IgE在介導(dǎo)I型過(guò)敏反應(yīng)引起的過(guò)敏性疾病中扮演核心的角色。疾病包括過(guò)敏性哮喘、過(guò)敏性鼻炎、異位性皮膚炎、和其他癥狀。過(guò)敏反應(yīng)源自于免疫系統(tǒng)對(duì)于無(wú)害的環(huán)境物質(zhì)，如塵螨、樹(shù)和草粉、某種食物、昆蟲(chóng)叮咬、和其他物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)。在致敏化的個(gè)體中，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)個(gè)體致敏化之特定抗原的IgE。在過(guò)敏性反應(yīng)里，藉由致敏的個(gè)人吸入、食入、或透過(guò)皮膚進(jìn)入之抗原，結(jié)合至嗜堿性細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面上的IgE，造成IgE的交聯(lián)和IgE.Fc的下層受體(I型IgE.Fc受體或FcεRI)的聚集，導(dǎo)致那些發(fā)炎細(xì)胞釋放引起過(guò)敏的藥理介質(zhì)，如組織胺、白三烯、胰蛋白酶、細(xì)胞因子、和趨化因子，這些肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞釋放的介質(zhì)造成各種過(guò)敏的病理表征。

編碼免疫球蛋白主型和亞型的基因，包括μ、δ、γ、α和ε鏈的恒定區(qū)，分別在人、小鼠或其他哺乳動(dòng)物相應(yīng)的基因組里，皆簇立在一條連續(xù)的編碼區(qū)和內(nèi)含子的染色體中。在人類(lèi)和小鼠中皆存在著數(shù)個(gè)γ亞型和一個(gè)官能ε主型。免疫球蛋白主型和亞型的表達(dá)與穩(wěn)定性，皆受到一群由B和T淋巴細(xì)胞與其它細(xì)胞類(lèi)型所表達(dá)的調(diào)控因子和受體、以及一個(gè)大系列的免疫球蛋白基因中的片段/元素的DNA所調(diào)節(jié)。

在五種免疫球蛋白主型中，IgE在非致敏性個(gè)人的血清里，通常只有微量的濃度，一般分布在10至400毫微克/毫升的范圍(Hellman 2007)。相較于在小鼠、大鼠、兔子和其他哺乳動(dòng)物的IgG、IgM和IgA濃度，IgE的濃度是非常低的。在制備分泌針對(duì)免疫動(dòng)物宿主的抗原特異性之單株抗體的小鼠或大鼠融合瘤中，分泌IgE的融合瘤是極其少數(shù)且很難獲得的；相比之下，IgG是血漿中主要的免疫球蛋白主型，其血清濃度通常在8～16毫克/毫升的范圍內(nèi)(Hellman 2007)，在制備小鼠或大鼠融合瘤中，IgG是融合瘤分泌的主要免疫球蛋白主型。

分泌小分子抗原、卵清蛋白或過(guò)敏原成分特異性小鼠IgE之融合瘤可透過(guò)使用一般細(xì)胞融合技術(shù)，將抗原免疫后的小鼠或大鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合來(lái)制備(Bottcher 1980，Bohn 1982，Akihiro 1996，Hanashiro 1996，Susanne 2003)。通常既使從幾百株融合瘤中也無(wú)法獲得一株抗原特異性IgE融合瘤，其大部分是分泌IgG異構(gòu)型。Yu的團(tuán)隊(duì)建構(gòu)一種IgE嵌入小鼠品系，該小鼠編碼小鼠Igγ1恒定區(qū)的DNA序列被編碼小鼠Igε恒定區(qū)的序列替代(Yu 2013)。相較于原生型小鼠，那些小鼠的血清總IgE含量增加了約10倍。在體外實(shí)驗(yàn)用脂多醣和白介素-4的刺激下，自基因嵌入小鼠的脾臟中分離出表達(dá)IgE的淋巴細(xì)胞數(shù)量也顯著增加。Zarrin的團(tuán)隊(duì)建構(gòu)一只SμKI小鼠品系，其中，Igε重鏈基因的轉(zhuǎn)換區(qū)域置換成小鼠Igμ重鏈基因的轉(zhuǎn)換區(qū)域(Zarrin 2013)；轉(zhuǎn)換區(qū)域?yàn)橐粭lIg重鏈基因上游的保留的DNA序列，扮演在免疫球蛋白異構(gòu)型之間轉(zhuǎn)換的角色。在使用SμKI小鼠制備的融合瘤中，與使用原生型小鼠的結(jié)果相比，產(chǎn)生分泌IgE的融合瘤百分比和IgE與IgG融合瘤細(xì)胞數(shù)的比率皆增加。

在我們的發(fā)明之前，尚未有科學(xué)論文或?qū)＠_(kāi)內(nèi)容描述透過(guò)融合小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞的傳統(tǒng)步驟來(lái)制備融合瘤，且此融合瘤分泌特異性地針對(duì)一個(gè)明確的蛋白質(zhì)成分的人類(lèi)或“人源化”IgE。由于人的周邊血單核細(xì)胞僅含少量的B淋巴細(xì)胞，加上融合人的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤或淋巴瘤細(xì)胞株的低效率，阻礙了制備分泌人類(lèi)IgE的融合瘤。Hakamata的研究小組自健康捐血者中分離的淋巴細(xì)胞在體外以細(xì)胞因子活化和螨蟲(chóng)萃取物處理，制備具有螨蟲(chóng)萃取物特異性IgE的融合瘤(Hakamata 2000)；其所產(chǎn)生的IgE單株抗體是針對(duì)螨蟲(chóng)提萃物具有反應(yīng)，而非針對(duì)一個(gè)明確的蛋白質(zhì)成分(Hakamata 2000)。此外，可以透過(guò)基因轉(zhuǎn)染步驟來(lái)制備分泌Der p 2特異性的嵌合型或“人源化”IgE融合瘤(Aalberse 1996)；在此研究中，將一段含有結(jié)合人類(lèi)ε恒定區(qū)和遺傳霉素抗性蛋白質(zhì)的編碼序列、以及Der p 2特異性的變異區(qū)DNA片段之重組基因，轉(zhuǎn)染至Der p 2特異性的小鼠IgE融合瘤變異株中，該變異株已經(jīng)失去其γ2b重鏈基因；經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染之細(xì)胞的藥物篩選和存活細(xì)胞株的反應(yīng)測(cè)試后，一株特異性地針對(duì)Der p 2的人源化IgE融合瘤細(xì)胞被制備出來(lái)(Aalberse 1996)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

能夠產(chǎn)生大量的多株“人源化”IgE的基因轉(zhuǎn)殖非人類(lèi)動(dòng)物被公開(kāi)。在本發(fā)明的公開(kāi)中，“人源化”IgE是指包含CH1、CH2、CH3、CH4、M1和M2之IgE免疫球蛋白ε恒定區(qū)是人類(lèi)的，而可變區(qū)是動(dòng)物自身的；M1和M2分別被兩個(gè)ε基因中的“膜外顯子”所編碼，代表兩個(gè)連續(xù)的勝肽段所形成的膜鑲嵌ε重鏈(mε)之C-末端延伸的69個(gè)氨基酸殘基的膜錨定勝肽段。在某些實(shí)施例中，人源化IgE還包括了一種IgE的形式，其ε重鏈和κ輕鏈兩者的恒定區(qū)是人的，而重鏈和輕鏈的可變區(qū)是動(dòng)物自身的；此基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物為小鼠、大鼠和兔子，其可利用基因操作和變更的方法來(lái)建構(gòu)。因此，在這些基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物中，其Cγ免疫球蛋白基因中的CH1、CH2、CH3、M1及M2的編碼序列是被對(duì)應(yīng)的人類(lèi)Cε免疫球蛋白基因的編碼序列所取代；值得注意的是，一個(gè)γ鏈僅具有三個(gè)CH結(jié)構(gòu)域，并且還具有由兩個(gè)膜外顯子編碼的C-末端膜錨定勝肽。

本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例是小鼠，且所選擇的Cγ基因是Cγ1。為進(jìn)一步提高人源化IgE的“人性”抗原特性，此基因轉(zhuǎn)殖小鼠品系與其基因組的小鼠κ鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)被相對(duì)應(yīng)的人類(lèi)κ鏈的編碼區(qū)段替換之基因轉(zhuǎn)殖小鼠品系進(jìn)行交配，以獲得帶有人類(lèi)Cε和Cκ恒定區(qū)基因的同型結(jié)合的基因轉(zhuǎn)殖小鼠品系。

本發(fā)明亦涉及如上述所建構(gòu)之基因轉(zhuǎn)殖動(dòng)物，藉以用于生產(chǎn)含有人源化IgE血清、抗原特異性人源化IgE血清與生產(chǎn)抗原特異性人源化IgE之融合瘤的應(yīng)用。對(duì)于在基因轉(zhuǎn)殖小鼠或大鼠中制備含有抗原特異性IgE抗血清和分泌抗原特異性人源化IgE的融合瘤，這些動(dòng)物被免疫特定的抗原，諸如特定種類(lèi)或區(qū)域性的塵螨、特定的樹(shù)粉或草粉、脫落的貓皮屑、或某些從食物中分離的抗原，來(lái)提升抗原特異性人源化IgE在總IgE中的比例。含有多株人源化IgE的血清、含有抗原特異性人源化IgE的抗血清、或抗原特異性人源化單株IgE抗體，可以應(yīng)用于IgE介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的患者血清IgE或抗原特異性IgE的各種免疫分析。

具體實(shí)施方式

一、改變免疫球蛋白異構(gòu)型的相對(duì)含量

免疫球蛋白重鏈基因位置(IGHC)是一個(gè)含有編碼所有重鏈主型和亞型恒定區(qū)的基因群，包括IgM的μ鏈、IgD的δ鏈、IgG的γ鏈、IgA的α鏈和IgE的ε鏈。同時(shí)在人類(lèi)與小鼠中，γ主型有四種亞型，而α主型有兩種亞型。在人類(lèi)基因組中，免疫球蛋白重鏈基因分布順序?yàn)棣?δ-γ3-γ1-α1-γ2-γ4-ε-α2，而在小鼠的基因組中，分布順序?yàn)棣?δ-γ3-γ1-γ2b-γ2a(或γ2c)-ε-α。編碼各個(gè)亞型的基因元素與其相鄰的亞型被參與主型轉(zhuǎn)換重組反應(yīng)(CSR)的轉(zhuǎn)換區(qū)(S)分開(kāi)來(lái)。

具有免疫潛能的靜止B淋巴細(xì)胞表面帶有膜鑲嵌IgM和IgD(mIgM和mIgD)。在初期抗原刺激，淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的第一個(gè)抗體是IgM主型，隨著持續(xù)或反復(fù)的抗原刺激，被活化的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)展、分化，并分泌針對(duì)抗原的抗體。此抗體反應(yīng)的重要方面是B細(xì)胞進(jìn)行自原來(lái)IgM生產(chǎn)到另一種異構(gòu)型生產(chǎn)之異構(gòu)型轉(zhuǎn)換。異構(gòu)型的調(diào)控和決定是由細(xì)胞因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄活化因子和負(fù)向調(diào)控子的作用網(wǎng)絡(luò)所介導(dǎo)。隨著抗原的刺激，訊息傳導(dǎo)路徑征募了那些調(diào)節(jié)生殖系轉(zhuǎn)錄子和各個(gè)基因轉(zhuǎn)換區(qū)域的表達(dá)因子(Chaudhuri and Alt 2004；Stavnezer and Amemiya 2004；Pan-Hammarstroem et al.2007)。實(shí)行抗體主型變化的CSR是一個(gè)刪除性的重組反應(yīng)，其中Cμ重鏈的恒定區(qū)基因被下游C_H基因替換，而插入的序列被切割成環(huán)狀DNA。CSR是由活化誘導(dǎo)脫氨酶在S區(qū)內(nèi)作用來(lái)啟動(dòng)，接著雙鏈斷裂、DNA損傷反應(yīng)/修復(fù)路徑和非同源末端的接合(Chaudhuri and Alt 2004)。不同主型和亞型免疫球蛋白的表現(xiàn)量不同，一般來(lái)說(shuō)，IgG、IgA和IgM的表現(xiàn)量比IgD和IgE高得許多；而在IgD和IgE之間，后者的表現(xiàn)量仍是低得許多。除了不同主型間有不同的產(chǎn)量外，游離的免疫球蛋白的周轉(zhuǎn)率和被受體結(jié)合的各種免疫球蛋白主型的穩(wěn)定性，有助于整體的周轉(zhuǎn)動(dòng)力學(xué)、充足量和免疫球蛋白主型的半衰期。

本發(fā)明涉及利用遺傳法來(lái)改造動(dòng)物，以便使得改造的動(dòng)物IgE成為人源化IgE，且其生產(chǎn)的量比未改變的動(dòng)物宿主IgE量更高。為實(shí)現(xiàn)此一目標(biāo)，我們使用小鼠、大鼠或兔子，因?yàn)樵谶@些動(dòng)物中的抗體基因的遺傳改造，可以利用分子生物學(xué)現(xiàn)有的工具和胚胎干細(xì)胞的操作來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且得知有關(guān)這些動(dòng)物免疫球蛋白基因復(fù)合物的信息。此外，在這些動(dòng)物中，小鼠是一個(gè)很好的選擇，因?yàn)槠渖硶r(shí)間短且制備基因轉(zhuǎn)殖品系的工具都建立的很完整。

為了增加整體IgE含量，Cγ免疫球蛋白恒定區(qū)的編碼序列，如高表現(xiàn)量的Cγ1，替換為人類(lèi)Cε恒定區(qū)的編碼序列。在這樣做時(shí)，由于啟動(dòng)子中的調(diào)節(jié)序列和小鼠自身的Cγ基因的S區(qū)被保留住，因此嵌進(jìn)人類(lèi)Cε的表達(dá)之控制可能也能達(dá)到高表現(xiàn)量。值得注意的是，因?yàn)槿祟?lèi)IgE不會(huì)被小鼠的FcεRI所辨識(shí)，因此即使它們產(chǎn)生大量的人源化IgE，基因轉(zhuǎn)殖小鼠應(yīng)該不會(huì)有不利的狀況。

二、在小鼠免疫球蛋白重鏈γ基因位置中，一個(gè)含有人類(lèi)Cε編碼序列替換小鼠Cγ1編碼序列之嵌合基因(mIGHG)的建構(gòu)。

設(shè)計(jì)的構(gòu)建體和含有小鼠IGH位置(Clone ID RP24-258E20，圖1A)之小鼠細(xì)菌人工染色體(BAC)之間的替換，經(jīng)由同源重組反應(yīng)來(lái)完成。該構(gòu)建體可以透過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在重組位點(diǎn)產(chǎn)生并入人類(lèi)CεCH1-CH2-CH3-CH4-M1-M2編碼區(qū)與兩側(cè)分別具有2000-bp小鼠Cγ1基因上游和下游序列。同源重組可以使用在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行的重組方法(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany)來(lái)進(jìn)行。具體來(lái)說(shuō)，同源重組反應(yīng)的發(fā)生分為兩個(gè)步驟；首先，一個(gè)反選擇標(biāo)記rpsL-neo取代了小鼠CH1-H-CH2-CH3-M1-M2的Cγ1編碼區(qū)，并結(jié)合至小鼠同源臂之間(如上述的2000-bp序列)，“H”表示鉸鏈區(qū)；然后，反選擇標(biāo)記被替換為人類(lèi)CH1-CH2-CH3-CH4-M1-M2之Cε編碼區(qū)。

三、小鼠免疫球蛋白κ輕鏈位置中(IGKC)，一個(gè)含有人類(lèi)Cκ編碼序列替換小鼠Cκ編碼序列之嵌合轉(zhuǎn)殖基因的構(gòu)建。

構(gòu)建體以PCR擴(kuò)增反應(yīng)在重組位點(diǎn)，產(chǎn)生并入人類(lèi)Cκ編碼區(qū)序列與兩側(cè)分別具有50-bp小鼠Cκ基因上游和下游的非編碼序列來(lái)設(shè)計(jì)。該構(gòu)建體接著藉由在大腸桿菌重組反應(yīng)的方法(Gene Bridges GmbH,Dresden,Germany)被整合到含有IGKC基因位置的小鼠BAC克隆株(Clone ID RPCI23-59O5,圖1A)。再一次，同源重組反應(yīng)發(fā)生在兩個(gè)步驟上；首先，一個(gè)反選擇標(biāo)記rpsL-neo取代小鼠Cκ編碼區(qū)，且被并入小鼠同源臂(上述的50-bp序列)之間；接著，反選擇標(biāo)記被替換為人類(lèi)Cκ編碼區(qū)。

四、帶有嵌合轉(zhuǎn)殖基因之基因轉(zhuǎn)殖小鼠的產(chǎn)生

轉(zhuǎn)殖基因傳送的方法使用胚胎干細(xì)胞(ES)。自植入前胚胎所取得的ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)并與胚胎進(jìn)行融合，轉(zhuǎn)殖基因可以透過(guò)電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的傳導(dǎo)或其他方法有效地來(lái)導(dǎo)入ES細(xì)胞。優(yōu)選的方法是電穿孔，此種轉(zhuǎn)化后的ES細(xì)胞之后可與來(lái)自非人類(lèi)動(dòng)物的胚泡結(jié)合，ES細(xì)胞隨后拓殖胚胎并貢獻(xiàn)于產(chǎn)生的嵌合動(dòng)物的胚種。

同源重組反應(yīng)亦可以用于導(dǎo)入轉(zhuǎn)殖基因。同源重組反應(yīng)可以被RecE/RecT(RecE/T)或Redα/β來(lái)介導(dǎo)。在大腸桿菌中，任何完整的、獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制的、環(huán)狀的DNA分子，皆可藉由使用一段在環(huán)狀分子中，其兩側(cè)有相同DNA序列的短區(qū)域之線性DNA片段，透過(guò)RecE/RecT或Redα/β介導(dǎo)的同源重組反應(yīng)來(lái)改變。透過(guò)同源重組反應(yīng)來(lái)將線性DNA片段插入環(huán)狀分子，替換了環(huán)狀DNA分子中的兩側(cè)序列與相應(yīng)序列。

在第三和第四段所描述的同源重組反應(yīng)，分別產(chǎn)生了包含人類(lèi)Cε編碼序列和Cκ編碼序列修飾過(guò)的小鼠BAC克隆株之轉(zhuǎn)殖基因。接著每個(gè)轉(zhuǎn)殖基因透過(guò)電穿孔導(dǎo)入小鼠品系C57BL/6的胚胎干細(xì)胞，當(dāng)中轉(zhuǎn)殖基因和相應(yīng)的內(nèi)源基因位置發(fā)生同源重組反應(yīng)，接著含有重組成功的轉(zhuǎn)殖基因的干細(xì)胞株注射到C57BL/6胚泡，隨后轉(zhuǎn)移到C57BL/6J-C2J假性懷孕小鼠子宮中，胚胎隨后發(fā)育成嵌合體小鼠，接著如上面列出的標(biāo)準(zhǔn)程序監(jiān)控，來(lái)產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)殖小鼠。

帶有人類(lèi)Cγ1編碼區(qū)取代小鼠Cε編碼區(qū)和那些帶有人類(lèi)Cκ編碼區(qū)取代小鼠Cκ編碼區(qū)的基因轉(zhuǎn)殖小鼠接著交配來(lái)產(chǎn)生帶有兩條替換各自的內(nèi)源性編碼序列的基因轉(zhuǎn)殖小鼠。產(chǎn)生含有兩種轉(zhuǎn)殖基因的小鼠品系被用來(lái)生產(chǎn)抗原特異性人源化IgE和分泌抗原特異性人源化IgE的融合瘤。

五、含有抗原特異性人源化IgE抗血清和分泌抗原特異性人源化IgE之融合瘤的生產(chǎn)

使用如第四段所描述，源自交配的基因轉(zhuǎn)殖小鼠被用來(lái)產(chǎn)生抗原特異性人源化IgE和分泌抗原特異性人源化IgE的融合瘤。兩個(gè)產(chǎn)生特異性IgE的例子為：(i)抗原，如塵螨，和野草，牧草、樹(shù)或花粉，和(i i)蠕蟲(chóng)寄生蟲(chóng)，如Necator americanus(人類(lèi)鉤蟲(chóng))和Trichuris suis(豬鞭蟲(chóng))。

實(shí)施例

帶有重組潛力細(xì)菌人工染色體(BAC)之細(xì)菌與一個(gè)取代編碼小鼠Cγ1基因之原核篩選DNA序列組的制備

從BACPAC資源中心購(gòu)買(mǎi)帶有BAC RP24-258E20的細(xì)菌株，其含有編碼四個(gè)小鼠Cγ重鏈的基因外顯子(圖1A,圖2,序列a)，基因的取代是藉由使用Red/ET重組系統(tǒng)來(lái)完成。

為了制備帶有具重組潛力BAC的細(xì)菌，編碼介導(dǎo)同源性重組反應(yīng)所必需的酵素蛋白的pRed/ET質(zhì)體DNA被送進(jìn)帶有BAC的細(xì)菌。一個(gè)生長(zhǎng)在含有氯霉素與鏈霉素LB瓊脂之帶有BAC的單一菌落，被接種在1ml含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，30μl的菌液加到1.4ml含有抗生素的LB培養(yǎng)基，然后在37℃培養(yǎng)2小時(shí)；菌液放在冰上，然后以11,000rpm離心30秒來(lái)移除上清液，菌塊用1ml冰冷的10％甘油清洗與離心，接著去除上清液，菌塊溶在20～30μl冰冷10％甘油里，然后放在冰上。pRed/ET質(zhì)體DNA(20ng)加到菌液里做簡(jiǎn)單的混合，把混合物移到冰冷的1mm電穿孔容器，接著以1.8kV、200ohms、25μF、4.5～5ms電擊，這電穿孔條件使用在接下來(lái)的實(shí)施例。LB培養(yǎng)基(1ml)加到細(xì)菌里，然后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中；細(xì)菌在30℃培養(yǎng)70分鐘后，取100μl涂抹在含有氯霉素與四環(huán)霉素的LB瓊脂盤(pán)，此盤(pán)子在30℃培養(yǎng)過(guò)夜，讓帶有pRed/ET質(zhì)體DNA并具重組潛力的細(xì)菌可以生長(zhǎng)。

在帶有具重組潛力BAC的細(xì)菌中，編碼小鼠Cγ1基因被一個(gè)原核篩選DNA序列組所取代，其含有一個(gè)對(duì)鏈霉素敏感與卡那霉素具抗性的雜交rpsL-neo基因，用來(lái)篩選轉(zhuǎn)染后的細(xì)菌。一個(gè)帶有具重組潛力BAC的細(xì)菌之單一菌落，被接種在1ml含有氯霉素與四環(huán)霉素的LB培養(yǎng)基里。在30℃培養(yǎng)過(guò)夜后，取30μl菌液加到1ml含有抗生素的LB培養(yǎng)基里，接著在30℃培養(yǎng)2小時(shí)，于培養(yǎng)的細(xì)菌中加入最終濃度為10％的L-阿拉伯糖，并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)；將細(xì)菌放在冰上，然后以11,000rpm離心30秒來(lái)移除上清液，接著菌塊用1毫升冰的10％甘油洗過(guò)，再離心去除上清液；菌塊溶在20～30μl冰的10％甘油并放置在冰上。用聚合酶連鎖反應(yīng)(PCR)以特定引子來(lái)制備一段含有前后對(duì)應(yīng)于編碼小鼠Cγ1基因(SEQ ID NO:1)的內(nèi)含子序列的延伸端之DNA序列之50-bp雜交rpsL-neo基因(表一,引子G1_CH1-rpsL-neo+與G1_M2-rpsL-neo-)；純化后的DNA(100-200ng)加進(jìn)懸浮菌液并快速混合，混合物再移至冰的1mm電穿孔容器中；電擊后加入1ml不含抗生素LB培養(yǎng)基，接著移至培養(yǎng)容器中；細(xì)菌在37℃培養(yǎng)70分鐘后，取100μl涂在含有氯霉素、卡那霉素與四環(huán)霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基盤(pán)，在30℃培養(yǎng)過(guò)夜后，長(zhǎng)出的菌落以特定引子(表二,引子G1_CH1-up-sc+與rpsL_sc-)用菌落PCR篩選帶有插入rpsL-neo基因的BAC之細(xì)菌，確認(rèn)后的菌株培養(yǎng)在在30℃含有抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基盤(pán)過(guò)夜。

表一

表二

二、重組反應(yīng)用之帶有編碼人類(lèi)Cε基因之DNA片段與編碼人類(lèi)Cε基因嵌入之BAC的建構(gòu)

使用PCR與DNA選殖技術(shù)來(lái)制備一段含有編碼小鼠Cγ1之5’和3’延伸端之編碼人類(lèi)Cε基因(SEQ ID NO:2)之DNA片段。建構(gòu)DNA片段的步驟顯示于圖1B，帶有限制酶切位、用以擴(kuò)增編碼小鼠Cγ1與人類(lèi)Cε基因的引子，陳列于表一。BAC RP24-258E20當(dāng)作以引子EcoR-mIGHG1-2kInt+/Cla-mIGHG1-CH1Int-與Sac_mIGHG1m2-Int+/Xho_mIGHG1polyA-(表一)來(lái)擴(kuò)增小鼠Cγ1各別的5’與3’延伸端的DNA模板。從人類(lèi)IgE骨髓瘤細(xì)胞SKO-007分離出來(lái)當(dāng)作模板的基因組DNA，以引子Cla-hIGHE-CH1Ex+和hIGHE_me2Int-(表一)來(lái)擴(kuò)增人類(lèi)Cε基因，每個(gè)擴(kuò)增的DNA片段都與TA載體(Real Biotech,Taiwan)連接來(lái)確認(rèn)序列與質(zhì)體DNA的制備。簡(jiǎn)言之，自質(zhì)體DNA以EcoRI與ClaI限制酶(New England Biolabs,MA)消化完后純化得到之5’延伸端的DNA片段，與以相同限制酶消化人類(lèi)Cε基因質(zhì)體DNA片段連接；得到的質(zhì)體DNA里的ClaI反應(yīng)序列，再以每個(gè)方向不含ClaI反應(yīng)序列的重迭引子，以引子mIgG1Int+hIGHEM2-Cla-del+與mIgG1Int+hIGHEM2-Cla-del-(表一)來(lái)用PCR來(lái)擴(kuò)增質(zhì)體DNA，進(jìn)一步去除ClaI反應(yīng)序列。擴(kuò)增的線性DNA片段被送到一個(gè)具轉(zhuǎn)形能力的細(xì)菌宿主，以產(chǎn)生一個(gè)環(huán)狀質(zhì)體DNA。帶有5’延伸端之人類(lèi)Cε編碼基因的DNA片段，以EcoRI和SacII限制酶(New England Biolabs)消化，并接入用相同酶消化過(guò)之3'延伸端的質(zhì)體DNA。人類(lèi)Cε編碼基因與延伸端的DNA片段，則透過(guò)使用EcoRI和XhoI限制酶(New England Biolabs)消化接合后的質(zhì)體DNA來(lái)制備。SacII、EcoRI和XhoⅠ反應(yīng)序列是存在于人類(lèi)Cε基因基因組序列和小鼠Cγ1延伸端中。

在嵌入之BAC中的rpsL-neo基因進(jìn)一步被編碼人類(lèi)Cε基因取代。一個(gè)帶有rpsL-neo基因嵌入之BAC的單一菌落接種在1ml含有氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素之LB培養(yǎng)基，在30℃下培養(yǎng)過(guò)夜后，將30μl培養(yǎng)菌液加入到1.4ml含抗生素的LB培養(yǎng)基，接著在30℃下培養(yǎng)2小時(shí)；加入最終濃度為10％的L-阿拉伯糖，然后在37℃培養(yǎng)1小時(shí)，隨后將細(xì)菌置于冰上，接著以11,000rpm離心30秒來(lái)除去上清液，菌塊用1ml冰冷的10％甘油洗滌，然后再次離心除去上清液。菌塊再溶于20-30μl冰冷的10％甘油中并置于冰上，純化后的人類(lèi)Cε DNA片段(100-200ng)加入到菌液里并快速混合，把混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)冷卻的1mm電穿孔容器中，接著加入LB培養(yǎng)基(1ml)到被電擊過(guò)的菌液里，隨后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)容器中；將細(xì)菌在37℃培養(yǎng)70分鐘，接著取100μl培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌，涂抹在含有氯霉素和鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，讓培養(yǎng)皿在30℃放過(guò)夜，生長(zhǎng)的菌落用PCR以特定的引子(表二中，引子G1_CH1up-SC+與hIGHE-CH1-)來(lái)進(jìn)行篩選，辨別帶有人類(lèi)Cε基因嵌入BAC的細(xì)菌(圖2，序列b)，確認(rèn)的菌株被接種到含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基盤(pán)上并在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜。

三、用于ES細(xì)胞內(nèi)基因標(biāo)定之新霉素插入的人類(lèi)Cε基因嵌入之BAC的構(gòu)建

把原核/真核新霉素表達(dá)序列組(SEQID NO：3)插入編碼小鼠Cγ1基因的3'延伸端，以用來(lái)篩選新霉素抗性之人類(lèi)Cε基因嵌入ES細(xì)胞。一條兩側(cè)為編碼小鼠Cγ1基因的3'延伸端50-bp DNA序列之序列組的DNA片段，藉由PCR以特定引子(表一中，引子G1_M2_5h-NEO+和G1_M2_5h-neo-)來(lái)制備。一個(gè)帶有編碼人類(lèi)Cε基因嵌入之BAC的單一菌落被接種在含有氯霉素與鏈霉素之1ml LB培養(yǎng)基里，并在30℃培養(yǎng)過(guò)夜；培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌(30μl)加入到含有抗生素1.4ml LB培養(yǎng)基，并持續(xù)在30℃培養(yǎng)2小時(shí)；加入最后濃度為10％的L-阿拉伯糖，接著在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。把培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌置于冰上，然后以11,000rpm離心30秒除去上清液，菌塊用1ml冰冷的10％甘油洗滌，再次離心去除上清液。菌塊再溶于20-30μl冰冷的10％甘油中并置于冰上，純化后的PCR產(chǎn)物(100-200ng)加入到懸浮菌液里并快速混合，混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)冷卻的1mm電穿孔容器來(lái)做電擊，接著加入LB培養(yǎng)基(1ml)到被電擊過(guò)的菌液里，隨后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)70分鐘，接著取100μl培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌，涂抹到含氯霉素和卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿里，讓培養(yǎng)皿放在37℃過(guò)夜，生長(zhǎng)的菌落用PCR以特定的引子(表二，引子G1_M2pA2k-SC+和pgk_neo-)來(lái)進(jìn)行篩選，辨別帶有人類(lèi)Cε基因嵌入之BAC的細(xì)菌(圖2，序列c)，確認(rèn)的細(xì)菌進(jìn)一步被增殖來(lái)分離用于ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染之帶有基因嵌入的BAC DNA。

四、帶有新霉素插入之人類(lèi)κ鏈外顯子嵌入之BAC的建構(gòu)

自BACPAC資源中心購(gòu)買(mǎi)含有編碼小鼠κ鏈外顯子的BAC DNA RP23-5905(圖1A和圖3，序列d)。基因置換的步驟依照使用以Red/ET為基礎(chǔ)的組重反應(yīng)系統(tǒng)。小鼠κ鏈外顯子首先被表達(dá)rpsL-neo序列組(SEQID NO：4)取代，透過(guò)在實(shí)施例1中所述的步驟，含有BAC RP23-5905之細(xì)菌被制作成帶有pRed/ET質(zhì)體DNA，同時(shí)被用來(lái)進(jìn)行電穿孔。一條兩側(cè)帶有對(duì)應(yīng)于小鼠κ鏈外顯子兩側(cè)50-bp DNA序列之內(nèi)含子序列的表達(dá)rpsL-neo序列組之DNA片段，，藉由PCR以特定引子(表一，引子mIGKC-rpsL-neo+和mIGKC-rpsL-neo-)來(lái)制備；純化的rpsL-neo表達(dá)序列組(100-200ng)的PCR產(chǎn)物加入到細(xì)菌中，接著進(jìn)行電穿孔。LB培養(yǎng)基(1ml)加入電擊過(guò)的細(xì)菌并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中，把細(xì)菌在37℃培養(yǎng)70分鐘，取100μl培養(yǎng)過(guò)的菌液至一個(gè)含氯霉素、卡那霉素和四環(huán)素的LB瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，讓培養(yǎng)皿在30℃放過(guò)夜，生長(zhǎng)的菌落藉由PCR以特定引子(表二，引子m-hIGKC-SEP+和mIGKC-Int1-)進(jìn)行了篩選，以確認(rèn)帶有rpsL-neo嵌入之BAC的細(xì)菌，確認(rèn)的細(xì)菌培養(yǎng)于含抗生素的LB培養(yǎng)基，并在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜以供后續(xù)步驟中使用。

一條人類(lèi)Cκ鏈外顯子之DNA片段，其兩側(cè)含有對(duì)應(yīng)于小鼠κ鏈外顯子兩側(cè)之內(nèi)含子序列的50-bp DNA片段(SEQ ID NO：5)，藉由PCR以特定引子(表一中，引子mIGKChm-hIGKC+和mIGKChm-hIGKC-)來(lái)制備。一個(gè)從健康捐血者的血液中分離出的人類(lèi)基因組DNA，被用于作為PCR中，擴(kuò)增人類(lèi)Cκ鏈外顯子的DNA模板。帶有rpsL-neo嵌入之BAC的培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌與類(lèi)Cκ鏈外顯子的純化PCR產(chǎn)物(100-200ng)被制備用來(lái)做電穿孔；LB培養(yǎng)基(1ml)加入到電擊過(guò)的細(xì)菌，并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中。細(xì)菌在37℃培養(yǎng)70分鐘，取100μl培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌涂抹到含有氯霉素、鏈霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上。把培養(yǎng)皿放在30℃過(guò)夜，生長(zhǎng)的菌落藉由PCR以特定引子(表二中，引子mIGKC-Int+和rpsL_sc-)進(jìn)行了篩選，來(lái)確認(rèn)帶有人類(lèi)Cκ鏈外顯子BAC(圖3中，序列e)之細(xì)菌，確認(rèn)的細(xì)菌培養(yǎng)于含抗生素的LB培養(yǎng)基并在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜，以供后續(xù)步驟中使用。

一段兩側(cè)有l(wèi)oxP與表達(dá)新霉素序列組之DNA片段，其兩側(cè)含有對(duì)應(yīng)于小鼠Cκ鏈外顯子3'延伸端50-bp內(nèi)含子DNA序列(SEQ ID NO：6)，藉由PCR以特定引子(表一中，引子mIGKCInt5hT7loxP+和mIGKCInt5hSP6loxP-)來(lái)制備。帶有人類(lèi)Cκ鏈外顯子嵌入之BAC的培養(yǎng)過(guò)的細(xì)菌被制備用來(lái)與表達(dá)新霉素序列組之純化的PCR產(chǎn)物(100-200ng)進(jìn)行電穿孔。LB培養(yǎng)基(1ml)加入到電擊過(guò)的細(xì)菌并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)容器中；把細(xì)菌在37℃培養(yǎng)70分鐘，取100μl培養(yǎng)細(xì)菌涂抹到含有氯霉素和卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)皿上，讓培養(yǎng)皿在37℃放過(guò)夜，生長(zhǎng)的菌落藉由PCR以特定引子(表二，mIGKC-Neo+和pgk_neo-)來(lái)篩選，以確認(rèn)帶有人類(lèi)Cκ鏈外顯子嵌入之BAC(圖3中，序列f)的細(xì)菌，確認(rèn)的細(xì)菌被進(jìn)一步增殖來(lái)分離帶有基因嵌入之BAC DNA，以供ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染使用。

五、基因轉(zhuǎn)殖小鼠的生產(chǎn)與基因型鑒定

基因嵌入之ES細(xì)胞的制備與植入ES細(xì)胞于假孕雌性小鼠是依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。簡(jiǎn)言之，嵌入之BAC DNA先透過(guò)NruI和NotI限制酶(New England Biolabs)消化，并透過(guò)電穿孔遞送至源自C57BL/6小鼠的ES細(xì)胞，隨后培養(yǎng)在含有遺傳霉素的培養(yǎng)基中。經(jīng)過(guò)藥物篩選后，每個(gè)抗藥性的ES細(xì)胞用PCR來(lái)驗(yàn)證，以獲得帶有DNA置換在目標(biāo)基因之正確部位的細(xì)胞。該基因嵌入之ES細(xì)胞轉(zhuǎn)移至囊胚，接著注入到假孕的C57BL/6J-C2J小鼠(The Jackson Laboratory)；后代被飼育和交配，以產(chǎn)生帶有兩條轉(zhuǎn)殖基因的同型結(jié)合的對(duì)偶基因(分別為人類(lèi)Cε基因和人類(lèi)Cκ基因)的小鼠。帶有嵌入同型結(jié)合的對(duì)偶基因的小鼠進(jìn)一步與B6.FVB-Tg(EIIa-cre)C5379Lmgd/J小鼠(The Jackson Laboratory)交配，以去除兩側(cè)帶有l(wèi)oxP的新霉素序列組。人類(lèi)Cε基因嵌入(hCε^+/+)與人類(lèi)Cκ基因嵌入(hCκ^+/+)小鼠進(jìn)一步交配，以產(chǎn)生帶有兩種基因(hCε^+/+hCκ^+/+)的雙套同型結(jié)合的對(duì)偶基因之人源化IgE小鼠，并標(biāo)示為HεκKI小鼠。透過(guò)帶有hCε^+/-hCκ^+/+的小鼠近親交配，同窩小鼠會(huì)帶有不同對(duì)偶基因組合，如hCε^-/-hCκ^+/+、hCε^+/-hCκ^+/+和hCε^+/+hCκ^+/+。

為了探究重鏈或輕鏈基因轉(zhuǎn)殖小鼠的基因型特征，使用EasyPure Genomic DNA mini kit(Bioman Scientific,Taiwan)并依照使用手冊(cè)所和提供的步驟，自一塊小鼠尾巴組織中純化出基因組DNA；純化的DNA用PCR以引子p1、p2和p3(圖4A和表二)來(lái)針對(duì)hCε嵌入之小鼠，并以p4、p5和p6(圖4B和表二)來(lái)針對(duì)hCκ嵌入之小鼠，以每個(gè)引子對(duì)所擴(kuò)增的DNA大小顯示于表二。重鏈轉(zhuǎn)殖基因含有同型結(jié)合的hCε^+/+、異型合子的hCε^+/-mCγ1^+/-或原生型的mCγ1^+/+的基因型，在圖4C中分別標(biāo)示為hCε/hCε、hCε/mCγ1與mCγ1/mCγ1，并透過(guò)DNA電泳顯現(xiàn)在一個(gè)瓊脂糖凝膠上(圖4C)。輕鏈轉(zhuǎn)殖基因含有同型結(jié)合的hCκ^+/+、異型結(jié)合的hCκ^+/-mCκ^+/-或原生型的mCκ^+/+的基因型，在圖4C中分別標(biāo)示為hCκ/hCκ、hCκ/mCκ與mCκ/mCκ，亦顯現(xiàn)在相同的DNA瓊脂糖凝膠上(圖4C)。

重鏈基因轉(zhuǎn)殖小鼠的基因組DNA進(jìn)一步用南方墨點(diǎn)法分析確認(rèn)。5μg的基因組DNA用BamHI限制酶(New England Biolabs)消化過(guò)夜，消化過(guò)的基因組DNA載入一個(gè)0.8％瓊脂糖凝膠并以50伏特電泳1.5小時(shí)，接著浸沒(méi)在和變性溶液(0.5M NaOH和1.5M NaCl)，溫和搖動(dòng)15分鐘兩次。把凝膠用蒸餾水沖洗并浸入中和溶液(0.5M Tris-HCl，pH 7.5和1.5M NaCl)中，溫和搖動(dòng)15分鐘兩次，隨后在20×SSC溶液(3M NaCl和300mM Trisodium citrate)搖動(dòng)超過(guò)10分鐘來(lái)平衡凝膠。把一塊3MM紙(Sigma-Aldrich)浸泡在充滿20×SSC溶液的容器里，讓瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到3MM，紙接著迭上一片尼龍膜(Roche Diagnostics)。一張以2×SSC溶液潤(rùn)洗后的3MM紙放置在膜上，并在3MM紙放上一迭擦手紙，以一重物壓在頂端；轉(zhuǎn)印16-24小時(shí)后，把膜放在烘箱中以80℃烘烤2小時(shí)，以供后續(xù)的用途。

藉由GoTaq Flexi DNA polymerase(Promega)及DIG DNA Labeling Mix(Roche)，在PCR以引子對(duì)mg1probe+/mg1probe-(表三)來(lái)制備地高辛(dig)標(biāo)記的雜交探針(圖4A和SEQ ID NO：7)。含有dig標(biāo)記的探針的PCR產(chǎn)物(2μl)稀釋在2ml含有50μl無(wú)菌蒸餾水的管子中，并在100℃沸騰5分鐘，該管子立即在冰上冷卻，加入1.75ml DIG Easy Hyb hybridization buffers(Roche)到管子中，混合后，溶液與膜靜置在一個(gè)袋子里，將袋子置放在65℃烘箱中進(jìn)行16-24小時(shí)雜交；將膜以含有0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS，Sigma-Aldrich)的2×SSC溶液洗滌兩次，并以溫的(65℃)含有0.1％SDS之0.5×SSC溶液輕輕搖動(dòng)15分鐘并洗滌兩次；膜冷卻到室溫后，膜以DIG Wash and Block Buffer Set(Roche)中的緩沖液進(jìn)行洗滌與阻塞，Anti-DIG-AP Fab fragment(Roche)以10,000倍稀釋于阻塞緩沖液，并與膜培養(yǎng)30分鐘。以洗滌緩沖液洗滌兩次后，將膜以DIG Wash and Block Buffer Set(Roche)中的偵測(cè)緩沖液輕輕搖動(dòng)平衡35分鐘；除去偵測(cè)緩沖液后，將膜與0.5ml的CDP-star化學(xué)發(fā)光受質(zhì)(Roche)培養(yǎng)5分鐘，并用LAS-3000Imaging system(Fujifilm,Japan)偵測(cè)冷光信號(hào)。結(jié)果顯示，探針對(duì)于原生型對(duì)偶基因產(chǎn)生了一條1.2kb的帶，而對(duì)于人類(lèi)Cε嵌入的對(duì)偶基因產(chǎn)生一條3.7kb的帶(圖4D)。

表三

六、用來(lái)偵測(cè)基因轉(zhuǎn)殖小鼠脾臟里人類(lèi)εmRNA的實(shí)時(shí)RT-PCR

藉由使用PureLink RNA Mini Kit(Life Technologies,CA)來(lái)制備分別帶有人類(lèi)Cκ基因的hCε/hCε、hCε/mCγ1和mCγ1/mCγ1三種基因轉(zhuǎn)殖小鼠之脾臟細(xì)胞的總RNA。純化的總RNA(5μg)用于以Superscript III reverse transcriptase kit(Life Technologies)的cDNA制備。cDNA(100ng)被用于每一個(gè)用Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,CA)的定量PCR(qPCR)的反應(yīng)。反應(yīng)的進(jìn)行和訊號(hào)的分析是用StepOnePlus^TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems)。用來(lái)擴(kuò)增小鼠IgG1(RQ-CG1+/RQ-Cg1-)和人類(lèi)IgE(RQ-Ce+/RQ-Ce-)的恒定區(qū)以及小鼠β-肌動(dòng)蛋白(RQ-BA+/RQ-BA-)的引子對(duì)陳列于表三中。用來(lái)測(cè)量擴(kuò)增的小鼠IgG1和人類(lèi)IgE DNA產(chǎn)物之產(chǎn)量的Green信號(hào)，以小鼠β-肌動(dòng)蛋白的信號(hào)在平行反應(yīng)中進(jìn)行常態(tài)化，每個(gè)小鼠cDNA進(jìn)行三重復(fù)的qPCR反應(yīng)，且每種基因型研究三個(gè)小鼠脾臟。結(jié)果顯示，在hCε/hCε小鼠偵測(cè)不到γ1mRNA(圖5A)，且在mCγ1/mCγ1小鼠中不表達(dá)人類(lèi)ε mRNA(圖5B)；在hCε/hCε小鼠中表達(dá)人類(lèi)ε mRNA的量是hCε/mCγ1小鼠的1.8倍之多(圖5B)，在mCγ1/mCγ1小鼠的γ1mRNA表達(dá)量為hCε/mCγ1小鼠的2.1倍之多(圖5A)

七、用來(lái)偵測(cè)基因轉(zhuǎn)殖小鼠脾臟中分泌人源化IgE之B細(xì)胞的ELISPOT

在三種基因型(hCε/hCε、hCε/mCγ1和mCγ1/mCγ1)的每一組中，三只小鼠(7-8周大)在第1天、22天與第36天，經(jīng)皮下以50μg的Gold(Sigma-Aldrich)乳化之木瓜酵素免疫三次，在第50天、52天和54天犧牲小鼠來(lái)做三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，而單一脾臟細(xì)胞使用磨砂玻璃片磨碎脾臟來(lái)制備；脾臟細(xì)胞用RPMI培養(yǎng)基(Life Technologies)洗滌兩次并懸浮于添加10％胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈霉素(Life Technologies)之RPMI培養(yǎng)基中。為了準(zhǔn)備ELISPOT分析的微孔板，MultiScreenHTS盤(pán)(Millipore,MA)每個(gè)孔洞分別浸潤(rùn)15μl之35％乙醇1分鐘，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，接著每個(gè)孔洞表面覆蓋1μg之山羊抗小鼠IgG1多株抗體(Southern Biotech)、山羊抗小鼠IgG-Fc多株抗體(Bethyl Laboratories,TX)、山羊抗小鼠IgE多株抗體(BETHYL Laboratories)或山羊抗人類(lèi)IgE多株抗體(BETHYL Laboratories)于100μl PBS中放4℃過(guò)夜。盤(pán)子以PBS洗滌三次，并用200μl添加10％FBS之RPMI培養(yǎng)基在37℃阻塞1小時(shí)；以PBS洗滌盤(pán)子三次后，100μl細(xì)胞懸浮液(5×10⁵個(gè)脾臟細(xì)胞)被分注到各個(gè)孔洞中，脾臟細(xì)胞在培養(yǎng)箱中以37℃培養(yǎng)16-24小時(shí)，盤(pán)子以含有0.1％Tween 20(Sigma-Aldrich)的PBS加洗滌6次，并用1％牛血清白蛋白(BSA)/PBS阻塞1小時(shí)。經(jīng)過(guò)PBS洗滌三次后，100μl的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合之山羊抗小鼠IgG1多株抗體(Southern Biotech)、山羊抗小鼠IgG-Fc多株抗體(BETHYL Laboratories)、山羊抗小鼠IgE多株抗體(BETHYL Laboratories)或山羊抗人類(lèi)IgE多株抗體(BETHYL Laboratories)稀釋10,000倍于1％BSA/PBS，再分別注入到每一個(gè)對(duì)應(yīng)的孔洞；在室溫培養(yǎng)2小時(shí)后并以PBS洗滌8次，每個(gè)孔洞加入100μl的AEC溶液(Life Technologies)，并在室溫黑暗中培養(yǎng)30分鐘。以蒸餾水洗滌5次后，使用AID iSpot FLUOROSPOT讀數(shù)器系統(tǒng)(AID Diagnostika GmbH,Germany)進(jìn)行微孔掃描和斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，在hCε/hCε小鼠脾臟中偵測(cè)不到小鼠分泌IgG1之B細(xì)胞，其中分泌小鼠IgG之總B細(xì)胞數(shù)目在hCε/mCγ1和mCγ1/mCγ1小鼠中是相當(dāng)?shù)?圖6A)；在hCε/hCε小鼠脾臟中，分泌人源化IgE之B細(xì)胞數(shù)量比分泌小鼠IgG之B細(xì)胞低的許多(圖6A和6B)；幾顆分泌人源化IgE之B細(xì)胞與分泌小鼠IgE之B細(xì)胞，在hCε/hCε或hCε/mCγ1小鼠的三個(gè)脾臟中可被偵測(cè)到(圖6B)。

八、在木瓜酵素免疫之基因轉(zhuǎn)殖小鼠中不同Ig異構(gòu)型之血清滴定量的測(cè)量

木瓜酵素是一種蛋白酶且存在于木瓜樹(shù)的乳膠里，在乳膠敏感的人里，它也是一個(gè)過(guò)敏性成分。為了研究在3種基因轉(zhuǎn)殖小鼠經(jīng)木瓜酵素免疫的抗體反應(yīng)，在實(shí)施例中使用ELISA來(lái)測(cè)量不同IgG異構(gòu)型的血清濃度；每只小鼠以50μg的木瓜酵素(Sigma-Aldrich)與Gold佐劑(Sigma-Aldrich)進(jìn)行乳化并注射到小鼠皮下，第一次注射經(jīng)四周后再進(jìn)行第二次注射，血液取樣在第0周(免疫前)、第2周、第4周、和第6周；人源化IgE、小鼠IgE和小鼠IgM的濃度透過(guò)使用ELISA定量組(BETHYL Laboratories)來(lái)測(cè)量，而步驟是根據(jù)使用手冊(cè)來(lái)進(jìn)行；小鼠IgG1、IgG2b、IgG2c和IgG3的濃度是透過(guò)使用山羊抗Ig、異構(gòu)型特異性多株抗體和HRP結(jié)合之山羊抗Ig異構(gòu)型特異性多株抗體系統(tǒng)(SouthernBiotech)來(lái)測(cè)量。小鼠參考血清(BETHYL Laboratories)被用來(lái)作為每只小鼠IgG1、IgG2b、IgG2c和IgG3校正標(biāo)準(zhǔn)，ELISA技術(shù)是依照標(biāo)準(zhǔn)步驟；簡(jiǎn)言之，抗Ig異構(gòu)型特異性多株抗體稀釋在覆蓋緩沖液(碳酸氫鈉，pH值9.6)中并加入到聚苯乙烯孔洞中；在4℃培養(yǎng)過(guò)夜后，孔洞以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌并用1％的BSA/PBS來(lái)阻塞；在室溫培養(yǎng)1小時(shí)后，孔洞以PBS洗滌3次并把稀釋的小鼠血清加入到孔洞中，以測(cè)量不同的Ig異構(gòu)型的濃度；小鼠血清以4倍稀釋于阻塞緩沖液中來(lái)測(cè)量人類(lèi)和小鼠IgE，并以4000倍稀釋用于測(cè)量小鼠IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c和IgG3濃度；培養(yǎng)2小時(shí)并以PBS洗滌三次后，HRP結(jié)合之山羊抗Ig異構(gòu)型特異性抗體在阻塞緩沖液中稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛炔⑻砑拥娇锥粗信囵B(yǎng)1小時(shí)，以PBS洗滌6次后，將HRP受質(zhì)NeA-Blue(Clinical Science Products,MA)加入到孔洞中呈色，并以Model 680microplate讀數(shù)器(BioRad Laboratories,CA)做比色的測(cè)量。

結(jié)果顯示，每一種Ig異構(gòu)型在3種基因轉(zhuǎn)殖小鼠的血清含量在木瓜酵素免疫之后皆增加(圖7)，免疫過(guò)的hCε/mCγ1小鼠IgG1含量與免疫過(guò)的mCγ1/mCγ1小鼠相當(dāng)(圖7)；免疫過(guò)的hCε/mCγ1小鼠的人源化IgE含量為免疫過(guò)的hCε/hCε小鼠的一半(圖7)；在hCε/hCε小鼠中，木瓜蛋白酶免疫前或后，人源化IgE的血清含量約小鼠IgE的10倍高(圖7)。

九、以免疫過(guò)的HεκKI小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行明確的蛋白質(zhì)成分特異性人源化IgE融合瘤的生產(chǎn)

木瓜酵素是乳膠產(chǎn)品里的過(guò)敏性蛋白質(zhì)成分之一，用于制備明確的蛋白質(zhì)成分特異性人源化IgE融合瘤。木瓜酵素特異性的人源化單株IgE的制備，是透過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)免疫步驟和標(biāo)準(zhǔn)的融合瘤技術(shù)。簡(jiǎn)言之，7-8周大的HεκKI小鼠，以50μg的木瓜酵素(Sigma-Aldrich)與Freund’s完全佐劑(Sigma-Aldrich)乳化后于皮下免疫；3周后，小鼠以木瓜酵素與Freund’s不完全佐劑(Sigma-Aldrich)乳化后，以2周的間隔注射皮下兩次，小鼠犧牲來(lái)制備融合瘤前3天，接著以100μg木瓜酵素注射腹腔；為制備融合瘤，透過(guò)使用50％(w/v)聚乙二醇1500(Roche)，自免疫后的小鼠中分離的脾臟細(xì)胞并與小鼠FO骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；融合后的細(xì)胞培養(yǎng)在次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷選擇培養(yǎng)基10-12天，而融合瘤的培養(yǎng)上清液以ELISA來(lái)篩選，以確認(rèn)木瓜酵素特異性人源化IgE融合瘤。為準(zhǔn)備ELISA，稀釋在覆蓋緩沖液中的木瓜酵素(10μg/ml)加入到聚苯乙烯孔洞中并在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)；以PBS洗滌并用1％BSA阻塞1小時(shí)后，將培養(yǎng)上清液加入到孔洞中，然后在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)；以PBS洗滌后，HRP結(jié)合之山羊抗人類(lèi)IgE(1：10000稀釋?zhuān)珺ETHYL Laboratories)加入到孔洞中并在室溫下放置1小時(shí)；經(jīng)過(guò)大量的洗滌后，HRP受基質(zhì)加到孔洞中來(lái)做顏色的顯影和比色的測(cè)量。三個(gè)生產(chǎn)人類(lèi)ε恒定區(qū)的重鏈之木瓜酵素特異性融合瘤，標(biāo)示為1C6、6D10和34C2，被鑒定出來(lái)(圖9A)；這三個(gè)融合瘤亦分泌含有人類(lèi)κ恒定區(qū)而非小鼠λ恒定區(qū)的輕鏈之單株抗體(圖9B)。

為純化人類(lèi)或人源化IgE抗體，一個(gè)特異于人類(lèi)IgE的人源化IgG1單株抗體Omalizumab(Norvatis)被連結(jié)到CNBr活化的Sepharose 4快速流動(dòng)樹(shù)脂(GE Healthcare)上，連結(jié)步驟根據(jù)使用手冊(cè)進(jìn)行；Omalizumab樹(shù)脂被用來(lái)在培養(yǎng)液中純化人類(lèi)或人源化IgE單株抗體；簡(jiǎn)言之，500ml的培養(yǎng)液通過(guò)1ml的Omalizumab樹(shù)脂，樹(shù)脂以10ml的PBS洗滌與以5ml的洗提緩沖液(0.1M甘胺酸,pH 3.0)洗提，接著以0.5ml Tris緩沖液(1M Tris,pH 9.0)中和；純化之抗體的緩沖液以Amicon Ultra-15(Millipore)交換至PBS；一個(gè)人類(lèi)IgE單株抗也從U266骨髓瘤細(xì)胞(ATCC)的培養(yǎng)液中純化出來(lái)，純化的U266IgE和3個(gè)人源化IgE單株抗體的大小以SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)分析(圖9C)。

十、以明確的蛋白質(zhì)成分特異性人源化IgE mAbs進(jìn)行RBL-SX38的致敏作用與β-hexosaminidase釋放試驗(yàn)

特異于卵清蛋白(Sigma-Aldrich)的人源化IgE融合瘤透過(guò)依照前面實(shí)施例描述的步驟來(lái)制備和純化。使用表達(dá)人類(lèi)FcεRI之α、β和γ鏈的大鼠嗜堿性血癌細(xì)胞(RBL SX-38，Dr.Jean P.Kinet饋贈(zèng))，藉由細(xì)胞脫顆粒作用后測(cè)量釋放的β-hexosaminidase活性，來(lái)測(cè)試IgE致敏作用與受體活化作用。RBL SX-38細(xì)胞以200μl的培養(yǎng)基(1x 10⁵細(xì)胞/孔)播種在一個(gè)96孔盤(pán)中并在37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜；隔天，培養(yǎng)基以300x g下離心5分鐘來(lái)移除后，細(xì)胞懸浮于100μl含有1μg/ml之純化的U266IgE或其中一種人源化IgE mAbs的預(yù)熱培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，細(xì)胞以200μl的Tyrode’s緩沖液(135mM氯化鈉、5mM氯化鉀、5.6mM葡萄糖、1.8mM氯化鈣、1mM氯化鎂、20mM HEPES和0.5mg/ml BSA、pH7.3)洗滌，接著加入100μl含有不同濃度的卵清蛋白或木瓜酵素的預(yù)熱Tyrode’s緩沖液來(lái)測(cè)試IgE致敏的FcεRI之活化作用；山羊總IgG用來(lái)作為非活化抗體的陰性對(duì)照組，且使用山羊抗人類(lèi)IgE多株抗體(BETHYL Laboratories)來(lái)活化IgE致敏的FcεRI；在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，盤(pán)子在300x g下離心10分鐘，將各孔洞中50μl的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)96孔OptiPlate^TM(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)中；等體積(50μl)的試驗(yàn)溶液{0.1M citric acid with 80μM of 4-MUG(4-methyl-umbelliferyl-N-acetyl-β-d-glucosaminide),pH 4.5}加入到每個(gè)孔洞中來(lái)進(jìn)行β-hexosaminidase的酵素反應(yīng)；盤(pán)子短暫地?fù)u動(dòng)并在37℃與8％CO₂下培養(yǎng)1小時(shí)，加入100μl甘氨酸緩沖液(0.2M甘氨酸，0.2M氯化鈉，pH值10.7)到孔洞中來(lái)終止反應(yīng)，每個(gè)孔洞的熒光強(qiáng)度藉由使用Victor 3熒光讀數(shù)器(Perkin-Elmer)，在激發(fā)355nm、放射460nm的波長(zhǎng)來(lái)測(cè)量；以1％Triton X-100溶解細(xì)胞的β-hexosaminidase活性當(dāng)作RBL SX-38細(xì)胞的最大限度釋放(100％)；僅以IgE mAbs致敏的RBL SX-38細(xì)胞來(lái)測(cè)量自發(fā)性釋放；β-hexosaminidase釋放的百分率由下列方程式來(lái)計(jì)算：[100×(實(shí)驗(yàn)性釋放-自發(fā)性釋放)/(最大限度釋放-自發(fā)性釋放)]。

結(jié)果顯示，如同人類(lèi)IgE控制組，人源化的IgE mAbs適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合至RBL SX-38細(xì)胞上人類(lèi)FcεRI，并有效地以抗人類(lèi)IgE多株抗體觸發(fā)β-hexosaminidase釋放(圖9)；木瓜酵素和卵清蛋白分別可以觸發(fā)木瓜酵素和卵清蛋白特異性人源化IgE mAbs致敏的RBL SX-38細(xì)胞之β-hexosaminidase釋放(圖9)，卵清蛋白特異性人源化IgE致敏的RBL SX-38細(xì)胞之β-hexosaminidase釋放的程度與加入的卵清蛋白的濃度呈正比(圖9)。

附圖說(shuō)明

圖1A：分別含有編碼四個(gè)小鼠免疫球蛋白Cγ鏈(RP24-258E20)和小鼠Cκ鏈(RP23-5905)基因外顯子的BAC克?。籉復(fù)制子提供一個(gè)BAC DNA的復(fù)制起點(diǎn)，而cmr是一個(gè)是氯霉素抗性基因。圖1B：構(gòu)建含有兩個(gè)小鼠Cγ1基因延伸端(每個(gè)延伸端～2000bp)之人類(lèi)Cε基因(～4000bp)之DNA片段的步驟。

圖2：編碼人類(lèi)Cε基因取代編碼小鼠免疫球蛋白Cγ1基因；一個(gè)新霉素抗性序列組(neo)插入在Cγ1膜外顯子的3'下游區(qū)。

圖3：編碼人類(lèi)Cκ基因取代編碼小鼠免疫球蛋白Cκ基因；一個(gè)新霉素抗性序列組(neo)插入在Cκ膜外顯子的3'下游區(qū)。

圖4A：用于研究人類(lèi)Cε鏈轉(zhuǎn)殖基因的引子和雜交探針；B：BamHI切位；Nt：NotI切位；S：SacII切位。圖 4B用于研究人類(lèi)Cκ鏈轉(zhuǎn)殖基因的引子；NR：NruI切位。圖4C：利用PCR進(jìn)行人類(lèi)Cε和Cκ鏈轉(zhuǎn)殖基因的基因分型。圖4D人類(lèi)Cε鏈轉(zhuǎn)殖基因的南方點(diǎn)墨法分析。

圖5A：用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量在三種基因型的小鼠脾臟中之小鼠Cγ1mRNA。圖5B：用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量在三種基因型的小鼠脾臟中之人類(lèi)CεmRNA。

圖6A：測(cè)量在三種基因型的小鼠脾臟中，分泌小鼠總IgG和IgG1的B細(xì)胞；MuIgG1：小鼠IgG1。圖6B：測(cè)量在三種基因型的小鼠脾臟中分泌人源化IgE和小鼠IgE的B細(xì)胞；HuIgE：人源化IgE；MuIgE：小鼠IgE。

圖7：利用ELISA在木瓜蛋白酶免疫后的三種基因型的小鼠中不同免疫球蛋白異構(gòu)型之血清量的測(cè)量。

圖8A：利用ELISA測(cè)量三個(gè)確認(rèn)的木瓜特異性人源化IgE單株抗體的結(jié)合活性。OVA：卵清蛋白；HSA：人血清白蛋白；BSA：牛血清白蛋白。圖8B：利用ELISA確認(rèn)三個(gè)人源化IgE單株抗體輕鏈的異構(gòu)型。圖8C：以12％聚丙烯酰胺凝膠分析三個(gè)經(jīng)純化的人源化IgE單株抗體。泳道M：標(biāo)記品；泳道1：由U266骨髓瘤細(xì)胞生產(chǎn)之人類(lèi)IgE單株抗體；泳道2：?jiǎn)沃昕贵w1C6；泳道3：?jiǎn)沃昕贵w15G10；泳道4：?jiǎn)沃昕贵w34C2；泳道5：人類(lèi)IgG多株抗體。

圖9：以人類(lèi)IgE和人源化IgE單株抗體致敏之RBL-SX38細(xì)胞之β-hexosaminidase釋放的測(cè)量；HuIgE：由U266骨髓瘤細(xì)胞生產(chǎn)的人類(lèi)IgE單株抗體；單株抗體1C6：木瓜蛋白酶特異性的人源化IgE；單株抗體8G9：卵清蛋白特異性的人源化IgE。

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