植物乳桿菌zy001,將三種菌于mrs培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h后,4%接種于無菌純牛奶,42℃靜置培養(yǎng)至凝乳后按植物乳桿菌zy001、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌=1∶1∶1,1∶2∶1,2∶1∶1,2∶2∶1;3∶1∶1,3∶2∶1各種配比接種驢奶牛奶混合乳(2-4∶8-6),42℃靜置培養(yǎng)至凝乳,獲得不同配比的驢奶發(fā)酵乳產(chǎn)品。表1菌種zy001細(xì)胞形態(tài)和理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表注:+表示陰性反應(yīng);-表示陰性反應(yīng)。圖1菌種zy00116srdna基因序列測序結(jié)果atacatgcagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagcttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagttatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgcctaaggtgggacagatgattagggtgaagtcgtaacaag圖2菌種zy001phes基因序列測序結(jié)果aagacgtgctactacgcacgcagacgtctgctgatcagccgcggtcacttgaaaatcacgatttttctaaaggaccgctgaaggtcttgtcacctggccgcgtttatcggcgtgatacggatgatgcaacccattcccatcaatttcatcaaattgaagggttagtcgtggacaagcatattacgatggctgatttgaagggcaccttaattctggttgccaagactttgtttggcgatcaattcgagtttcggctacggccaagcttctttccattcacggaaccatccgtagaagctgatgtaacttgctttaattgcaatggcaagggctgtgcaatctctaagcaaacgggttggatcgaagtactgggtgccggcatggttcacccccacgtgttagaaatgtctggcattgatccagaagaatatggtggctttgctttcgggcctagg表2發(fā)酵乳對酒精性肝損傷大鼠模型的酶指標(biāo)組別ast(u/l)alt(u/l)正常組19.82±4.3226.21±4.38模型組51.21±6.3846.89±6.34生理鹽水對照組50.76±4.7545.86±5.56混合乳組45.25±6.7841.77±7.18植物乳桿菌zy001發(fā)酵乳實(shí)驗(yàn)組36.53±6.7536.45±6.17當(dāng)前第1頁12
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