與本申請一起提交的ASCII文本文件的以電子方式提交的序列表內(nèi)容(名稱：IL13-310P1_SL.txt；大?。?5,073字節(jié)；以及創(chuàng)建日期：2014年6月11日)通過引用以其整體結(jié)合在此。

背景

許多重要的基于蛋白質(zhì)的生物治療劑在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。這些治療劑包括但不限于重組蛋白和抗體治療劑。與傳統(tǒng)的小分子治療劑相比，在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生生物治療劑增加了制造商業(yè)產(chǎn)品和臨床候選物的成本。重要的限制因素之一是在生產(chǎn)設施中由細胞冷凍貯存物放大生產(chǎn)運行所花費的時間，以及由用于生產(chǎn)重組蛋白和抗體治療劑的細胞的相對緩慢生長所引起的高度設備占用率和利用率。因此，需要開發(fā)增加細胞活力和/或細胞生長率(引起細胞倍增時間減少)以減少生產(chǎn)放大的時間線、設備占用率或利用率并降低成本的優(yōu)化的細胞培養(yǎng)方法和試劑。通常使用血清或其他動物蛋白成分增強細胞在實驗室環(huán)境中生長的能力。然而，由于監(jiān)管擔憂或潛在安全性問題，細胞培養(yǎng)基和試劑在生產(chǎn)生物治療劑時通常并不含有血清或其他動物蛋白成分。動物蛋白組分的去除使得細胞更難以在培養(yǎng)物中生長并且使得細胞更難以由冷凍貯存物解凍并開始生長，從而降低產(chǎn)物產(chǎn)率并增加設備占用率、利用率和成本。因此，準確地說當生產(chǎn)效率變得最重要時，細胞培養(yǎng)基成分受到了限制。因此，本領(lǐng)域面臨著對用于產(chǎn)生基于蛋白質(zhì)的生物治療劑諸如異源蛋白和抗體治療劑的細胞系的細胞培養(yǎng)成分進行優(yōu)化的挑戰(zhàn)。實際上，大量培養(yǎng)基組分的參與、細胞代謝途徑的復雜性和各種培養(yǎng)基組分與復雜細胞途徑之間的相依性通常使得優(yōu)化細胞培養(yǎng)試劑或方法非常困難。在此背景下，在此提供了包含N-乙酰半胱氨酸(NAC)的細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)方法，該N-乙酰半胱氨酸當被添加到涉及膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞的細胞培養(yǎng)基中和/或被用于涉及這些細胞的細胞培養(yǎng)方法中時出人意料地增加了細胞活力、細胞生長率并減少了細胞倍增時間。

其他人已建議將N-乙酰半胱氨酸作為一般氨基酸來源(參見，例如EP 2351827；在低于在此所用的數(shù)量級的量下)或作為一般還原劑(參見，例如，EP1434856、WO2012095731、US20060258003)添加到細胞培養(yǎng)基中，以分別支持T細胞、神經(jīng)元祖細胞/干細胞、或肌肉祖細胞/干細胞的生長。相比之下，在此提供了包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)方法，這些細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)方法增加膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞的細胞活力、細胞生長率并減少細胞倍增時間。如在此所述的(參見，例如實例1-6)，N-乙酰半胱氨酸當被添加到已含有氨基酸和還原劑的細胞培養(yǎng)基中時出人意料地增加了NSO細胞的細胞活力、細胞生長率并減少細胞倍增時間。

概述

說明書和權(quán)利要求書提供了包含N-乙酰半胱氨酸(NAC)的各種細胞培養(yǎng)基和方法，其中下文提供了這些培養(yǎng)基和方法中的一些的概述。根據(jù)說明書，一個實施例提供了一種細胞培養(yǎng)方法，該方法包括：(a)提供一種足以支持細胞生長的細胞培養(yǎng)基，其中該細胞培養(yǎng)基包含N-乙酰半胱氨酸；并且(b)在該細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，其中該細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。在另一個實施例中，一種增加細胞活力的方法包括：(a)提供一種足以支持細胞生長的細胞培養(yǎng)基，其中該細胞培養(yǎng)基包含N-乙酰半胱氨酸；并且(b)在該細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，其中該細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。在另一個方面中，一種增加細胞生長率的方法包括：(a)提供一種足以支持細胞生長的細胞培養(yǎng)基，其中該細胞培養(yǎng)基包含N-乙酰半胱氨酸；并且(b)在該細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，其中該細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。在另一個實施例中，一種減少細胞倍增時間的方法包括：(a)提供一種足以支持細胞生長的細胞培養(yǎng)基，其中該細胞培養(yǎng)基包含N-乙酰半胱氨酸；并且(b)在該細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，其中該細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。于在此所披露的方法的一個實施例中，該細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞。于在此所披露的方法的另一個實施例中，該細胞是骨髓瘤細胞。于在此所披露的方法的另一個實施例中，該細胞是雜交瘤細胞。

在一個實施例中，這些細胞是由冷凍貯存物解凍的。在另一個實施例中，這些細胞處于擴增階段。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基是無血清且無動物蛋白的培養(yǎng)基。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基是化學限定培養(yǎng)基。在另一個實施例中，該培養(yǎng)基包含脂質(zhì)。

在另一個實施例中，這些細胞是來源于哺乳動物。在又一個實施例中，這些哺乳動物細胞是鼠類的、倉鼠的、大鼠的、猴的、或人類的。在另一個實施例中，這些細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞。在一個實施例中，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞可以包括NS0、NS1、U937、M19、SRD-12B、SRD-13A、CHO-215、X63細胞、來源于這些細胞系的細胞系、或工程化為膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞的任何其他細胞。在另一個實施例中，這些細胞是NS0細胞。在另一個實施例中，這些細胞是骨髓瘤的或雜交瘤的。

在另一個方面中，細胞培養(yǎng)基包含N-乙酰半胱氨酸、碳水化合物來源、氨基酸來源、以及膽固醇來源。在另一個實施例中，該碳水化合物來源和該氨基酸來源是不同的。在另一個實施例中，該培養(yǎng)基進一步包含脂質(zhì)。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含碳水化合物來源、氨基酸來源、膽固醇來源、維生素、無機鹽、微量金屬、表面活性劑、以及pH緩沖劑。

在又一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含濃度為從約0.25mM至約3mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含濃度為從約0.5至約2.5mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含濃度為從約1.0至約1.5mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含濃度為約1mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含濃度為約1.5mM的N-乙酰半胱氨酸。在又一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含濃度為至少約0.5mM、至少約1.0mM、至少約1.5mM或至少約2.0mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含酵母提取液(yeastolate)。在另一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含1g/L酵母提取液。

在另一個實施例中，該平均倍增時間比在使用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中更短。在另一個實施方案中，該平均倍增時間與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比減少至少10％。在另一個實施方案中，該平均倍增時間與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比減少至少15％。在另一個實施方案中，該平均倍增時間與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比減少至少20％。在另一個實施方案中，該平均倍增時間與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比減少至少25％。在另一個實施方案中，該平均倍增時間與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比減少至少50％。在另一個實施方案中，在含有N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中該平均倍增時間是60小時或更少時間。在另一個實施方案中，在含有N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中該平均倍增時間是42小時或更少時間。在另一個實施方案中，在含有N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中該平均倍增時間是34小時或更少時間。在另一個實施方案中，在含有N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中該平均倍增時間是30小時或更少時間。在另一個實施方案中，在含有N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中該平均倍增時間是29小時或更少時間。

在另一個實施例中，該細胞活力相對于使用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)有所增加。在另一個實施方案中，該細胞活力與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比增加至少5％。在另一個實施方案中，該細胞活力與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比增加至少7％。在另一個實施方案中，該細胞活力與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比增加至少10％。在另一個實施例中，該細胞活力是至少90％。在另一個實施例中，該細胞活力是至少92％。在另一個實施例中，該細胞活力是至少93％。

在又一個實施例中，這些細胞并不表達一種異源蛋白。在又一個實施例中，這些細胞表達一種異源蛋白。在另一個實施例中，這些細胞用異源核酸轉(zhuǎn)化。在另一個實施例中，該異源核酸是cDNA、載體、質(zhì)粒、可操作地連接至啟動子的核酸、和/或結(jié)合到基因組中的核酸。在另一個實施例中，該異源蛋白是瞬時表達的。在另一個實施例中，該異源蛋白是穩(wěn)定表達的。在另一個實施例中，該異源蛋白是抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個實施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段是IL-13抗體。在另一個實施例中，該抗體是BAK502G9(由SEQ ID NO 1-2的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 3-8的重鏈和輕鏈CDR表示)、BAK278D6(由SEQ ID NO 9-10的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 11-16的重鏈和輕鏈CDR表示)、BAK1183H4(由SEQ ID NO 17-18的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 19-24的重鏈和輕鏈CDR表示)、或BAK1167F2(由SEQ ID NO 25-26的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 27-32的重鏈和輕鏈CDR表示)。

另外的目的和優(yōu)點將在隨后的說明中部分闡述，并且部分目的和優(yōu)點在說明中將是顯而易見的，或可以通過實踐來領(lǐng)會。這些目的和優(yōu)點將通過附加權(quán)利要求中特別指出的要素和組合來實現(xiàn)和獲得。

應了解，上文的一般說明與下文的詳細說明均僅是例示性和解釋性的，而并非為權(quán)利要求的限制。

附圖結(jié)合在本說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，其闡明一個(若干)實施例并且與說明一起用于解釋在此所述的原則。

附圖簡要說明

圖1示出表達針對IL-9的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系1在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基1中在瓶解凍時的群體倍增時間。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)(1.5mM、2.0mM或2.5mM)補充在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基1中解凍的冷凍NS0細胞系1細胞有并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加1.5mM至2.5mM NAC提高了來自瓶解凍的NS0細胞系1的細胞活力，增加了細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾。

圖2示出表達針對IL-9的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系1在APF培養(yǎng)基2中在瓶解凍時的群體倍增時間。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)(1.5mM、2.0mM或2.5mM)補充在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基1中解凍的冷凍NS0細胞系2細胞有并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加1.5mM至2.5mM NAC提高了來自瓶解凍的NS0細胞系1的細胞活力，增加了細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾。

圖3示出表達針對IL-13的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系2在APF培養(yǎng)基1中在瓶解凍時的群體倍增時間。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或2.5mM)補充在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基1中解凍的冷凍NS0細胞系2細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加0.5mM至2.5mM NAC提高了來自瓶解凍的NS0細胞系2的細胞活力，增加了細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾。

圖2示出表達針對IL-13的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系2在APF培養(yǎng)基2中在瓶解凍時的群體倍增時間。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或2.0mM)補充在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基2中解凍的冷凍NS0細胞系2細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加0.5mM至2.0mM NAC提高了來自瓶解凍的NS0細胞系2的細胞活力，增加了細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾。

圖5示出表達針對IL-13的單克隆抗體的NS0細胞系2在補充有膽固醇(1X英杰公司(Invitrogen)膽固醇脂質(zhì)濃縮物)的可商業(yè)獲得NS0細胞培養(yǎng)基(CD雜交瘤，吉畢科公司(Gibco))中在瓶解凍時的群體倍增時間。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或2.0mM)補充在具有1X膽固醇脂質(zhì)濃縮物的CD雜交瘤培養(yǎng)基中解凍的冷凍NS0細胞系2細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加0.5mM至2.0mM NAC提高了NS0細胞系2的細胞活力，增加了細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾。

圖6示出NS0裸細胞系(不表達重組蛋白的未轉(zhuǎn)染NS0細胞系)在APF培養(yǎng)基2中在瓶解凍時的群體倍增時間。將N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或1.5mM)補充在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基2中解凍的冷凍NS0裸細胞系細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加0.5mM至1.5mM NAC提高了細胞活力，增加了細胞生長并且減少了瓶解凍時的平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾。

圖7示出表達針對IL-9的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系1在APF培養(yǎng)基1中在擴增過程中的群體倍增時間。在補充有N-乙酰半胱氨酸(NAC)(1.5mM、2.0mM或2.5mM)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基1中培養(yǎng)NS0細胞系1細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加1.5mM至2.0mM NAC增加了NS0細胞系1的細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾；誤差棒表示平均倍增時間的標準偏差。

圖8示出表達針對IL-9的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系1在APF培養(yǎng)基2中在擴增過程中的群體倍增時間。在補充有不同水平的N-乙酰半胱氨酸(NAC)(1.5mM、2.0mM或2.5mM)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基2中培養(yǎng)NS0細胞系1細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加1.5mM至2.5mM NAC增加了NS0細胞系1的細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾；誤差棒表示平均倍增時間的標準偏差。

圖9示出表達針對IL-13的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系2在APF培養(yǎng)基1中在擴增過程中的群體倍增時間。在補充有N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或2.5mM)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基1中培養(yǎng)NS0細胞系2細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加0.5mM至2.5mM NAC增加了NS0細胞系2的細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾；誤差棒表示平均倍增時間的標準偏差。

圖10示出表達針對IL-13的單克隆抗體(“mAb”)的NS0細胞系2在APF培養(yǎng)基2中在擴增過程中的群體倍增時間。在補充有N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或2.0mM)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基2中培養(yǎng)NS0細胞系2細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加0.5mM至2.0mM NAC增加了NS0細胞系2的細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾；誤差棒表示平均倍增時間的標準偏差。

圖11示出表達針對IL-13的單克隆抗體的NS0細胞系2在補充有膽固醇(1X英杰公司膽固醇脂質(zhì)濃縮物)的可商業(yè)獲得NS0細胞培養(yǎng)基(CD雜交瘤，吉畢科公司)中在擴增過程中的群體倍增時間。在補充有N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或2.0mM)的具有1X膽固醇脂質(zhì)濃縮物的CD雜交瘤培養(yǎng)基中培養(yǎng)NS0細胞系2細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加1.0mM至2.0mM NAC增加了NS0細胞系2的細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。誤差棒的減小還表明細胞生長更加旺盛。h＝小時；mM＝毫摩爾；誤差棒表示平均倍增時間的標準偏差。

圖12示出NS0裸細胞系(不表達重組蛋白的未轉(zhuǎn)染NS0細胞系)在APF培養(yǎng)基2中在擴增過程中的群體倍增時間。在補充有N-乙酰半胱氨酸(NAC)(0.5mM、1.0mM或1.5mM)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基2中培養(yǎng)NS0裸細胞系細胞并且使用在指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算平均倍增時間。添加0.5mM至1.5mM NAC增加了NS0裸細胞系的細胞生長并且減少了平均細胞倍增時間。h＝小時；mM＝毫摩爾；誤差棒表示平均倍增時間的標準偏差。

序列說明

表1提供當前實施例中提及的某些序列的列表。

定義

為了更容易地理解本披露，首先定義某些術(shù)語。附加的定義在整個詳細說明中列出。

在本說明書和隨附權(quán)利要求書中，除非上下文另外明確說明，否則單數(shù)形式“一個/種(a/an)”和“該(the)”包括復數(shù)參考對象。術(shù)語“一個/一種(a)”(或“一個/一種(an)”)、以及術(shù)語“一個或多個/一種或多種(one or more)”和“至少一個/至少一種(at least one)”可以在此可互換地使用。例如，一個細胞可以是指一個單一細胞或一個細胞群。

此外，在此使用“和/或”應當理解為在有或沒有另一者的情況下，兩個指定的特征或組分中的每一者的特定披露。因此，如在此的短語諸如“A和/或B”中所使用的術(shù)語“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨)、以及“B”(單獨)。同樣，如在短語諸如“A、B和/或C”中使用的術(shù)語“和/或”旨在包括以下方面：A、B以及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；以及C(單獨)。

在說明書和隨附權(quán)利要求書通篇中與數(shù)值結(jié)合使用的術(shù)語“約”或“大約”表示本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并可接受的精確度的區(qū)間。一般來說，這種精確度的區(qū)間是±5％。

除非另外定義，在此所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本披露涉及的領(lǐng)域所屬的技術(shù)人員通常所理解的相同的意義。例如，生物醫(yī)學和分子生物學簡明詞典(Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；細胞和分子生物學詞典(Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，學術(shù)出版社(Academic Press)；以及牛津生物化學和分子生物學詞典(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修訂版，2000，牛津大學出版社(Oxford University Press)為技術(shù)人員提供了本披露中所使用的許多術(shù)語的通用詞典。

單位、前綴和符號均以它們的國際單位系統(tǒng)(SI)接受形式表示。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字。除非另外指明，否則氨基酸序列以氨基到羧基的方向從左到右書寫。在此提供的小標題不是本披露的不同方面或各方面的限制，可以通過作為一個整體參考本說明書來獲得這些方面。因此，通過以其全文參考說明書，更完全地定義了就在以下定義的術(shù)語。

如在此所用的，術(shù)語“N-乙酰半胱氨酸”、“N-乙酰基半胱氨酸”、“N-乙?；?L-半胱氨酸”或“乙?；腚装彼帷?縮寫為“NAC”)是指來源于具有連接至氮原子的乙?；鶊F的半胱氨酸的化合物。N-乙酰半胱氨酸還被稱為(2R)-2-乙酰氨基-3-磺?；?IUPAC)并且具有616-91-1的化學文摘社(CAS)登記號。N-乙酰半胱氨酸可從不同商業(yè)供應商(包括西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))處獲得。

如在此所用的，術(shù)語“膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞”是指生長需要膽固醇但不能合成膽固醇的細胞或細胞系。示例性膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞包括但不限于NS0、NS1、U937、M19、SRD-12B、SRD-13A、CHO-215、X63細胞、來源于這些細胞系的細胞系、或工程化為膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞的任何其他細胞。鑒別和/或培養(yǎng)膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞的方法是本領(lǐng)域已熟知的。參見，例如，基恩(Keen)等人，細胞技術(shù)學(Cytotechnology)17(3):203-11(1995)；喬弗恩(Gorfien)等人，生物技術(shù)進展(Biotechnol Prog.)16(5):682-7(2000)；付(Fu)等人，美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)，102(41):14551-6(2005)；伯奇(Birch)等人，先進藥物輸送評論(Adv Drug Delivery Rev.)，58:671–685(2006)；馮(Feng)等人，MAbs.2(5):466–477(2010)，各文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

如在此所述的，術(shù)語“骨髓瘤”和“骨髓瘤細胞”是指來源于骨髓細胞諸如中幼粒細胞、漿細胞或B細胞的永生化細胞系。示例性骨髓瘤細胞包括但不限于，X63Ag8、Sp2/0、NS1、NS0、J558L、U266、U937、P3U1、XG-1、XG-2、XG-3、XG-4、XG-5、XG-6、XG-7、XG-8、XG-9、U266、RPM1-8226、LP1、L363、OPM1、OPM2、以及NCLH929細胞或來源于這些細胞系的細胞系。鑒別和/或培養(yǎng)骨髓瘤細胞的方法是本領(lǐng)域已熟知的。參見，例如，富勒(Fuller)等人，骨髓瘤細胞的制備(Preparation of Myeloma Cells)，當代分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)，18:11.5.1–11.5.3(2001)；張(Zhang)等人,血液(Blood),83(12):3654-3663(1994)；以及塔伊(Tai)等人，免疫學方法雜志(J.Immunol.Methods.)235:11-19(2000)，各文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

如在此所用的，術(shù)語“雜交瘤”和“雜交瘤細胞”是指通過將B細胞與永生化細胞(例如，骨髓瘤細胞)融合來形成的永生化細胞系。生成和/或培養(yǎng)雜交瘤細胞的方法是本領(lǐng)域已熟知的。參見，例如，科勒(Kohler)和米爾斯坦(Milstein)，自然(Nature)256:495(1975)；葛爾弗瑞(Galfrè)和米爾斯坦(Milstein)，酶學方法(Methods Enzymol.)，73(Pt B):3-46(1981)；以及高汀(Goding)，單克隆抗體：原理和實踐(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，學術(shù)出版社(Academic Press)(1986)，各文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

如在此所用的，術(shù)語“細胞培養(yǎng)基”是指設計為支持來源于多細胞真核生物、特別是動物細胞的細胞生長的液體或基質(zhì)。培養(yǎng)細胞的示例性細胞培養(yǎng)基和方法描述于多伊爾(Doyle)等人，“哺乳動物細胞培養(yǎng)：必需技術(shù)(Mammalian cell culture:essential techniques)”，威利(Wiley)，(1997)；弗雷謝尼(Freshney)，“動物細胞的培養(yǎng)：基本技術(shù)和專門應用手冊(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications)”，約翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)，(2011)；以及米納克什(Meenakshi)，“細胞培養(yǎng)基：綜述(Cell Culture Media:A Review)”，材料和方法(Mater Methods.)，3:175(2013)，各文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

如在此所用的，術(shù)語“無血清培養(yǎng)基”是指不含有動物血清諸如胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白的細胞培養(yǎng)基。如在此所用的，術(shù)語“無動物蛋白培養(yǎng)基”是指不含有來自多細胞非植物高等真核生物的蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)組分諸如白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素或生長因子的細胞培養(yǎng)基。動物蛋白和蛋白質(zhì)組分與可從植物獲得(通常長度為10-30個氨基酸)或從低等真核生物諸如酵母獲得的非動物蛋白、小肽和寡肽區(qū)分，這些非動物蛋白、小肽和寡肽可被包含到根據(jù)本發(fā)明的無動物蛋白細胞培養(yǎng)基中。根據(jù)在此披露的方法的無血清且無動物蛋白培養(yǎng)基可以是基于通常技術(shù)人員已知的任何基礎培養(yǎng)基諸如DMEM、Ham's F12、Medium 199、McCoy或RPMI?；A培養(yǎng)基可以包含許多成分，包括氨基酸、維生素、有機鹽和無機鹽、以及碳水化合物來源，各種成分均以支持細胞培養(yǎng)的量存在，該細胞通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。培養(yǎng)基可以含有輔助物質(zhì)，諸如緩沖物質(zhì)如碳酸氫鈉、抗氧化劑、抵消機械應力的穩(wěn)定劑、或蛋白酶抑制劑。在需要時，非離子表面活性劑諸如聚乙二醇和聚丙二醇的混合物(例如，PluronicSERVA)可以作為消泡劑添加。無血清且無動物蛋白培養(yǎng)基的實例是本領(lǐng)域所熟知的，如以下所述的：馬里亞尼(Mariani)等人，“商用無血清培養(yǎng)基：雜交瘤生長和單克隆抗體生產(chǎn)(Commercial serum-free media:hybridoma growth and monoclonal antibody production)”，免疫學方法雜志145:175-83(1991)；巴爾內(nèi)斯(Barnes)等人，“用于在無血清培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)的細胞的方法(Methods for growth of cultured cells in serum-free medium)”，分析生物化學(Anal Biochem.)102:255-70(1980)；維莫斯(Waymouth)，“無血清培養(yǎng)基的制備和使用(Preparation and use of serum-free culture media)”在：巴爾內(nèi)斯DW、西爾巴斯庫DA(Sirbasku DA)、薩托GH(Sato GH)編者“用于制備無血清動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、補充劑和基質(zhì)的方法(Methods for preparation of media,supplements and substrata for serum-free animal cell culture)”紐約：麗絲(Liss)；(1984)；以及門德爾松(Mendelson)等人，“人淋巴細胞在無血清培養(yǎng)基中的培養(yǎng)(Culture of human lymphocytes in serum-free medium)”，在：巴爾內(nèi)斯DW、西爾巴斯庫DA、薩托GH編者“用于神經(jīng)元細胞和淋巴樣細胞的無血清培養(yǎng)的方法(Methods for serum-free culture of neuronal and lymphoid cells)”，紐約：麗絲；(1984)，各文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

如在此所用的，術(shù)語“化學限定培養(yǎng)基”是適用于細胞培養(yǎng)人或動物細胞的細胞生長培養(yǎng)基，其中所有的化學組分均是已知的。

如在此所用的，“足以支持細胞生長的細胞培養(yǎng)基”是指能夠支持細胞生長、存活和/或增殖的細胞培養(yǎng)基。通常，“足以支持細胞生長的細胞培養(yǎng)基”包含適當?shù)哪茉春桶被?、維生素、鹽和/或技術(shù)人員通常已知的營養(yǎng)素的補充劑。足以支持細胞生長的示例性細胞培養(yǎng)基包括商業(yè)上可獲得的培養(yǎng)基、化學限定培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、以及無動物蛋白培養(yǎng)基，如技術(shù)人員通常所已知的。

如在此所用的，術(shù)語“細胞活力”是指細胞存活或發(fā)育的能力。通常，測定“細胞活力”需要測量細胞或細胞群存活或發(fā)育的能力(包括例如基于總細胞樣品測定活細胞或死細胞的數(shù)目)，如通常技術(shù)人員所已知的。細胞活力測定是本領(lǐng)域所熟知的并且包括：細胞溶解或膜泄露測定(例如，使用碘化丙錠、臺盼藍和/或7-氨基放線菌素D)、線粒體活性或半胱天冬酶測定(例如，使用刃天青和/或甲臜)、細胞功能測定(例如，能動性測定、細胞增殖或生長測定)、基因組和/或蛋白質(zhì)組學測定(例如，測量于細胞死亡、損傷或應激的不同基因或蛋白質(zhì)的表達)、細胞毒性測定、以及活體染色。參見“分子探針手冊熒光探針和標記技術(shù)指南(The Molecular Probes Handbook.A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)”(I.約翰遜(I.Johnson)和M.斯彭斯(M.Spence)編輯)第11版，第15章，“用于細胞活力、增殖和功能的測定(Assays for Cell Viability,Proliferation and Function)”，生命技術(shù)(Life Technologies)(2010)，該文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

如在此所用的，術(shù)語“細胞倍增時間”或“倍增時間”是指細胞或細胞群數(shù)目倍增所需要的時間段。細胞或細胞群的倍增時間可以使用以下等式來確定：DT＝T ln2/ln(X2/X1)，其中DT＝倍增時間；T是任何單位的孵育時間；X1是在孵育時間開始時的細胞數(shù)目；并且X2是在孵育時間結(jié)束時的細胞數(shù)目。如在此所用的，當細胞或細胞群的相對生長率是恒定的(例如，在指數(shù)生長期或?qū)?shù)期)時測量細胞倍增時間。細胞計數(shù)測定是本領(lǐng)域已熟知的并且包括細胞計數(shù)；使用計數(shù)室(例如，血細胞計數(shù)器)；使用分光光度計；使用庫爾特計數(shù)器；使用流式細胞術(shù)；或使用顯微鏡檢查法。參見“分子探針手冊熒光探針和標記技術(shù)指南”(I.約翰遜和M.斯彭斯編輯)第11版，第15章，“用于細胞活力、增殖和功能的測定”，生命技術(shù)(Life Technologies)(2010)，該文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

如在此所用的,術(shù)語“異源核酸”是指使用標準重組DNA和分子克隆技術(shù)引入到細胞中的核酸分子(例如，多核苷酸、cDNA、DNA、RNA或其片段)，這些技術(shù)包括但不限于以下各項所述的技術(shù)：薩姆布魯克(Sambrook)等人，“分子克?。簩嶒炇沂謨?Molecular Cloning:A Laboratory Manual)”第二版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，紐約(1989)；西爾哈維(Silhavy)等人，“使用基因融合物的實驗(Experiments with Gene Fusions)”，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1984)；以及奧蘇貝爾，F(xiàn).M.等人，“當代分子生物學手冊(Current Protocols in Molecular Biology)”，由格林出版協(xié)會和約翰威立公司(Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience)出版(1987)，各文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以包含DNA或RNA并且可以是全部或部分合成。

如在此所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)化的”是指將核酸分子或其片段轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，從而使宿主細胞的子細胞繼承該核酸分子或其片段。含有轉(zhuǎn)化的核酸或其片段的宿主細胞在此被稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”細胞。

術(shù)語“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達的多核苷酸序列。通常，編碼序列位于啟動子序列的3'處。啟動子可以整體來源于天然基因，或者可以由來源于自然界中可見的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解不同啟動子可以在不同組織或細胞類型中、或在不同發(fā)育階段、或響應于不同環(huán)境或生理條件來引導核酸表達。引起基因大部分時候在大部分細胞類型中表達的啟動子通常被稱為“組成型啟動子”。進一步認識到由于在大部分情況下調(diào)節(jié)序列的精確邊界未完全限定，不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。

術(shù)語“可操作地連接”是指核酸序列在單一核酸分子上的締合以使得一者的功能受到另一者的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達時(即編碼序列處于啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)，啟動子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列可以在有義取向或反義取向中可操作地連接至調(diào)節(jié)序列。

術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”是指通常為環(huán)狀雙鏈DNA片段形式的核酸元件。此類元件可以是來源于任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA的線性或環(huán)狀自主復制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列已連接或重組到獨特結(jié)構(gòu)中，該獨特結(jié)構(gòu)能夠?qū)⑨槍x定基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列連同適當3'未翻譯序列引入到細胞中。可以選擇或構(gòu)建含有適當調(diào)節(jié)序列的合適載體，該調(diào)節(jié)序列包括啟動子序列、終止子序列、多聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因以及視情況而定的其他序列。

如在此所用的，術(shù)語“表達”是指來源于本發(fā)明的核酸分子的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達還可以是指將mRNA翻譯成多肽。

如在此所用的，術(shù)語“異源蛋白”是指由異源核酸編碼的且在宿主細胞中表達的蛋白質(zhì)(例如，多肽、肽或其片段)。異源蛋白可以是瞬時表達(例如其中編碼異源蛋白的多核苷酸并未結(jié)合到宿主細胞基因組中)或穩(wěn)定表達的(例如其中編碼異源蛋白的多核苷酸結(jié)合到宿主細胞基因組中)。

如在此使用的，術(shù)語“抗體”(或其片段、變體、或衍生物)是指能夠結(jié)合至抗原的抗體的至少最小部分，例如，在由B細胞產(chǎn)生的典型抗體的情況下，至少重鏈(VH)的可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈(VL)的可變結(jié)構(gòu)域。脊椎動物系統(tǒng)中的基礎抗體結(jié)構(gòu)相對較好理解。參見，例如，哈洛(Harlow)等人，抗體：實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港實驗室出版社，第2版，1988)，該文獻通過引用以其整體結(jié)合在此。

抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、表位結(jié)合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、二硫化物連接的Fvs(sdFv)、包括VL或VH域的片段、由Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。ScFv分子是本領(lǐng)域已知的并且描述于例如美國專利5,892,019中，該專利通過引用以其整體結(jié)合在此。本披露涵蓋的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)或子類。

在此披露的抗體或其抗原結(jié)合片段、變體或衍生物可以在抗原的一個或多個表位或一個或多個部分(例如它們識別或特異性結(jié)合的靶標多肽)方面來描述或規(guī)定。例如，IL-13或抗-IL-13抗體是結(jié)合IL-13多肽或其部分的抗體。在一些方面中，抗-IL-13抗體是BAK502G9(例如，包含SEQ ID NO:1和2的抗-IL-13抗體)。在一個實施例中，該抗體是BAK502G9(由SEQ ID NO 1-2的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 3-8的重鏈和輕鏈CDR表示)、BAK278D6(由SEQ ID NO 9-10的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 11-16的重鏈和輕鏈CDR表示)、BAK1183H4(由SEQ ID NO 17-18的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 19-24的重鏈和輕鏈CDR表示)、或BAK1167F2(由SEQ ID NO 25-26的VH和VL結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID NO 27-32的重鏈和輕鏈CDR表示)。

其他可以使用的抗-IL-13單克隆抗體包括于2012年3月1日公開的美國專利申請公開號2012-0052060中所描述的那些,該專利通過引用以其整體結(jié)合在此。其他IL-13抗體包括而不限于抗-人類-IL-13抗體，例如來金珠單抗(MILR1444A/RG3637，羅氏(Roche)/基因泰克公司(Genentech))、ABT-308(阿伯特公司(Abbott))、GSK679586(葛蘭素史克公司(GlaxoSmithkline))、或QAX576(諾華公司(Novartis))。如本領(lǐng)域已熟知的，可以適于本領(lǐng)域已知的不同技術(shù)在細胞中產(chǎn)生抗體，包括抗-IL13抗體。參見，例如，單克隆抗體，雜交瘤：生物分析的新尺寸(Monoclonal Antibodies,Hybridomas:A New Dimension in Biological Analyses)，肯尼特(Kennet)等人(編輯)普萊紐姆出版社(Plenum Press)，紐約(1980)；以及抗體：實驗室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual)，哈洛和拉內(nèi)(編輯)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約(1988)。

實施方式說明

I.細胞培養(yǎng)基

細胞培養(yǎng)是將從動物中取出的細胞、組織或器官置于促進其存活、生長和/或增殖的人工環(huán)境中的過程。細胞最佳生長的基本環(huán)境要求包括：適合的器皿、供應營養(yǎng)素(包括但不限于，氨基酸、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)、生長因子、激素等中的至少一種)的細胞培養(yǎng)/生長培養(yǎng)基、以及控制的生理化學環(huán)境(以控制例如pH、滲透壓、溫度、O₂、CO₂等)一些細胞是貼壁依賴性的并且必須在附接至固體或半固體基底(貼壁或單層培養(yǎng))時培養(yǎng)，而其他細胞可以漂浮在培養(yǎng)基中生長(懸浮培養(yǎng))。在細胞培養(yǎng)中的一個步驟是選擇適當?shù)纳L培養(yǎng)基。根據(jù)在此所披露的實施例的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包括足以支持細胞生長的包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基。在一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基是無血清且無動物蛋白的培養(yǎng)基。在一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基是化學限定培養(yǎng)基。在另一個實施例中，N-乙酰半胱氨酸被添加到商業(yè)上可獲得的細胞培養(yǎng)基中。在一個實施例中，商業(yè)上可獲得的細胞培養(yǎng)基是用于NS0細胞的NS0無血清培養(yǎng)基(可從西格瑪-奧德里奇公司獲得，目錄號H4281)、CD雜交瘤培養(yǎng)基(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號H4409)、用于雜交瘤細胞的Ex-細胞620-HSF無血清培養(yǎng)基(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號14621C)、用于NS0的Ex-細胞NS-無血清培養(yǎng)基(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號14650C)、DMEM(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號D567)、伊斯科夫改良杜爾貝科培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(IMDM)(可從西格瑪-奧德里奇公司獲得，目錄號I3390)、RPMI-1640培養(yǎng)基(西格瑪-奧德里奇公司，目錄號R8005)、雜交瘤-SFM(生命技術(shù)公司，目錄號12045076)、CD雜交瘤AGT培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司，目錄號12372025)、CD雜交瘤培養(yǎng)基(可從生命技術(shù)公司獲得，目錄號11278023)、PFHM-II無蛋白質(zhì)雜交瘤培養(yǎng)基(生命技術(shù)公司，目錄號12040077)、Nutridoma-SP(羅氏公司，目錄號11011374001))、UltraDOMA-PF雜交瘤培養(yǎng)基(龍沙公司，目錄號12-727F)、UltradDOMA無血清雜交瘤培養(yǎng)基(龍沙公司，目錄號12-723B)、Hyclone PF-Mab培養(yǎng)基(GE生命科學公司(GE Life Sciences)，SH30138.05)、Hyclone SFM4MAb培養(yǎng)基(GE生命科學公司SH30391.02)、Hyclone SFM4Mab-實用性培養(yǎng)基(GE生命科學公司，目錄號SH30382.02)、Hyclone ADCF-Mab培養(yǎng)基(GE生命科學公司，目錄號SH30349.02)、Hyclone CCM1培養(yǎng)基(GE生命科學公司，SH30043.03)、HyClone CCM4MAb培養(yǎng)基(GE生命科學公司，SH30800.06)、Hyclone CDM4NS0培養(yǎng)基(GE生命科學公司，SH30478.06)、以及類似培養(yǎng)基。在另一個實施例中，N-乙酰半胱氨酸被添加到由組分成分與作為培養(yǎng)基基底的無菌去離子水制成的細胞培養(yǎng)基中。

A.N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸被添加到在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中以增加細胞活力、細胞生長率并且/或者減少細胞倍增時間。雖然不受任何特定理論的限制，但是認為N-乙酰半胱氨酸通過防止細胞產(chǎn)生自由基、防止細胞膜破裂、和/或防止其他細胞培養(yǎng)基成分(包括但不限于脂質(zhì)(諸如膽固醇))氧化來提供細胞在培養(yǎng)基中生長的益處。

在一個實施例中，如在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包含濃度為從約0.25mM至約3mM、從約0.5mM至約2.5mM、從約0.5mM至約2.0mM、從約0.5mM至約1.5mM、從約0.5mM至約1.0mM、從約1.0mM至約2.5mM、從約1.0mM至約2.0mM、從約1.0mM至約1.5mM、從約1.5mM至約2.5mM、或從約1.5mM至約2.0mM的N-乙酰半胱氨酸。在一個實施例中，如在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包含濃度為約1mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，如在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包含濃度為約1.5mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，如在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包含濃度為約2.0mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，如在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包含濃度為約2.5mM的N-乙酰半胱氨酸。在另一個實施例中，如在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包含濃度為約0.5mM的N-乙酰半胱氨酸。在又一個實施例中，如在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法包含濃度為至少約0.5mM、至少約1.0mM、至少約1.5mM、至少約2.0mM或至少約2.5mM的N-乙酰半胱氨酸。

B.其他細胞培養(yǎng)基組分

在一些實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含碳源、氮源、和/或磷源。這些組分可以通過相同成分或不同成分來提供。在一些實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含碳源、氮源、磷源、和/或礦物鹽類。適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的碳源包括碳水化合物(諸如糖)或氨基酸諸如L-谷氨酰胺和/或丙酮酸鹽或其任何組合。在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含碳水化合物和氨基酸。在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含鹽、維生素、代謝性前體、生長因子、激素、以及微量元素中的至少一種。在一些實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含基礎培養(yǎng)基，該基礎培養(yǎng)基含有氨基酸、維生素、無機鹽、以及碳源諸如葡萄糖。

1.碳水化合物

適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的示例性碳水化合物包括葡萄糖、半乳糖、海藻糖、葡糖胺、甘露糖、棉子糖、果糖、核糖、葡糖醛酸、乳糖、麥芽糖、蔗糖、松二糖、適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何其他碳水化合物、或其任何組合。在一個方面中，碳水化合物可以是葡萄糖或半乳糖。

2.氨基酸

適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的示例性氨基酸包括一種或多種必需氨基酸(即組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、和/或纈氨酸)、和/或一種或多種非必需氨基酸(即丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、以及天冬酰胺)、和/或其必需氨基酸和非必需氨基酸的任何組合。對于某些細胞，一些非必需氨基酸是必需氨基酸，因為該細胞并不具有合成該氨基酸的能力。例如，NS0細胞缺乏內(nèi)源性谷氨酰胺合成酶或含有極低水平的該酶并且這樣谷氨酰胺是NS0細胞的必需氨基酸，除非在異源蛋白的表達系統(tǒng)中包含谷氨酰胺合成酶。

氨基酸一詞，在本披露中包括任何氨基酸，包括但不限于D-氨基酸或L-氨基酸和非基本氨基酸。因此，術(shù)語氨基酸涵蓋了具有氨基(-NH₂)和羧基(-COOH)官能團的任何有機化合物。

3.脂質(zhì)

在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含脂質(zhì)。適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的示例性脂質(zhì)包括以下各項中的一種或多種：膽固醇、花生四烯酸、醋酸生育酚、亞油酸、亞麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、磷脂(諸如磷脂酰膽堿)、適用于通常本領(lǐng)域已知的細胞培養(yǎng)中的任何其他脂質(zhì)、或其任何組合。還可以任選地包含肌醇作為膜磷脂組分。合成的或植物來源的脂質(zhì)也可以任選地用于其中希望培養(yǎng)基不含動物來源的組分的應用中。脂質(zhì)可以添加在環(huán)糊精基脂質(zhì)補充劑中。環(huán)糊精可以用于溶解脂質(zhì)和/或其他成分諸如脂溶性維生素和激素。

膽固醇可以合成地產(chǎn)生或者它可以是動物來源的。例如，膽固醇可以從綿羊毛中分離。無動物蛋白的培養(yǎng)基可以含有來源于動物來源的膽固醇。在一些實施例中，膽固醇是從商業(yè)來源獲得的。參見，例如，來自吉畢科公司的化學限定濃縮物；來自SAFC的脂質(zhì)濃縮物。膽固醇可以作為合成膽固醇(諸如但不限于SyntheChol^TM)、作為膽固醇納米顆粒(參見，例如，吳(Wu)等人，NS0細胞在具有膽固醇納米顆粒補充劑的分批培養(yǎng)基中的產(chǎn)生增強(Enhanced Productivity of NS0cells in fed-batch culture with cholesterol nanoparticle supplementation)，生物技術(shù)進展(Biotechnology Progress)27(3):796-802(2011))或通過適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何裝置以膽固醇-環(huán)糊精溶液添加到培養(yǎng)基中。

在一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約1至約10g/L的膽固醇。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約1至約5g/L的膽固醇。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約1.5至約4g/L的膽固醇。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約2至約3g/L的膽固醇。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有約2.5g/L的膽固醇。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有至少約1g/L的膽固醇、至少約2.5g/L的膽固醇或至少約5g/L的膽固醇。

在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有除膽固醇之外的脂質(zhì)。在一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有磷脂。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有磷脂酰膽堿。在一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約1至約10g/L的磷脂酰膽堿。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約1至約5g/L的磷脂酰膽堿。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約1.5至約4g/L的磷脂酰膽堿。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有從約2至約3g/L的磷脂酰膽堿。在另一個實施例中，培養(yǎng)基可以含有約2.5g/L的磷脂酰膽堿。

4.鹽

在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含鹽。適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的示例性鹽包括氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉、硝酸鉀、適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何其他鹽、或其任何組合中的至少一種。

在另一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法并不包含氯化鈣或氯化鎂。此實施例在希望細胞解離或釋放時具有優(yōu)點，因為鈣或鎂促進細胞粘附。

5.維生素

在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含維生素。適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的示例性維生素包括脂溶性維生素、維生素A、維生素D、維生素E、維生素K、維生素B1(硫胺素)、維生素B2(核黃素)、維生素B3(煙酰胺)、維生素B5(泛酸)、維生素B6(吡哆醛、吡哆胺、和/或吡哆素)、維生素B9(葉酸)、適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何其他維生素、或其任何組合。

6.生長因子和激素

在一個實施例中，至少一種激素可以添加到在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中。在一個實施例中，激素可以選自以下至少一種：地塞米松、促紅細胞生成素、雌二醇、氫化可的松、胰島素、黃體酮、生長抑素、甲狀腺素(T4)、三碘甲腺氨酸(T3)、活化素、BMP4、BMP7、BMPR1A、Cripto、FLT3配體、HGF、IGF、EGF、FGF、PDGF、IGFBP4、舒血管素(kallekrein)、LEFTY-A、NGF、TGFβ、VEGF、或適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何其他激素或生長因子。

7.微量元素

在一個實施例中，至少一種微量元素可以添加到在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中。在一個實施例中，微量元素可以是以下至少一種：鋅、鐵、銅、硒、鎂、錳、鉬、錫、鎳、或適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何其他微量元素。

8.表面活性劑

在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含至少一種表面活性劑。適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的示例性表面活性劑包括吐溫-80、普朗尼克F-68、或適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何其他表面活性劑。

9.緩沖劑

在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含至少一種pH緩沖劑。適用于在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中的示例性緩沖劑包括碳酸氫鈉、硼酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇、乙醇胺、甘油磷酸酯、檸檬酸鉀、磷酸鉀、乙酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、來自小麥的淀粉、HEPES、氯化鈣、MOPS、或適用于本領(lǐng)域通常已知的細胞培養(yǎng)的任何其他緩沖劑、或其任何組合。

10.其他成分

在一個實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法進一步包含非動物來源的水解產(chǎn)物。例如，植物或酵母水解產(chǎn)物提供了包含氨基酸、短肽、碳水化合物、維生素、核苷、以及礦物質(zhì)的蛋白質(zhì)消化物，從而為培養(yǎng)基提供各種營養(yǎng)補充劑。例如，可以采用一種酵母水解產(chǎn)物即酵母提取液。酵母提取液是肽、氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)、金屬和維生素的混合物。它可以除分別提供的那些成分之外或代替分別提供的那些成分來添加。在一個實施例中，該細胞培養(yǎng)基包含1g/L酵母提取液。

在一個實施例中，托酚酮也可以添加到在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中。在另一種模式中，核苷也可以添加到在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中。在另一個實施例中，β-巰基乙醇也可以添加到在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中。在另一個實施例中，抗生素也可以添加到在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法中。

在一些實施例中，在此所述的細胞培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)方法含有NAC、氨基酸、維生素、脂質(zhì)、碳水化合物、pH緩沖劑、微量金屬、無機鹽、以及表面活性劑。在一個實施例中，該脂質(zhì)是膽固醇。

II.細胞培養(yǎng)方法

A.細胞類型

各種細胞類型諸如膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞和雜交瘤細胞可以用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。在一個實施例中，正在培養(yǎng)的細胞來源于哺乳動物，包括但不限于，來源于小鼠、大鼠、人類、猴、倉鼠、兔等的細胞。

如在此所用的，術(shù)語“膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞”是指生長需要膽固醇但不能合成膽固醇的細胞或細胞系。在一個實施例中，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞是NS0、NS1、U937、M19、SRD-12B、SRD-13A、CHO-215、X63細胞、來源于這些細胞系的細胞系、或工程化為膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞的任何其他細胞。在另一個實施例中，這些細胞是NS0細胞。

在一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞。在一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞是NS0細胞。在一個實施例中，這些細胞是NS1、U937、M19、SRD-12B、SRD-13A、CHO-215、X63細胞、來源于這些細胞系的細胞、或工程化為膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞的任何其他細胞。在另一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型的鼠骨髓瘤細胞。在一個實施例中，這些細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型哺乳動物骨髓瘤細胞。在一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型的人骨髓瘤細胞。

在一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞是骨髓瘤細胞。在另一個實施例中，這些細胞是X63Ag8、Sp2/0、NS1、NS0、J558L、U266、U937、P3U1、XG-1、XG-2、XG-3、XG-4、XG-5、XG-6、XG-7、XG-8、XG-9、U266、RPM1-8226、LP1、L363、OPM1、OPM2、以及NCLH929細胞或來源于這些細胞系的細胞系。在另一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞是雜交瘤細胞。在一些方面中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的雜交瘤細胞表達并且/或者分泌抗體。

B.生物治療劑

在一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞，包括NS0細胞)在并不誘導并且/或者表達重組蛋白或異源蛋白的情況下培養(yǎng)。在一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞，包括NS0細胞)用異源核酸(包括但不限于，cDNA、質(zhì)粒、載體、可操作地連接至啟動子的核酸、和/或瞬時表達異源核酸并且/或者將異源核酸結(jié)合到細胞系基因組中的核酸)轉(zhuǎn)化。在另一種方法中，這些細胞表達一種重組蛋白或異源蛋白。在一種方法中，這些細胞過度表達該重組蛋白或異源蛋白。表達各種各樣的異源序列的細胞系可以受益于本發(fā)明細胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。

在一個實施例中，該異源蛋白是瞬時表達的。在另一個實施例中，該異源蛋白是穩(wěn)定表達的。

在一個實施例中，該異源蛋白不是抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個實施例中，該異源蛋白是血液因子、抗凝劑、溶血栓藥、促紅細胞生成素、干擾素、激素、酶、疫苗、生長因子、和/或融合蛋白。

在另一個實施例中，適合于用包含N-乙酰半胱氨酸的當前披露的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞，包括NS0細胞)表達一種異源蛋白，其中該異源蛋白是抗體或其抗原結(jié)合片段。在一個實施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合IL-13或特異性結(jié)合IL-9。在另一個實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段是US 7,947,273、US 7,354,584或US 7,371,383中披露的抗體或抗原結(jié)合片段，這些專利各自通過引用以其整體結(jié)合在此。在另一個實施例中，該抗體是BAK502G9(包含SEQ ID NO 1和2)。在另一個實施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段具有與BAK502G9相同的CDR(包含重鏈CDR(SEQ ID NO:3-5)和輕鏈CDR(SEQ ID NO:6-8))。在另一個實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段具有包含SEQ ID NO:1、9、17或25中任一種的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:2、10、18或26中任一種的輕鏈可變區(qū)。在另一個實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段具有包含以下各項的重鏈可變區(qū)：(a)選自SEQ ID NO:3、11、19和27的HC CDR1；(b)選自SEQ ID NO:4、12、20和28的HC CDR2；以及(c)選自SEQ ID NO:5、13、21和29的HC CDR；以及包含以下各項的輕鏈可變區(qū)：(a)選自SEQ ID NO:6、14、22和30的LC CDR1；(b)選自SEQ ID NO:7、15、23和31的LC CDR2；以及(c)選自SEQ ID NO:8、16、24和32的LC CDR3。在另一個實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段包含表1中所述的重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)。或者包含一組6個表1中所述的CDR。

在另一個實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段具有包含與SEQ ID NO:1、9、17或25中任一種約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約92％、約93％、約94％、約98％、或約99％相同的序列的重鏈可變區(qū)和包含與SEQ ID NO:2、10、18或26中任一種約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約92％、約93％、約94％、約98％、或約99％相同的序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段具有包含以下各項的重鏈可變區(qū)：(a)與選自SEQ ID NO:3、11、19或27的序列相比具有一個突變的HC CDR1；(b)與選自SEQ ID NO:4、12、20和28的序列相比具有一個或兩個突變的HC CDR2；以及(c)與選自SEQ ID NO:5、13、21和29的序列相比具有一個或兩個突變的HC CDR3；以及包含以下各項的輕鏈可變區(qū)：(a)與選自SEQ ID NO:6、14、22和30的序列相比具有一個突變的LC CDR1；(b)與選自SEQ ID NO:7、15、23和31的序列相比具有一個或兩個突變的LC CDR2；以及(c)與選自SEQ ID NO:8、16、24和32的序列相比具有一個或兩個突變的LC CDR3；在另一個實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段具有包含與表1中所述的VH和/或VL序列約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約92％、約93％、約94％、約98％或約99％相同的重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū)(VL)。在一些實施例中，該抗體或抗原結(jié)合片段具有CDR中與表1中所述的任一種CDR相比的一個或兩個突變。

在另一個實施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合糖蛋白IIb/IIIa、IL-2受體(諸如IL-2受體a)、TNF-α、RSV、RSV的F蛋白表位、CD33、表皮GF受體、T-細胞VLA4受體、補體蛋白C5、IL-1、IL-9、IL-12、IL-13、IL-23、CD-20、和/或BAFF。

在另一個實施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段是奧法木單抗、貝利木單抗、吉妥珠單抗奧佐米星、帕利珠單抗、那他珠單抗、西妥昔單抗、康納單抗、英利昔單抗、阿昔單抗、巴利昔單抗、達利珠單抗、依庫珠單抗、或優(yōu)特克單抗。

C.細胞培養(yǎng)過程

在一個實施例中，細胞培養(yǎng)方法包括提供足以支持細胞生長的細胞培養(yǎng)基，其中該細胞培養(yǎng)基包含N-乙酰半胱氨酸；并且在該細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種細胞，其中該細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。在一個實施例中，該方法是一種通過以下各項來增加細胞活力、增加細胞生長率、和/或減少細胞的細胞倍增時間的方法：提供足以支持細胞且包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基；并且在該細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，其中該細胞是膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞。

在一個實施例中，這些細胞在37℃下在5％CO₂和85％相對濕度下培養(yǎng)。在一個實施例中，pH可以是從6.8至7.4。還可以使用本領(lǐng)域通常已知的其他可接受條件。

在一個方面中，當從冷凍貯存物到大生物反應器來放大生產(chǎn)時，發(fā)生細胞培養(yǎng)。在一個方面中，在細胞傳代時改進的培養(yǎng)基允許至少四倍的分流比(即將含有有待傳代的細胞的1X細胞培養(yǎng)基與不含有這些細胞的3X新鮮細胞培養(yǎng)基混合)。在另一個方面中，它允許五倍的分流比、六倍的分流比或七倍的分流比。

在一個實施例中，這些細胞在100L生物反應器中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到500L生物反應器中，并且然后轉(zhuǎn)移到2500L生物反應器中。

在一個實施例中，這些細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞)是由冷凍貯存物解凍。在一個實施例中，這些細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞)處于擴增階段。在另一個實施例中，這些細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞)以分批方式、補料分批方式、連續(xù)培養(yǎng)、灌注來生長或在整合的生物反應器-純化單元中生長。

D.對細胞培養(yǎng)效率的影響

本發(fā)明細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基可以提供多種優(yōu)點。在一種情況下，它使細胞(例如，膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞諸如NS0細胞)在容器(諸如生物反應器)中生長所需要的時間與無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基相比減少至少約10％到至少約50％(例如，至少約10％、15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、或約50％)。在一個實施例中，這是通過計算獲得所希望的每體積細胞計數(shù)所需要的時間段來確定的。

在另一個實施例中，細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基使得用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的平均細胞倍增時間與在用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比有所減少。在另一個實施例中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的平均細胞倍增時間與在用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比更短。在另一個實施例中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的平均和/或中間細胞倍增時間與在無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比減少至少約10％到至少約50％(例如，至少約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、或約50％)。在一個方面中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的平均和/或中間細胞倍增時間小于或等于60小時至小于或等于約29小時(例如，小于或等于約60小時、約42小時、約34小時、約30小時、或約29小時)或者約小于或約等于圖1-圖12中報道的任一個平均細胞倍增時間。

在一個實施例中，細胞倍增時間可以是通過在給定時間間隔內(nèi)計數(shù)給定細胞培養(yǎng)基中的細胞并在圖中繪制數(shù)據(jù)來確定。平均倍增時間可以是通過使用等式DT＝T ln2/ln(X2/X1)對多次重復培養(yǎng)中指數(shù)生長期的倍增時間值取平均值來計算，其中DT＝倍增時間，T是任何單位的孵育時間；X1是在孵育時間開始時的細胞數(shù)目，并且X2是在孵育時間結(jié)束時的細胞數(shù)目。

在另一個實施例中，細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基使得用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的細胞生長率與在用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比有所增加。在另一個實施例中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的細胞生長率與在用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比更高。在另一個實施例中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的細胞生長率與在無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比增加至少約10％到至少約50％(例如，至少約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、或約50％)。

在一個實施例中，細胞生長可以是使用細胞計數(shù)方法來確定的。在一個實施例中，獲得細胞培養(yǎng)基的樣品體積并且計數(shù)該體積中的細胞?？梢栽谘蛴嫈?shù)器中或用庫爾特粒度儀進行細胞計數(shù)。另一種方法繪制了細胞數(shù)目針對時間的圖，其中培養(yǎng)的圖步進斜率顯示提高的生長率。

在另一個實施例中，在此披露的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基使得膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的細胞活力相對于在用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)有所增加。在另一個實施例中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的細胞活力與在用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比更高。在另一個實施例中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的細胞活力與在無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比增加至少約5％到至少約15％(例如，至少約5％、約7％、約10％、約12％、或約15％)。在另一個方面中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)的細胞活力是至少約85％到至少約95％(例如，至少約85％、約88％、約90％、約92％、約93％、約94％、或約95％)。

在一個實施例中，細胞活力可以是通過臺盼藍排除活力測定法來測定。在這種測定中，可以將細胞懸浮液與磷酸鹽緩沖液中的0.4％臺盼藍混合并且使用血球計數(shù)器計數(shù)細胞?；罴毎霈F(xiàn)為圓形的折射體而無任何藍色顯色，而死細胞吸收染料并且出現(xiàn)為藍色?；盍梢员槐硎緸榛罴毎鄬τ谒嫈?shù)的總細胞的百分比，其中活細胞是其膜的完整性在臺盼藍排除活性測定中仍能夠防止臺盼藍吸收的細胞。

在另一個實施例中，使用在此披露的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基獲得增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)率，諸如增加的異源蛋白表達。在另一個實施例中，在用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)中重組蛋白或異源蛋白的表達與在用排除N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比更高。在另一個實施例中，用包含N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)方法和/或培養(yǎng)基培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)顯示與在無N-乙酰半胱氨酸的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膽固醇營養(yǎng)缺陷型細胞、骨髓瘤細胞或雜交瘤細胞(例如，NS0細胞)相比至少約10％到至少約200％(例如，至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％90％、100％、150％、200％)更高的蛋白質(zhì)表達。

現(xiàn)在將詳細參考當前的示例性實施例，其實例示出在附圖中。只要可能，將貫穿整個附圖使用相同的參考數(shù)字來指代相同或類似部件。通過考慮在此披露的說明和實踐，其他實施例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見的。在以下實例中進一步解釋這些實施例。這些實例并非限制權(quán)利要求的范圍，僅用來說明某些實施例。目的在于，說明書和實例僅被認為是示例性的，其中本發(fā)明的真正范圍和精神將由以下權(quán)利要求指出。

實例

實例1.NS0細胞系1在APF培養(yǎng)基1和2中在瓶解凍時的細胞倍增時間

為研究N-乙酰半胱氨酸對解凍復蘇、細胞活力、細胞生長以及隨后傳代時的細胞倍增時間的作用，使用以下方法。研究在一至三種不同無動物蛋白(“APF”)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的三種不同NS0細胞系，以研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)對瓶解凍時和常規(guī)細胞擴增過程中的細胞生長的作用。這些細胞系之一是未轉(zhuǎn)化為表達重組蛋白的NS0裸宿主細胞(NS0裸細胞系)。另外兩種NS0細胞系被工程化為表達治療性重組蛋白：NS0細胞系1(表達抗-IL-9抗體)和NS0細胞系2(表達抗-IL-13抗體BAK502G9)。NS0細胞系1在補充有范圍為1.5mM至2.5mM的不同濃度的NAC的兩種不同APF培養(yǎng)基(APF培養(yǎng)基1或APF培養(yǎng)基2)中解凍并擴增。NS0細胞系2在補充有范圍為0.5mM至2.5mM的NAC的三種不同的APF培養(yǎng)基(APF培養(yǎng)基1、APF培養(yǎng)基2或商業(yè)上可獲得的NS0細胞培養(yǎng)基(CD雜交瘤+來自英杰公司/吉畢科公司的膽固醇))中解凍并擴增，而未轉(zhuǎn)化的宿主細胞系(NS0裸細胞系)在補充有范圍為0.5mM至1.5mM的NAC的APF培養(yǎng)基2中解凍。從西格瑪公司獲得NAC并且將其直接添加到培養(yǎng)基中或者以100mM濃度溶解于水中，之后以適當濃度添加到培養(yǎng)基中。所有三種培養(yǎng)基(APF培養(yǎng)基1、APF培養(yǎng)基2、以及CD雜交瘤+來自英杰公司/吉畢科公司的膽固醇)均支持NS0細胞的生長，如圖1-圖12中所示的。APF培養(yǎng)基1和APF培養(yǎng)基2含有標準細胞培養(yǎng)組分，包括：氨基酸、維生素、脂質(zhì)、糖、小肽、pH緩沖劑、微量金屬、無機鹽、核苷、核苷前體、表面活性劑、還原劑、膽固醇、脂質(zhì)以及抗氧化劑。

在瓶解凍之前，將培養(yǎng)基的溫度和pH在6％CO2孵育箱中在37℃下平衡最少1小時，同時在攪拌器上以120rpm攪拌。將瓶用37℃水浴解凍并且將全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到平衡的培養(yǎng)基中。獲得用貝克曼公司(Beckman)Vi-Cell(基于圖像的細胞活力分析器)進行的細胞計數(shù)，以測量活細胞密度和活力。

使用每次傳代的前3至4天(即指數(shù)生長期)過程中的活細胞密度，以計算在瓶解凍(當細胞從解凍中復蘇時)之后的前幾天過程和隨后的細胞傳代(當細胞完全復蘇并在代與代之間達到一致的倍增時間時)過程中的群體倍增時間。

表達抗-IL-9單克隆抗體的NS0細胞(即NS0細胞系1)是處于冷凍貯存物中。在補充有不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基(即APF培養(yǎng)基1或APF培養(yǎng)基2)中解凍冷凍的NS0細胞系1細胞并且使用指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算如上所述的平均細胞倍增時間。

圖1示出由冷凍貯存物解凍的細胞在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基1)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基1中的NS0細胞系1細胞倍增時間。與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞系1細胞(57.6小時)相比，添加1.5mM至2.5mM NAC(1.5mM、2.0mM或2.5mM NAC)減少了瓶解凍的平均細胞倍增時間(分別是55.6小時、48.4小時和53.9小時)。在不受理論約束的情況下，在2mM與2.5mM之間倍增時間的輕微增加可能是由于溶液重量摩爾滲透壓濃度的增加，特別是當NS0細胞可能在解凍過程中對重量摩爾滲透壓濃度敏感時。

圖2示出由冷凍貯存物解凍的細胞在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基2)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基2中的NS0細胞系1細胞倍增時間。類似于使用APF培養(yǎng)基1觀察到的結(jié)果，與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞系1細胞(109.8小時)相比，將1.5mM至2.5mM NAC(1.5mM、2.0mM或2.5mM NAC)添加到APF培養(yǎng)基2中也減少了瓶解凍時的細胞倍增時間(分別是47.5小時、56.9小時和47.7小時)。

這些實驗顯示在瓶解凍過程中將N-乙酰半胱氨酸(約1.5mM至約2.5mM；或約1.5mM、約2.0mM或約2.5mM)添加至NS0細胞的細胞培養(yǎng)基中增加了細胞活力、細胞生長并且減少了細胞倍增時間。

實例2.NS0細胞系2在APF培養(yǎng)基1、APF培養(yǎng)基2和CD雜交瘤培養(yǎng)基中在瓶解凍時的細胞倍增時間

表達單克隆抗體(即抗-IL-13抗體BAK502G9)的NS0細胞(即NS0細胞系2)是處于冷凍貯存物中。在補充有不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基(即APF培養(yǎng)基1、APF培養(yǎng)基2或補充有膽固醇(1X英杰公司膽固醇脂質(zhì)濃縮物)的CD雜交瘤培養(yǎng)基(吉畢科公司))中解凍冷凍的NS0細胞系2細胞并且使用指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算如實例1所述的平均細胞倍增時間。

圖3示出由冷凍貯存物解凍的細胞在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基1)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基1中的NS0細胞系2細胞倍增時間。與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞系2細胞(44.6小時)相比，添加0.5mM至2.5mM NAC(0.5mM、1.0mM或2.5mM NAC)減少了瓶解凍時的平均細胞倍增時間(分別是39.6小時、41.6小時和37.5小時)，其中2.5mM NAC顯示瓶解凍時的細胞倍增時間的最大減少。

圖4示出由冷凍貯存物解凍的細胞在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基2)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基2中的NS0細胞系2細胞倍增時間。類似于使用APF培養(yǎng)基1觀察到的結(jié)果，與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞系2細胞(77.0小時)相比，添加0.5mM至2.0mM NAC(0.5mM、1.0mM或2.0mM NAC)減少了瓶解凍時的平均細胞倍增時間(分別是57.7小時、37.0小時和39.7小時)，其中1.0mM和2.0mM顯示瓶解凍時的細胞倍增時間的最大減少。

圖5示出由冷凍貯存物解凍的細胞在對照培養(yǎng)基(補充有1X英杰公司膽固醇脂質(zhì)濃縮物而無NAC的CD雜交瘤培養(yǎng)基(吉畢科公司))和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基中的NS0細胞系2細胞倍增時間。類似于使用APF培養(yǎng)基1和APF培養(yǎng)基2觀察到的結(jié)果，與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞系2細胞(35.5小時)相比，添加1.0mM至2.0mM NAC減少了瓶解凍時的平均細胞倍增時間(分別是34.7小時、30.6小時和30.9小時)，其中1.0mM和2.0mM顯示瓶解凍時的細胞倍增時間的最大減少。

這些實驗顯示在瓶解凍時將N-乙酰半胱氨酸(約0.5mM至約2.5mM；或約0.5mM、約1.0mM、約2.0mM或約2.5mM)添加至NS0細胞的細胞培養(yǎng)基中增加了細胞活力、細胞生長并且減少了細胞倍增時間。

實例3.NS0裸細胞系在APF培養(yǎng)基2中在瓶解凍時的細胞倍增時間

未用異源蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染的NS0細胞(即NS0裸細胞系)處于冷凍貯存物中。在補充有不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)的無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基(即APF培養(yǎng)基2)中對冷凍的NS0裸細胞系細胞進行解凍并且使用指數(shù)生長期過程中的活細胞密度計算如實例1中所述的平均細胞倍增時間。

圖6示出了從冷凍貯存物中解凍的細胞在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基2)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基中的NS0裸細胞系細胞倍增時間。類似于實例1和2中所報道的結(jié)果，與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0裸細胞系細胞(67.8小時)相比，添加0.5mM至1.5mM NAC(0.5mM、1.0mM或1.5mM NAC)減少了瓶解凍時的細胞倍增時間(分別是36.8小時、38.4小時和57.9小時)，其中0.5mM和1.0mM顯示瓶解凍時的細胞倍增時間減少最大。

這些結(jié)果當與實例1和2中概括的結(jié)果一起考慮時揭示了在補充有濃度為0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、以及2.5mM(例如約0.5mM至約2.5mM)的N-乙酰半胱氨酸的三種不同培養(yǎng)基中解凍的三種NS0細胞系一致地顯示出與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞相比增加的細胞活力、細胞生長和減少的瓶解凍時的細胞倍增時間。

實例4.NS0細胞系1在APF培養(yǎng)基1和2中在細胞擴增過程中的細胞倍增時間

在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基(即APF培養(yǎng)基1或APF培養(yǎng)基2)中對表達抗-IL-9單克隆抗體的NS0細胞(即NS0細胞系1)進行培養(yǎng)。將實例1中所述的瓶解凍研究中使用的細胞分到相同培養(yǎng)基(補充有不同濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基1或APF培養(yǎng)基2)中并且允許在隨后的傳代中復蘇這些細胞直到代與代之間達到一致的倍增時間。使用在復蘇之后指數(shù)生長期過程的活細胞密度，計算如實例1中所述的平均細胞倍增時間。

圖7和表2示出了在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基1)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基1中在細胞擴增過程中的NS0細胞系1細胞倍增時間。與在對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NS0細胞系1細胞相比，添加1.5mM至2.0mM NAC(1.5mM或2.0mM)減少了在細胞擴增過程中的平均細胞倍增時間。誤差棒表示平均倍增時間的1標準偏差(1S.D.)。

圖8和表3示出了在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基2)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基2中在擴增過程中的NS0細胞系1細胞倍增時間。類似于使用APF培養(yǎng)基1所觀察到的結(jié)果，與在對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NS0細胞系1細胞相比，添加1.5mM至2.5mM NAC(1.5mM、2.0mM或2.5mM NAC)減少了在擴增過程中的平均細胞倍增時間。誤差棒表示平均倍增時間的1標準偏差(1S.D.)。

這些實驗顯示了在NS0細胞進行擴增的同時添加N-乙酰半胱氨酸(約1.5mM至約2.5mM；或約1.5mM、約2.0mM或約2.5mM NAC)增加了細胞活力、細胞生長并且減少了細胞倍增時間。另外，1.5mM和2.0mM的N-乙酰半胱氨酸濃度一致地增加了在兩種不同培養(yǎng)基中正經(jīng)歷細胞擴增的NS0細胞系1細胞的細胞活力、細胞生長并減少了細胞倍增時間。

實例5.NS0細胞系2在APF培養(yǎng)基1、APF培養(yǎng)基2和CD雜交瘤培養(yǎng)基中在細胞擴增過程中的細胞倍增時間

在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基(即APF培養(yǎng)基1、APF培養(yǎng)基2或補充有膽固醇(1X英杰公司膽固醇脂質(zhì)濃縮物)的CD雜交瘤培養(yǎng)基(吉畢科公司))中培養(yǎng)表達單克隆抗體(即抗-IL-13抗體BAK502G9)的NS0細胞(即NS0細胞系2)。將實例2中所述的瓶解凍研究中使用的細胞分到補充有不同濃度的N-乙酰半胱氨酸的相同培養(yǎng)基(APF培養(yǎng)基1、APF培養(yǎng)基2或CD雜交瘤培養(yǎng)基+膽固醇)中并且允許這些細胞在隨后的傳代中復蘇直到達到一致的代與代之間的倍增時間。使用在復蘇之后指數(shù)生長期過程的活細胞密度，計算如實例1中所述的平均細胞倍增時間。

圖9和表4示出在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基1)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基1中在擴增過程中的NS0細胞系2細胞倍增時間。與在對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞系2細胞相比，添加0.5mM至2.5mM NAC(0.5mM、1.0mM或2.5mM)減少了擴增過程中的平均細胞倍增時間，其中1.0mM和2.5mM NAC顯示擴增過程中的細胞倍增時間的最大減少。誤差棒表示平均倍增時間的1標準偏差(1S.D.)。

圖10和表5示出在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基2)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基2中在擴增過程中的NS0細胞系2細胞倍增時間。類似于使用APF培養(yǎng)基1觀察到的結(jié)果，與在對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NS0細胞系2細胞相比，添加0.5mM至2.0mM NAC(0.5mM、1.0mM或2.0mM)減少了在擴增過程中的平均細胞倍增時間。誤差棒表示平均倍增時間的1標準偏差(1S.D.)。

圖11和表6示出在對照培養(yǎng)基(補充有1X英杰公司膽固醇脂質(zhì)濃縮物而無NAC的CD雜交瘤培養(yǎng)基(吉畢科公司))和含有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的對照培養(yǎng)基中在細胞擴增過程中的NS0細胞系2細胞倍增時間。類似于使用APF培養(yǎng)基1和APF培養(yǎng)基2觀察到的結(jié)果，與在對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的NS0細胞系2細胞相比，添加1.0mM至2.0mM NAC減少了平均細胞倍增時間。誤差棒表示平均倍增時間的1標準偏差(1S.D.)。

這些實驗顯示在擴增過程中將N-乙酰半胱氨酸(約0.5mM至約2.5mM；或約0.5mM、約1.0mM、約2.0mM或約2.5mM NAC)添加至NS0細胞的細胞培養(yǎng)基中增加了細胞活力、細胞生長并且減少了細胞倍增時間。

實例6.NS0裸細胞系在APF培養(yǎng)基2中在細胞擴增過程中的細胞倍增時間

在無動物蛋白(APF)培養(yǎng)基(即APF培養(yǎng)基2)中培養(yǎng)未用異源蛋白轉(zhuǎn)染的NS0細胞(即NS0裸細胞系)。將實例3中所述的瓶解凍研究中使用的細胞分到相同培養(yǎng)基(補充有不同濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基2)中并且允許這些細胞在隨后的傳代中復蘇直到達到一致的代與代之間的倍增時間。使用在復蘇之后指數(shù)生長期過程的活細胞密度，計算如實例1中所述的平均細胞倍增時間。

圖12和表7示出在對照培養(yǎng)基(無NAC的APF培養(yǎng)基2)和補充有三個增加濃度的N-乙酰半胱氨酸的APF培養(yǎng)基2中在擴增過程中的NS0裸細胞系細胞倍增時間。與在對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的裸細胞系細胞相比，添加0.5mM至1.5mM NAC(0.5mM、1.0mM或1.5mM NAC)減少了在擴增過程中的細胞倍增時間。誤差棒表示平均倍增時間的1標準偏差(1S.D.)。

這些結(jié)果當與實例4和5中概括的結(jié)果一起時顯示了在補充有濃度為0.5mM、1.0mM、1.5mM和2.0mM(例如約0.5mM至約2.0mM)的N-乙酰半胱氨酸的三種不同NS0培養(yǎng)基中培養(yǎng)的三種NS0細胞系與對照培養(yǎng)基中解凍的NS0細胞相比一致地具有增加的細胞活力、細胞生長和減少的細胞擴增過程中的細胞倍增時間。

等效物

前述書面說明書被認為足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`這些實施例。前述說明和實例詳述了某些實施例，并且描述了諸位發(fā)明人所期望的最佳模式。然而，將了解到，無論前述內(nèi)容以文本形式表現(xiàn)的如何詳細，這些實施例仍可以許多方式實踐，并且權(quán)利要求書包括其任何等效物。

如在此所用的，術(shù)語約是指數(shù)值，包括例如整數(shù)、分數(shù)和百分比，無論是否明確指示。術(shù)語約通常是指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認為等效于所引用值(例如，具有相同功能或結(jié)果)的數(shù)值范圍(例如所引用值的+/-5％)。在一些情況下，術(shù)語約可以包括四舍五入到最近的有效數(shù)字的數(shù)值。

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在本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請、和/或其他參考文獻出于所有目的通過引用以其全部內(nèi)容而結(jié)合，在程度上就像每個單獨的出版物、專利、專利申請、和/其他文件被單獨地指出以出于所有目的通過引用而結(jié)合相同。