本發(fā)明涉及生產(chǎn)天然色素的方法。特別地，本發(fā)明涉及生產(chǎn)梔子藍色素的方法。
發(fā)明背景
梔子藍色素是廣泛用于食品、藥品和化妝品行業(yè)中的水溶性天然色素。
目前，梔子藍色素通常由茜草科的梔子(Gardenia Jasminoides Ellis)中所含的原料京尼平苷通過以下方法來生產(chǎn)：用β-葡糖苷酶處理京尼平苷以得到京尼平，京尼平與氨基酸反應(yīng)得到梔子藍色素(參見吳拾荊(Shijing WU)等人，《全國食品添加劑通訊》(National Food Additive Communications)，1992(3)：90-93)。然而，通過這種方法獲得的梔子藍色素是深色的，其具有低色值且品質(zhì)低劣。所以它不適合某些應(yīng)用例如飲料(參見例如CN103509368A和CN102021210A)。
陳峰(Feng CHEN)公開了一種生產(chǎn)具有高色值的梔子藍色素的方法，所述方法包括：將由京尼平與氨基酸的反應(yīng)獲得的梔子藍色素超濾以除去殘留的京尼平苷，然后萃取濾液以得到高色值的梔子藍色素(參見CN103525883A)。Lijun SUN等人公開了另一種方法，所述方法包括：使原料京尼平苷穿過大網(wǎng)孔非極性樹脂以除去α-藏紅花素，然后用β-葡糖苷酶處理(孫力軍(Lijun SUN)等人，《南京農(nóng)業(yè)大學學報》(Journal of Nanjing Agricultural University)，1994，17(4)：98-101)。然而，這些方法涉及高成本和復(fù)雜的操作，并且不適于在工業(yè)上大規(guī)模進行。
因此，仍然需要易于操作且適合工業(yè)的用于生產(chǎn)梔子藍色素的新方法，其中所述梔子藍色素鮮艷且適合工業(yè)應(yīng)用。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)梔子藍色素的新方法，所述方法包括以下步驟：
a)用糖苷酶處理京尼平苷以獲得水解產(chǎn)物；和
b)用溶劑萃取在步驟a)中獲得的水解產(chǎn)物，并在萃取后除去所述溶劑以獲得包含京尼平的產(chǎn)物；和
c)使在步驟b)中獲得的包含京尼平的產(chǎn)物與氨基酸和/或其鹽的水溶液反應(yīng)以產(chǎn)生所述梔子藍色素，優(yōu)選地將所述包含京尼平的產(chǎn)物溶解在水溶性溶劑中得到溶液并使用該溶液本身；和
d)任選地，純化在步驟c)中產(chǎn)生的梔子藍色素。
通過本發(fā)明的方法獲得的梔子藍色素是天藍色的，比藍色(例如通過已知方法產(chǎn)生的群青藍)更鮮艷。此外，獲得的梔子藍色素大部分具有＞100的色值，因此可以在工業(yè)應(yīng)用中使用低劑量。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)梔子藍色素的方法，所述梔子藍色素是天藍色的并且可以具有＞100的色值。特別地，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
a)用糖苷酶處理京尼平苷以獲得水解產(chǎn)物；和
b)用溶劑萃取在步驟a)中獲得的水解產(chǎn)物，并在萃取后除去所述溶劑以獲得包含京尼平的產(chǎn)物；和
c)使在步驟b)中獲得的包含京尼平的產(chǎn)物與氨基酸和/或其鹽的水溶液反應(yīng)以產(chǎn)生所述梔子藍色素，優(yōu)選地將所述包含京尼平的產(chǎn)物溶解在水溶性溶劑中得到溶液并使用該溶液本身。
在所述方法中，用作原料的京尼平苷可來自各種來源。其可以通過任何已知的方法，例如，中國專利公開CN102732050A中所公開的方法，通過萃取果實梔子(Gardenia Jasminoides Ellis)獲得。此外，京尼平苷粉末(其含有約20重量％至約70重量％的京尼平苷并且可商購)和從梔子黃生產(chǎn)獲得的廢物流(其含有約40重量％的京尼平苷并且也可商購)可直接或在簡單精煉之后用在所述方法中(參見CN103509368A、CN103525883A等)。
根據(jù)國際生物化學和分子生物學聯(lián)盟命名委員會的建議通過酶所催化的反應(yīng)而對酶進行命名和分類，糖苷酶是在EC 3.2.1下的酶。優(yōu)選地，糖苷酶是纖維素酶(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)。糖苷酶的實例包括但不限于可從Sunson Biotechnology有限公司(中國廣州)商購的纖維素酶、可從DSM(中國)有限公司(中國上海)商購的Cellulase 4000和可從DSM(中國)有限公司(中國上海)商購的糖苷酶可以以每1g京尼平苷0.01g至0.8g的量、優(yōu)選地0.05g至0.5g的量、更優(yōu)選地0.1g至0.3g的量加入步驟a)的反應(yīng)中。
步驟a)的處理可以在3.0至6.5的pH范圍內(nèi)進行，優(yōu)選地在3.6至6.0的pH范圍內(nèi)進行，更優(yōu)選地在4.0至4.6的pH范圍內(nèi)進行。優(yōu)選地，步驟a)的處理在可提供上述pH范圍的緩沖溶液中進行。這種緩沖溶液是本領(lǐng)域已知的，其實例包括但不限于HCOOH/NaOAc水溶液或檸檬酸/Na2HPO4水溶液。緩沖溶液可以以每1g京尼平苷8mL至80mL的量、優(yōu)選地10mL至50mL的量、更優(yōu)選地20mL至40mL的量添加。
步驟a)的處理可以在約20℃至約60℃的溫度范圍內(nèi)進行，優(yōu)選地在約50℃的溫度下進行。
步驟a)的反應(yīng)可持續(xù)約10小時至約30小時。獲得的水解產(chǎn)物含有京尼平作為主要組分和其它組分。水解產(chǎn)物可直接用于步驟b)中的萃取。
在現(xiàn)有方法中，通常使從步驟a)獲得的水解產(chǎn)物與氨基酸直接反應(yīng)以產(chǎn)生梔子藍色素。然而，從現(xiàn)有方法獲得的梔子藍色素是深色的，并且不利于某些工業(yè)應(yīng)用(例如飲料)。本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)：步驟b)的額外萃取導(dǎo)致天藍色的鮮藍色素，其更適合用于工業(yè)應(yīng)用(例如飲料)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，用于步驟b)中的萃取的溶劑很重要并且可以是適合于本發(fā)明目的的任何一種，其實例包括但不限于二乙醚，乙酸乙酯，丁醇，丁醇與石油和/或己烷的混合物，或其混合物。在溶劑是丁醇與石油和/或己烷的混合物的實施方式中，丁醇與己烷和/或己烷的體積比在1∶5至5∶1的范圍內(nèi)、優(yōu)選地在1∶3至3∶1的范圍內(nèi)、更優(yōu)選在1∶2至2∶1的范圍內(nèi)。
步驟b)中使用的溶劑的量可以為每1mL水解產(chǎn)物1mL至5mL、優(yōu)選地1.5mL至3mL。步驟b)的萃取可以在10℃至60℃范圍內(nèi)的溫度下進行，優(yōu)選地在室溫下進行。根據(jù)本發(fā)明，步驟b)的萃取可以重復(fù)2-4次。
在步驟b)中收集有機相并除去溶劑之后，獲得了包含京尼平的產(chǎn)物。也可以回收溶劑。萃取程序和在萃取期間用于收集溶劑和除去/回收溶劑的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。因此，這里不再詳細討論。
本領(lǐng)域已知梔子藍色素是京尼平與氨基酸或其鹽的反應(yīng)產(chǎn)物。因此，作為所述方法的步驟c)，使在步驟b)中獲得的包含京尼平的產(chǎn)物與氨基酸或其鹽反應(yīng)以產(chǎn)生梔子藍。在本發(fā)明中，適合該反應(yīng)的氨基酸可以選自谷氨酸鹽、苯丙氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸及其混合物。所述鹽可以是任何堿金屬鹽，例如鈉鹽。優(yōu)選地，所述鹽是谷氨酸鈉。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：步驟c)中使用的氨基酸和鹽也很重要，這是因為它們能夠提供本發(fā)明所公開的天藍色。
在本發(fā)明中，使用氨基酸或其鹽的水溶液與包含京尼平的產(chǎn)物反應(yīng)以提供梔子藍色素，并且水溶液的添加量使得提供的步驟c)的反應(yīng)混合物中京尼平與氨基酸之間的摩爾比為1∶0.5-2、優(yōu)選地1∶0.7-1.5。
此外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)：將包含京尼平的產(chǎn)物溶解在水溶性溶劑中形成均勻的反應(yīng)體系有助于步驟c)中的反應(yīng)。因此，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地將從步驟b)獲得的包含京尼平的產(chǎn)物溶解在水溶性溶劑中。水溶性溶劑可以是本領(lǐng)域已知的能夠溶解包含京尼平的產(chǎn)物的任何一種，其實例包括但不限于C1-10烷醇例如甲醇和乙醇，以及C3-10酮例如丙酮。優(yōu)選地，水溶性溶劑是甲醇、乙醇或丙酮或其任何混合物。
步驟c)的反應(yīng)可在約40℃至約90℃，優(yōu)選地約60℃至80℃，例如65℃、70℃和75℃下進行?？梢酝ㄟ^任何已知的方法(例如HPLC和TLC)監(jiān)測反應(yīng)的進程。
優(yōu)選地，在7.0-11、更優(yōu)選地8-9.5范圍內(nèi)的pH值下進行步驟c)。在一些實施方式中，添加堿以將步驟c)的反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)至合適的pH值，所述堿選自但不限于NaOH、KOH、NaCO3和NaHCO3。
反應(yīng)完成后，通過除去反應(yīng)混合物中的有機溶劑和水，可以獲得固體形式的梔子藍色素。因此，本發(fā)明的方法任選地進一步包括以下步驟：通過例如凍干或噴霧干燥除去溶劑和水以提供梔子藍色素固體。
任選地，可通過本領(lǐng)域已知的任何程序(例如超濾)進一步純化所獲得的梔子藍色素，以獲得甚至更純的梔子藍色素。本發(fā)明的方法產(chǎn)生了梔子藍色素，其是天藍色的，比藍色(例如通過已知方法產(chǎn)生的群青藍)更鮮艷，因此更受某些工業(yè)應(yīng)用(例如飲料)的歡迎。
此外，獲得的梔子藍色素大部分具有＞100的色值，這意味著可以在工業(yè)應(yīng)用中使用低劑量。另外，通過額外的萃取步驟，出乎意料地，可以容易地從反應(yīng)混合物中分離和純化所獲得的梔子藍色素而無需復(fù)雜的操作。
通過以下實施例進一步說明本發(fā)明。這些實施例不旨在以任何方式限制本發(fā)明。
實施例
在以下實施例中，根據(jù)中國國家標準GB 28311-2012測量最大吸收波長和色值。
實施例1
將6.7g購自嘉天生物科技(Jiatian Biotechnology)有限公司(中國西安)的京尼平苷粉末(35.5重量％)加入47mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.0)中。進一步加入685.7mg購自Sunson Biotechnology有限公司(中國廣州)的纖維二糖酶，在50℃下反應(yīng)19小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用90mL乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物2次。真空濃縮乙酸乙酯相以獲得粗品京尼平。
將獲得的粗品京尼平溶解在16mL無水乙醇中以獲得19.4g溶液(4.79重量％京尼平，通過HPLC)。將在10mL去離子水中的970mg谷氨酸鈉加入該溶液中，在70℃下反應(yīng)25小時。TLC表明京尼平已完全轉(zhuǎn)化。
將反應(yīng)液凍干，獲得了2.1g固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長為601nm且色值為155。
實施例2
將20g購自潛江市綠海寶生物技術(shù)(Qianjiang Green Sea Treasury Biotechnology)有限公司(中國湖北)的梔子黃的廢料(40重量％京尼平苷)加入140mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.6)中。進一步加入800mg購自DSM(中國)有限公司(中國上海)的在50℃下反應(yīng)16小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用250mL乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物2次。真空濃縮乙酸乙酯相以獲得粗品京尼平。
將獲得的粗品京尼平溶解在30mL無水乙醇中以獲得34.8g溶液(8.4重量％京尼平，通過HPLC)。向2個含有4.0g溶液的反應(yīng)燒瓶中，分別加入在8mL去離子水中的299.6mg組氨酸和在6mL去離子水中的310.5mg精氨酸，在70℃下反應(yīng)30小時。
將反應(yīng)液凍干，獲得了固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長和色值如表1中所示。
表1
實施例3
將8g購自潛江市綠海寶生物技術(shù)(Qianjiang Green Sea Treasury Biotechnology)有限公司(中國湖北)的梔子黃的廢料(40重量％京尼平苷)加入64mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.5)中。進一步加入320mg購自DSM(中國)有限公司(中國上海)的在50℃下反應(yīng)17小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用100mL乙醚萃取反應(yīng)混合物2次。真空濃縮乙醚相以獲得粗品京尼平。
將獲得的粗品京尼平溶解在28mL無水乙醇中以獲得30.1g溶液(4.10重量％京尼平，通過HPLC)。向含有6g溶液的反應(yīng)燒瓶中，加入在16mL去離子水中的185.4mg異亮氨酸，在65℃下反應(yīng)33小時。
將反應(yīng)液凍干，獲得了420mg固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長為600nm且色值為87。
實施例4
將10g購自潛江市綠海寶生物技術(shù)(Qianjiang Green Sea Treasury Biotechnology)有限公司(中國湖北)的梔子黃的廢料(40重量％京尼平苷)加入70mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.6)中。進一步加入400mg購自DSM(中國)有限公司(中國上海)的在50℃下反應(yīng)30小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用120mL乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物2次。真空濃縮乙酸乙酯相以獲得粗品京尼平。
將獲得的粗品京尼平溶解在16mL無水乙醇中以獲得15.02g溶液(10.62重量％京尼平，通過HPLC)。將在10mL去離子水中的1.31g谷氨酸鈉加入該溶液中，在65℃下反應(yīng)33小時。
將反應(yīng)液凍干，獲得了3.0g固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長為598nm且色值為132.6。
實施例5
將10g購自潛江市綠海寶生物技術(shù)(Qianjiang Green Sea Treasury Biotechnology)有限公司(中國湖北)的梔子黃的廢料(40重量％京尼平苷)加入70mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.6)中。進一步加入2g購自Sunson Biotechnology有限公司(中國廣州)的纖維二糖酶，在50℃下反應(yīng)30小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用120mL乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物2次。真空濃縮乙酸乙酯相以獲得粗品京尼平。
將獲得的粗品京尼平溶解在12mL無水乙醇中以獲得11.95g溶液(12.38重量％京尼平，通過HPLC)。將在10mL去離子水中的1.21g谷氨酸鈉加入該溶液中，在65℃下反應(yīng)33小時。
將反應(yīng)液凍干，獲得了2.9g固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長為594nm且色值為143.9。
實施例6
將10g購自潛江市綠海寶生物技術(shù)(Qianjiang Green Sea Treasury Biotechnology)有限公司(中國湖北)的梔子黃的廢料(40重量％京尼平苷)加入70mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.0)中。進一步加入1.2g購自Sunson Biotechnology有限公司(中國寧夏)的纖維二糖酶，在50℃下反應(yīng)15小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用100mL 2/1的丁醇/石油混合物萃取反應(yīng)混合物3次。真空濃縮有機相以獲得粗品京尼平。
將獲得的粗品京尼平溶解在30mL無水乙醇中以獲得26.0g溶液(6.5重量％京尼平，通過HPLC)。將在30mL去離子水中的1.77g谷氨酸鈉加入該溶液中，在75℃下反應(yīng)23小時。TLC表明京尼平已完全轉(zhuǎn)化。
將反應(yīng)液凍干，獲得了2.8g固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長為594nm且色值為140。
實施例7
將40g購自河南中大恒源生物科技(Henan Zhongda Hengyuan Biotechnology)有限公司(中國河南)的梔子黃的廢料(40重量％京尼平苷)加入280mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.0)中。進一步加入4.6g購自Sunson Biotechnology有限公司(中國寧夏)的纖維二糖酶，在50℃下反應(yīng)19小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用300mL乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物3次。真空濃縮有機相以獲得粗品京尼平(純度70.8％，QNMR)。
在燒瓶中加入1mL乙醇以溶解50mg上述粗品京尼平固體。分別將116.4mg苯丙氨酸和92.4mg亮氨酸溶解并用0.1N NaOH調(diào)節(jié)至pH為9.2和pH為9.63，然后加入燒瓶中，在80℃下反應(yīng)約5小時。
將反應(yīng)液凍干，獲得了固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長和色值如下表2中所示。
表2
實施例8-對比例
將8g購自遠洋生物工程(YuanYang Bio-engineering)有限公司(中國西安)的京尼平苷粉末(60重量％京尼平苷)加入64mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.6)中。進一步加入240mg購自DSM(中國)有限公司(中國上海)的Cellulase 4000，在50℃下反應(yīng)24小時。然后向反應(yīng)混合物中加入2.0g谷氨酸鈉，在50℃下反應(yīng)96小時。
將反應(yīng)混合物過濾、通過超濾純化，然后凍干，獲得了2.8g固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長為591nm且色值為11.25。
實施例9-對比例
將10g購自潛江市綠海寶生物技術(shù)(Qianjiang Green Sea Treasury Biotechnology)有限公司(中國湖北)的梔子黃的廢料(40重量％京尼平苷)加入70mL檸檬酸/Na2HPO4緩沖水溶液(pH 4.5)中。進一步加入400mg購自DSM(中國)有限公司(中國上海)的在50℃下反應(yīng)18小時。將反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用100mL醚萃取反應(yīng)混合物2次。真空濃縮醚酯相以獲得粗品京尼平。
將獲得的粗品京尼平溶解在28mL無水乙醇中以獲得30g溶液(3.67重量％京尼平，通過HPLC)，將在15mL去離子水中的741mg纈氨酸加入該溶液中，在70℃下反應(yīng)35小時。
將反應(yīng)液凍干，獲得了1.8g固體粉末形式的梔子藍色素，其最大吸收波長為590nm且色值為104。
實施例10
比較從上述實施例1-7和對比例8-9獲得的梔子藍。根據(jù)工業(yè)國際標準比色圖表(“IISCC”)，從實施例1-7獲得的梔子藍色素被稱為“天藍色”，而從對比例8-9獲得的梔子藍色素被稱為“群青藍”。表3示出了結(jié)果。顯然，“天藍色”比“群青藍”更鮮艷。
表3